专利名称：一种含hipk2基因的重组质粒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组质粒，具体地，涉及一种含HIH(2 (同源结构域相互作用蛋白激酶2)基因的重组质粒。
背景技术：
11] !^ ; ^^2(homeodomain-interacting protein kinase 2, HIH(2)是定位于细胞核内的丝/苏氨酸蛋白激酶家族成员之一，它能与同源框类蛋白相互作用而广泛参与转录调控。HPK家族蛋白具有一个保守的激酶结构域和一个同源蛋白相互作用结构域，因其能够增强同源蛋白转录活性，故取名为同源结构域相互作用蛋白激酶，目前已知该激酶有3个亚型，分别为HIHQ、HIH(2、HIH(3，其中对HIPK2研究最多。HIPK2存在于不同生物体(如线虫、啮齿类动物和人类)，HIPK2在除神经组织外的正常人体组织中表达水平非常低，在脑、白细胞、辜丸、前列腺、卵巢和小肠组织中则几乎测不到，仅在心、 肌肉和肾脏相对较高表达。HIPK2基因定位于人类第7条染色体7q32-q34，小鼠染色体6B，全长15. 2kb，编码区序列长约3595bp。HIPK2从美丽线虫到人类高度保守，小鼠与人类之间氨基酸98%同源，有 L4kb、4· 5kb、7.8kb、llkb4个转录本，主要以111Λ为主，各种组织表达不尽相同。HIPK2含 1189个氨基酸，属于DYRK激酶家族，氨基端192-520位氨基酸残基为一个蛋白激酶基序， 583-798位为同源结构域相互作用结构域，839-934位为PEST区，梭基端富含酪氨酸和组氨酸结构域。HIPK2不仅与晚期胚胎发生、神经组织、视网膜发育及肌肉组织发育等密切相关， 还参与调控肿瘤信号传导通路，抑制癌基因的表达，诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管新生。目前研究发现，HIPK2抵制肿瘤发生主要通过以下几个方面(1)协同p53抑癌作用 HIPK2是细胞DNA损伤信号通路中包括p53在内的许多转录因子的关键调节因子，与p53共同定位于核小体内，并磷酸化P53的46位丝氨酸位点。HIPK2可通过p53依赖和非依赖两种方式对P53抑制蛋白MDM2的修饰或胞内移位而降低MDM2蛋白水平，增加p53基因转录活性。HIPK2也可以通过与p53的另一个抑制蛋白DAXX相互作用，阻止其与下游效应蛋白的结合，从而激活P53 Ser46的磷酸化，促进p53信号传导的传递。(2)阻滞Wnt/β-catenin 信号通路HIPK2作为同源结构域相互作用的蛋白激酶，对肿瘤细胞内Wnt/ii-catenin信号通路的调节发挥着重要作用。敲除内源性HIPK2后，可明显增加细胞内β-catenin的稳定性和胞内积聚量，促进细胞内Wnt靶基因的转录表达和细胞增殖，说明HIPK2是Wnt/ β -catenin通路的负调节因子。HIPK2过表达能明显下调肿瘤细胞内VEGF的mRNA水平和启动子活性，抑制肿瘤血管新生。(3)抑制缺氧信号传导肿瘤细胞在缺氧条件下应激产生大量缺氧反应基因，并调控涉及肿瘤能量代谢、血管生成、侵袭转移等下游靶基因的转录和表达。HIPK2可参与缺氧基因的调控，影响缺氧应答的上下游事件，是缺氧应答的重要调节蛋白。常氧条件下，HIPK2以组蛋白脱乙酰基酶1共阻遏复合物的形式与HIF-I α启动子结合，在转录水平抑制HIF-I α的表达及转录活性。ΗΙΡΚ2的过表达不仅能下调钴稳定的HIF-I α的蛋白和mRNA表达水平，同时也能抑制其随后的转录活性，恢复缺氧模拟条件下化疗药物凋亡诱导作用的能力，并使化疗药耐药肿瘤细胞重新致敏。(4)其他方面ΗΙΡΚ2 可以非Ρ53依赖的方式调节TGF-β诱导的JNK激活和凋亡信号通路，作为重要的调节因子参与了 JNK诱导CtBP磷酸化过程，下调CPLA2/PGE2信号通路的激活。ΗΙΡΚ2参与大部分肿瘤发生机制调节和肿瘤信号传导通路的调控，肿瘤细胞癌基因和抑癌基因之间的平衡失调均可导致癌基因的过表达而促使肿瘤恶化。ΗΙΡΚ2作为一种内源性的抑癌基因，是有效抑制肿瘤发生的蛋白激酶之一，在肿瘤的平衡稳定中发挥重要的调节作用，是恶性肿瘤预防和治疗的一个非常具有潜力的调节靶点。但由于ΗΙΡΚ2的发现和分离较晚，其作为一个肿瘤抑制基因的研究主要集中在其对细胞增殖和凋亡方面较多，而对肿瘤其它生物学活性影响的研究较少，人们对于ΗΙΡΚ2作为一个肿瘤抑制基因在恶性肿瘤的生物学行为(如肿瘤血管新生、运动粘附、侵袭转移等)中的作用还不是很清楚。目前肝癌、胃癌、结直肠癌等恶性肿瘤术后化疗是主要的治疗手段，但由于化疗对机体的杀伤性太大，毒副作用太强，化疗似乎走到了一个平台期，已经不能够满足临床恶性肿瘤治疗的需要。如何实现治疗效果上的重大突破是国内外面临的严峻挑战，随着对肿瘤信号转导途径研究的不断深入，针对细胞受体、信号转导、细胞周期和血管生成等的分子靶向治疗，已成为结肠直肠癌内科治疗的新方向。目前，临床上应用较多的是针对单一作用靶点或受体的靶向治疗药物，且多为蛋白制剂，治疗作用局限。同时，由于应用分子靶向制剂防治肿瘤的量大，应用蛋白制剂成本及费用太高，蛋白纯化方法复杂，高纯度大批量生产困难，不能满足临床治疗的需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种含同源结构域相互作用蛋白激酶2基因(ΗΙΗ(2)的重组质粒(如PEGFP-N3-HIPK2)，用于ΗΙΡΚ2基因在肿瘤血管新生、增殖凋亡、侵袭转移等恶性肿瘤的生物学行为中作用机理的研究，继而开发和制造抗肿瘤药物。为实现以上目的，本发明提供了一种含ΗΙΡΚ2基因的重组质粒及其应用途径，该重组质粒包含ΗΙΡΚ2基因的编码序列以及载体质粒DNA序列，所述的载体质粒DNA序列中包含与ΗΙΡΚ2基因连接的调节序列；所述的重组质粒通过以下步骤构建
步骤1，以含有人ΗΙΡΚ2基因的真核表达载体pENTR223. 1/ΗΙΡΚ2为模板设计引物序列， 分别引入Nhe I和Kpn I酶切位点；
步骤2，对ΗΙΡΚ2基因进行PCR扩增；
步骤3，对所得ΗΙΡΚ2基因序列和载体质粒进行Nhe I和Kpn I双酶切以及纯化； 步骤4，将步骤3所得产物进行T4 DNA连接酶酶切，使ΗΙΡΚ2基因目的片段和载体质粒相连接；
步骤5，用步骤4所得连接产物转化大肠杆菌感受态细胞； 步骤6，将步骤5所得重组质粒进行酶切鉴定阳性克隆并测序。其中，所述的载体质粒DNA序列与ΗΙΡΚ2基因可操作地连接的调节序列，如启动子，包含如CMV即刻早期、HCV胸腺嘧啶激酶、早期和晚期SV40、反转录病毒的LTR等任何在真核细胞中有作用的启动子。所述的ΗΙΡΚ2基因的编码序列(CDs)能够编码基本保留同源结构域相互作用蛋白激酶活性的蛋白质的多核苷酸，该HIPK2基因的编码序列也包含该基因天然发生的等位基因变异体的编码序列，以及天然发生或人工变异体的编码序列中的任意一种。所述的载体质粒是可以在宿主中复制和生存的真核表达质粒，包括如pEGFP、 pcDNA、pSVL、pSG、pSVK3、pMSG、pBPV、pXTl等分子生物学领域常用的载体，也可使用可在宿主中复制和生存的其它真核表达质粒。本发明的重组质粒可以通过分子生物学技术领域的常规技术构建，HIPK2基因序列和表达载体是已知的，并可按照需要构建用于特定目的的新克隆和表达载体，在获得本发明的HIPK2基因后，可以进行通过常规重组技术导入任何适当的质粒载体中。本发明具有以下突出的优点本发明提供的含HIPK2基因的重组质粒可用于 HIPK2基因对肿瘤其它生物学活性影响的研究，继而用于抗肿瘤药物的制造中，在HIPK2基因在肿瘤血管新生、增殖凋亡、侵袭转移等恶性肿瘤的生物学行为中作用机理的基础上，进一步开发和生产可预防和治疗恶性肿瘤的药物，所述的恶性肿瘤包括肝癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌和肺癌等，特别是消化系恶性肿瘤。
图1是PEGFP-N3-HIPK2重组质粒构建概要图。图2是PCR扩增HIPK2基因电泳结果。图3是pEGFP-N3载体双酶切结果。图4是pEGFP-N3-HIPK2重组质粒阳性克隆酶切结果。图fe-图5g是pEGFP-N3-HIPK2重组质粒测序结果。图6是HIPK2基因重组质粒转染人结直肠癌细胞24h绿色荧光蛋白表达情况。图7是HIPK2基因重组质粒对人结直肠癌细胞C0X-2启动子活性的影响。
具体实施例方式以下结合附图详细说明本发明的具体实施方式
。实施例1 :pEGFP-N3-HIPK2重组质粒的构建
如图1所示，PEGFP-N3-HIPK2重组质粒构建过程，具体包括以下步骤
1.引物设计
将含有人HIPK2基因的真核表达载体pENTR223. 1/HIPK2 (购自美国Open Biosystems 公司)为模板，设计引物序列，分别引入Nhe I和Kpn I酶切位点
上游引物，5’端CTA部分为保护碱基，下划线部分GCTAGC为Nhe I酶切位点 5’-CTAGCTAGCGCCACCATGGCCCCCGTGTACGAAGGTATGGCCTCAC-3' 下游引物，5’端CGG部分为保护碱基，下划线部分GGTACC为Kpn I酶切位点 5’-CGGGGTACCTATGTAAGGGTACTGGTTGACCTTGGCGG-3'
2.PCR扩增
2. 1 PCR反应体系如下
在PCR反应管中配置以下体系，模板量为0. 1 μ L扩增ΗΙΗ(2⑶S 2. 5mM dNTP mixture (三磷酸脱氧核苷酸混合溶液) 2 μ IOXPyrobest buffer (缓冲液)2.5 μ
5模板 DNA0. 1 μ
引物 ΗΙΡΚ2 Nhe I F(5pmol)1 μ
引物 ΗΙΡΚ2 Kpn I R(5pmol)1 μ
PyrobestTM DNA Polymerase0. 25 μ
ddH20 (去离子水)17. 25 μ
定容至总量25 μ
注Pyrobest DNA Polymerase (PyrobestDNA 聚合酶)购于 TaKaRa 公司，货号 DR005A。 将上述体系混勻后，置于ABI 7900型PCR扩增仪扩增，扩增条件如下
权利要求
1.一种含HIPK2基因的重组质粒，其特征在于，该重组质粒包含HIPK2基因的编码序列以及载体质粒DNA序列，所述的载体质粒DNA序列中包含与HIPK2基因连接的调节序列； 所述的重组质粒通过以下步骤构建步骤1，以含有人HIPK2基因的真核表达载体pENTR223. 1/HIPK2为模板设计引物序列， 分别引入Nhe I和Kpn I酶切位点；步骤2，对HIPK2基因进行PCR扩增；步骤3，对所得HIPK2基因序列和载体质粒进行Nhe I和Kpn I双酶切以及纯化；步骤4，将步骤3所得产物进行T4 DNA连接酶酶切，使HIPK2基因目的片段和载体质粒相连接；步骤5，用步骤4所得连接产物转化大肠杆菌感受态细胞；步骤6，将步骤5所得重组质粒进行酶切鉴定阳性克隆并测序。
2.如权利要求1所述的含HIPK2基因的重组质粒，其特征在于，所述的HIPK2基因的编码序列也包含该基因天然发生的等位基因变异体的编码序列，以及天然发生或人工变异体的编码序列中的任意一种。
3.如权利要求1所述的含HIPK2基因的重组质粒，其特征在于，所述的载体质粒是可以在宿主中复制和生存的真核表达质粒。
全文摘要
本发明涉及一种含HIPK2基因的重组质粒，该重组质粒包含HIPK2基因的编码序列以及载体质粒DNA序列。其中载体质粒DNA序列包含与HIPK2基因可操作地连接的调节序列，该载体质粒是可以在宿主中复制和生存的真核表达质粒。该重组质粒的构建包括引物设计、PCR扩增、NheI和KpnI双酶切及纯化、目的片段和载体质粒的连接、连接产物转化大肠杆菌感受态细胞以及重组质粒酶切鉴定阳性克隆并测序等步骤。该重组质粒可用于HIPK2基因在肿瘤血管新生、增殖凋亡、侵袭转移中的作用机理的研究，以及基于HIPK2基因的抗肿瘤药物的开发和生产，从而提供预防和治疗肝癌、胃癌、结直肠癌等恶性肿瘤的新途径。
文档编号C12N15/85GK102277383SQ20111021719
公开日2011年12月14日 申请日期2011年8月1日 优先权日2011年8月1日
发明者周利红, 周宁, 慈书俊, 李琦, 殷佩浩, 王炎, 范忠泽 申请人:上海中医药大学附属普陀医院, 上海市普陀区中心医院