专利名称：内源基因超量表达技术提高黄芪甲苷含量的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药技术领域。具体涉及一种内源基因超量表达技术提高黄芪甲苷含量的方法。
背景技术：
黄芪(Astragalus membranacius或A.mongholicus)是我国重要的中药材品种之一，具有补益固表、利尿排毒、生肌敛疮、利水消肿作用，是许多中药复方、成药和保健品的主要成分。随着人们日益增长的保健观念的强化，黄芪的需求量将会逐年增加；但目前黄芪的野生资源逐年减少，栽培品种品质下降且面临农药污染及重金属残留等问题的困扰，给临床和成药加工、出口带来一定的困难。因而应用现代生物技术提高黄芪的产量，改善其品质，探索工业化生产的可行途径对黄芪的生产具有重要的意义。黄芪甲苷是中国药典规定的含测指标，如果能寻找到高黄芪甲苷含量的人工黄芪产品，将具有良好的开发和应用前景。
八十年代以来，以全蛋白肽谱、同工酶谱、氨基酸序列分析、酶免疫测定以及核酸分析技术为主要内容的分子生物学技术，特别是基因工程技术已成功地应用于中药生产、品质鉴定改良中，为中药生产注入了新的活力。以发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenesis)诱导生成的毛状根具有生长迅速，不需要添加外源激素，拥有亲本植株的代谢途径，遗传稳定，易于扩大培养等优点，如果再能增加其有效成分含量，将有利于实现工业化生产。由于发根农杆菌Ri质粒载体系统的优越性，近年来有关这方面的研究报道很多，但多集中在单个基因的导入上，如Hughes的研究发现，将控制绿荧光蛋白(GFP)的一种糖皮质激素的诱导子转入长春花(Catharanthus roseus)毛状根中，该诱导子与毛状根中糖皮质激素(地塞米松)的含量呈明显的剂量相关。Hashimoto等用发根农杆菌作载体，将天仙子羟化酶导入富含茛菪碱的颠茄(Scopolia japonica)中，转化的毛状根中东茛菪碱含量比野生型(不含天仙子羟化酶基因)毛状根高5倍。但多基因的导入报道很少，且主要是有关农作物抗病虫害，在这些报道中是直接将外源基因导入农作物，转基因农作物再在大田中进行生长，故所得到的转基因植株仍需较长的生长周期。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于把毛状根技术与基因工程相结合，获得生长周期短、黄芪甲苷含量高的转多糖合成双基因黄芪毛状根。
本发明提供了内源基因超量表达技术提高黄芪甲苷含量的方法。
本发明从黄芪中克隆出的与多糖代谢相关的两个关键酶基因——ugp基因(GenBank登录号AF281081)和gbss基因(GenBank登录号AF097922)，将该双基因经体外修饰，增加强化表达的调控元件(CaMV 35s强启动子和Nos-ter强终止子序列)，构建成功表达中间载体pBI-UG，通过电穿孔法将表达中间载体pBI-UG转入发根农杆菌LBA-9402，诱导药用植物黄芪，获得黄芪毛状根。
本发明对通过上述方法获得的黄芪毛状根进行了rolC特征引物PCR筛选、卡那霉素抗性筛选、转多糖合成双基因特征引物双重嵌套PCR筛选、Southern blot分析、RT-PCR、基因表达蛋白的检测等一系列的鉴定，证明获得的是转多糖合成双基因的黄芪毛状根。HPLC-ELSD法测定黄芪甲苷的含量，发现转多糖合成双基因黄芪毛状根中黄芪甲苷的含量比未转基因黄芪毛状根高近6倍，比商品药材膜荚黄芪高11倍。对转多糖合成双基因黄芪毛状根进行了遗传稳定性和合成代谢产物稳定性的检测，结果显示转多糖合成双基因黄芪毛状根具有遗传稳定性和合成代谢产物稳定性的性质。
转多糖合成双基因黄芪毛状根可以大幅度提高黄芪甲苷的含量，其中株系11与22的黄芪甲苷含量分别为22.24mg/g和22.13mg/g，是野生型未转基因黄芪毛状根(黄芪甲苷含量为3.30mg/g)的6.7倍，是山西产膜荚黄芪(黄芪甲苷含量为1.77mg/g)的12.5倍。由于不同产地药材的黄芪甲苷含量有所不同，参考中国药典[1]的规定黄芪甲苷不得少于0.4mg/g，以及上海市中药标准化中心收集测定的不同来源商品黄芪中黄芪甲苷的含量0.5mg/g～1.9mg/g，可以推断转多糖合成双基因黄芪毛状根具有良好的合成黄芪甲苷的能力。
黄芪甲苷是中国药典规定的含测指标[1]，具有良好的心脑血管药理活性。张召才等[8]发现，黄芪甲苷可以提高心肌炎小鼠生存率，减少胶原合成和心肌细胞凋亡，安全有效；其抗凋亡效应对延缓或逆转病毒性心肌炎心肌纤维化起重要作用。罗玉敏等(中国临床神经科学，2000，8(4)280-281)的研究证明黄芪甲苷可以降低血脑屏障的通透性，是一种脑组织保护剂。李明亚等(广东药学院学报，1997，13(4)219-221)的研究表明黄芪甲苷对KCl和CaCl2所致的离体兔主动脉环收缩和对离体豚鼠右心房自发性节律有抑制作用。吴大正等(中国中药杂志，2001，26(12)850-853)的研究表明由组胺引起的脑微血管通透性增加能够被黄芪甲苷抑制。这些均显示了黄芪甲苷具有很好的市场应用前景，本发明得到的转多糖合成双基因黄芪毛状根中黄芪甲苷含量是商品黄芪药材的12.5倍，可以作为黄芪甲苷的提取原材料，具有良好的开发前景。
图1.质粒pBI-UG PCR鉴定2含多糖合成双基因的发根农杆菌LBA9402-UG三轮PCR鉴定图3rolC特征引物PCR鉴定图4卡那霉素抗性筛选图5ugp、gbss两对特征引物双重嵌套PCR鉴定图6转双基因黄芪毛状根Southern鉴定图7转双基因黄芪毛状根RT-PCR鉴定图8含多糖合成双基因黄芪毛状根黄芪甲苷含量测定图9HPLC-ELSD法测定黄芪甲苷的含量图9.1黄芪甲苷结构图；图9.2黄芪甲苷标准品HPLC图；图9.3样品(转多糖合成双基因黄芪毛状根)黄芪甲苷测定HPLC图；图10转双基因黄芪毛状根遗传稳定性检测
具体实施例方式实施例11)总RNA提取(一步法)反应试剂的配制变性液(26mM柠檬酸钠pH 4.0，0.5％十二烷基肌氨酸钠，0.125M 2-巯基乙醇，4M异硫氰酸胍)；NaAc(2M，pH 4.7)；酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)；70％乙醇。所有的试剂皆用0.1％DEPC水处理过的无RNase水配制，玻璃容器皆去RNase。
操作程序取适量新鲜植物组织置于陶瓷研钵中，加入液氮快速研磨至细粉末，转移至含有650μl变性液的1.5ml离心管中混匀；加入65μl 2M NaAc(pH 4.0)，反复颠倒混匀；再加入650μl酚∶氯仿∶异戊醇，混匀，冰浴15min；4℃，12000rpm，离心20min；上清转移至一新的1.5ml离心管中，加等体积异丙醇，混匀后-20℃置30min；4℃，12000rpm，离心10min沉淀RNA；弃上清液，将RNA溶于0.5ml变性液中，65℃加热尽快溶解；加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇，混合溶液重新抽提1次，即重复前步骤；离心后，弃上清液，加75％预冷乙醇1ml，漂洗沉淀，离心同上，弃上清；空气干燥后，加20μl去离子水溶解RNA，分光光度法和凝胶电泳检测浓度和纯度，余下部分-20℃保存备用。
2)逆转录cDNAOligo(dT)(37.5μM)2μl，总RNA 10μg，ddH2O 10.5μl，70℃反应10min，立即置冰上，5×RT buffer 4μl，RNasin(40U/μl)0.5μl，10mM dNTPs 1μl，M-MLV逆转录酶(200U/μl)1μl，42℃反应1.5h，70℃反应10min灭活逆转录酶。
3)引物设计根据已经发表的UGPase和GBSS的cDNA序列设计了如下的引物ugp P25’-tcgagccttacaggtcctttgg-3’，PxbaI5’-tttctaatggccaccgctactgc-3’gbss P205’-cctctagatgttgctcttactgctctctc-3’，P215’-ccgagctctgtggctcaaaatccttctg-3’构建双基因载体时扩增引物对如下Psf5’-cagaagtactattccagtatgacg-3’，Psr5’-tttcatgatctagtaacatagtgacac-3’4)PCR扩增cDNA 1μl，Primer 1(5μM)2μl，Primer 2(5μM)2μl，10×Buffer 2μl，MgCl2(25mM)1.6μl，dNTPs(10mM)0.5μl，Taq(3U/μl)0.3μl，ddH2O94℃变性5min→94℃变性0.5min→60℃退火0.5min→72℃延伸1.0min→30个循环→72℃延伸7min。
5)连接pGEM-T载体T4DNA缓冲液(10×)1μl，pGEM easy载体(50ng/μl)1μl，PCR纯化产物适量，T4 DNA连接酶(3U/μl)1μl，ddH2O，将反应液混匀后4℃放置。
6)感受态细菌的制备从-70℃低温冰箱取出菌种DH5α，接种于LB平板，37℃培养过夜进行活化。从活化平皿上挑取单菌落，接入5ml不含抗生素的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜(250rpm)。次日按1％(V/V)比例转入新鲜的LB液体培养基中，37℃振摇培养至OD600＝0.3(0.3～0.6也可)。在无菌条件下，将50～100ml培养液转入两个预冷的无菌离心管(Falcon 2070管)中，冰上静置10min。4℃，4000rpm离心10min，弃去上清液。倒置流尽培养液。加10ml预冷的0.1M CaCl2溶液，重悬浮细菌，冰浴30min。4℃，4000rpm离心10min，弃去上清液。加2ml预冷的0.1M CaCl2溶液，重悬浮细菌，即为感受态细胞。
7)转化与克隆筛选在制得的感受态细胞中加4μl载体连接质粒DNA，冰浴30min后，于42℃热激1.5min，冰上冷却1～2min；加入SOC培养基800μl，于37℃，180rpm摇床培养1hr；取培养物100μl铺LB平板(加相应的筛选抗生素)，再加IPTG，X-Gal各5μl，37℃恒温培养箱过夜培养，根据蓝白斑筛选阳性克隆。
8)分别以引物对gbss特征引物P20-P21、ugp特征引物PxbaI-P2扩增gbss、ugpTemplate 1μl，Primer 1(5μM)2μl，Primer 2(5μM)2μl，10×Buffer 2μl，MgCl2(25mM)1.6μl，dNTP(10mM)0.5μl，Taq(3U/μl)0.3μl，ddH2O94℃变性5min→94℃变性0.5min→45℃退火0.5min→72℃延伸1.0min→3个循环→94℃变性0.5min→55℃退火0.5min→72℃延伸1.0min→27个循环→72℃延伸7min。
测序。
9)双酶切(XbaI-SacI)10×双酶切缓冲液10μl，XbaI(10U/μl)3μl，SacI(10U/μl)3μl，DNA 10μg，ddH2O37℃水浴1hr，取出75℃灭活内切酶，取5μl电泳鉴定，其余部分酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)纯化后，加1/10体积的3M NaAc，2体积的乙醇沉淀DNA，静置10min后，12000rpm，4℃，离心10min，沉淀用70％乙醇洗涤两次后晾干约10min，加适量的无菌水溶解，进行与载体的连接或者-20℃保存待用。
10)质粒pBI 121的提取、双酶切反应试剂的配制LB液体培养基；溶液1(50mM葡萄糖Glucose，25mM Tris-HCl，10mMEDTA，pH 8.0)；溶液2(0.2M NaOH，1％SDS)；溶液3(5M KAc 60ml，HAc 11.5ml，H2O 28.5ml)；酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合液；RNA酶(20μg/ml)；无水乙醇；70％乙醇。
操作程序取2ml含抗生素的LB液体培养基，加入15ml的通气良好的试管中，然后从转化平板上挑一单菌落，37℃，300rpm，培养过夜；取1.5ml培养物，4℃，12000rpm，离心0.5min，倒去上清液，沉淀尽可能干燥；加100μl溶液1重新悬浮细菌，剧烈震荡；加200μl溶液2，盖紧盖子，快速颠倒混匀，置冰上；加150μl冰预冷的溶液3，盖紧盖子，颠倒混匀，置冰上3～5min；12000rpm，4℃，离心5min，上清转移；加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合液，振荡混匀，4℃，12000rpm，离心2min，转移上清液；在上清中加2倍体积EtOH，室温放置2分钟；12000rpm，4℃，离心5min；弃上清，沉淀晾干；再加1ml 70％乙醇洗涤沉淀，4℃，12000rpm，离心5min，沉淀空气干燥10min；加50μl含胰RNA酶的ddH2O溶解DNA，储存于-20℃待用。
双酶切同9)。
11)质粒与插入片段的连接10×连接缓冲液1μl，步骤9)双酶切纯化后DNA，载体pBI 121插入片段和载体的摩尔比例约为2∶1，T4 DNA连接酶(5U/μl)1μl，ddH2O，16℃水浴过夜。
12)转化在制得的感受态细胞中加4μl质粒连接产物，冰浴30min后，于42℃热激1.5min，冰上冷却1～2min；加入SOC培养基800μl，于37℃，180rpm摇床培养1hr；取培养物100μl铺LB平板(加相应的筛选抗生素)，37℃恒温培养箱过夜培养，PCR方法筛选阳性克隆。
13)分别以gbss、ugp特征引物PCR扩增筛选阳性克隆，方法同7)。
14)分别提取质粒pBI-GBSS、pBI-UGP，连接获得pBI-UG。其中对pBI-GBSS进行ScaI酶切，回收酶切片段。用引物对Psf-Psr，以质粒pBI-UGP为模板，进行PCR扩增。10×反应缓冲液2μl，MgCl2(25mM)1.6μl，dNTPs(10mM)0.5μl，Taq酶(5U/μl)0.2μl，Psf(5μM)2μl，Psr(5μM)2μl，Template(质粒pBI-UGP)0.5μl，ddH2O。PCR循环条件同7)。
PCR产物进行切胶回收，再用ScaI进行酶切，回收酶切产物后与载体pBI-GBSS连接。筛选阳性克隆，获得pBI-UG。
构建成功双基因表达载体pBI-UG，分别添加了CaMV 35s强启动子和Nos-ter强终止子序列，双重PCR鉴定结果见图1。
图中1pBI-UG ugp特征引物PCR结果；21kb DNA Marker；3pBI121 ugp特征引物PCR结果；4pBI121 gbss特征引物PCR结果；5pBI-UG gbss特征引物PCR结果15)电穿孔法转化发根农杆菌接种发根农杆菌LBA9402在含有100μg/ml利福平的YMB固体培养基上，28℃培养至单菌落长出。挑单菌落接种于加100μg/ml利福平的YMB液体培养基，28℃，250rpm，培养约40hr。按1％的接种比例将农杆菌接种于YMB液体培养基中，28℃，250rpm培养至OD600为0.5。置冰上5min后，5000rpm，4℃离心10min。1mM HEPES(pH7.0)洗涤农杆菌沉淀2～3次，每次洗涤后分别5000rpm，4℃离心10min，10％甘油悬浮沉淀。取悬浮的细菌1ml，加转化质粒200ng左右，轻微混匀后，置冰上1min。取40μl上步的菌液置于2mm的电穿孔杯中，加2500V电压，25uF电容，电穿孔10mS后，将菌液转移至0.5ml YMB液体培养基中，25℃培养2～3hr后铺于含50μg/ml卡那霉素的YMB平板，25℃培养3～4天后即见到单菌落。挑单菌落进行PCR鉴定(方法同7)，阳性菌落接种于含有100μg/ml利福平，50μg/ml卡那霉素的YMB液体培养基，28℃，250rpm，培养过夜，再对菌液进行PCR鉴定(方法同1.2.10)，确定阳性菌LBA9402-UG。
图中11kb DNA marker；2GBSS cDNA ORF，约1.8kb；3UGPase cDNA ORF，约1.4kb；4.rolC片断，约570bp16)转多糖合成双基因发根农杆菌侵染黄芪无菌苗接种发根农杆菌LBA9402-UG在含有100μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的YMB固体培养基上，28℃培养至单菌落长出。挑单菌落接种于加100μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的YMB液体培养基，28℃，250rpm，培养约40hr。按1％的接种比例将农杆菌接种于YMB液体培养基中，28℃，250rpm培养过夜。加适量乙酰丁香酮至终浓度50μM，再培养一天。无菌条件下，切取黄芪无菌苗的茎和叶片，在切口处接种悬浮培养过夜的转多糖合成双基因的发根农杆菌LBA9402-UG菌液(OD600＝0.5)，然后转移至MSOH固体培养基，25℃、黑暗条件下培养2天。无菌水洗涤外植体4～5次后，转移至含500mg/L Claforan的固体MSOH培养基，25℃、黑暗条件下培养诱导产生毛状根。
17)毛状根rolC特征引物PCR筛选毛状根DNA的提取CTAB法提取步骤16诱导出的黄芪毛状根总DNA。取500～600mg新鲜材料，液氮研细至细粉末状，然后迅速将其转入1.5ml离心管中；加入600μl 2％CTAB提取液(60℃预热)，混匀，于60℃水浴放置1hr，中间温和混匀几次；12000rpm离心10min，取上清液，加等体积的水饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，4℃12000rpm离心10min，如此重复2次，至两液间无白色沉淀；取上清液，加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀，4℃12000rpm离心10min；取上清液加1/10 NaAc和等体积异丙醇，混匀，-20℃放置1hr；4℃5000rpm离心10min，弃上清液，沉淀用70％乙醇漂洗2次；沉淀在空气中自然干燥后，溶于30μlTE中。
PCR反应rolC基因的引物5′-GATATATGCCAAATTTACACTAG-3′5′-GTTAACAAAGTAGGAAACAGG-3′，预期片断长度577bp。
Template 1μl，Primer 1(5μM)2μl，Primer 2(5μM)2μl，10×Buffer 2μl，MgCl2(25 mM)1.6μl，dNTP(10mM)0.5μl，Taq(3U/μl)0.3μl，ddH2O。94℃变性5min→94℃变性0.5min→45℃退火0.5min→72℃延伸0.75min→30个循环→72℃延伸10min。
图中1阳性对照(LBA9402-UG)；2黄芪无菌苗；3转ugp黄芪毛状根；4转gbss黄芪毛状根；5转双基因黄芪毛状根；6质粒pBI-UG；7100bp DNA Marker18)黄芪毛状根的抗性筛选将通过步骤17得到的黄芪毛状根在含75mg/L卡那霉素的MSOH固体培养基中培养，筛选具有卡那霉素抗性的阳性株系。
图中左侧为具有卡那霉素抗性的阳性黄芪毛状根株系，可以在加卡那霉素的培养基上生长；右侧为不具有卡那霉素抗性的阴性黄芪毛状根株系，不能在加卡那霉素的培养基上生长19)转多糖合成双基因特征引物双重嵌套PCR筛选将步骤18筛选出的阳性株系按步骤17的方法提取总DNA；引物对分别为ugp特征引物PxbaI-P2和gbss特征引物P20-P21进行PCR反应。
图中1、8阳性对照(LBA9402-UG)；2、9黄芪无菌苗；3、10未转基因黄芪毛状根；4、11转双基因黄芪毛状根；5、12转gbss黄芪毛状根；6、13转ugp黄芪毛状根；7、141kb DNA Marker1--6ugp特征引物PCR结果，目的条带约1.4kb；8--13gbss特征引物PCR结果，目的条带约1.8kb20)转多糖合成双基因黄芪毛状根的Southern blot分析
CTAB法提取阳性株系DNA，取15μg植物DNA用SacI与XbaI(5～10倍过量)酶切过夜后，0.8％琼脂糖凝胶70V电压电泳，转膜及固定，分子杂交与信号检测。
图中1、7转ugp黄芪毛状根；2、8；转双基因黄芪毛状根；3、9转gbss黄芪毛状根；4、10黄芪无菌苗；5、11未转基因黄芪毛状根；6、12阳性对照(LBA9402-UG)1--6gbss特征探针Southern杂交结果；7--12ugp特征探针Southern杂交结果21)转多糖合成双基因黄芪毛状根的RT-PCR植物总RNA提取按步骤l进行，逆转录合成cDNA第一链按步骤2进行，总RNA加样量为3μg，PCR反应同步骤5。
图中①未转基因黄芪毛状根；②转gbss黄芪毛状根；③转ugp黄芪毛状根；④转双基因黄芪毛状根；⑤阳性对照(LBA9402-UG)；⑥黄芪无菌苗22)基因表达蛋白的检测参考Elling-Kula[6]采用的UDPG脱氢酶偶连法进行UGPase的提取及活性测定，参考Fujita等的方法[7]进行GBSS的提取及GBSS酶活性测定。结果显示，57.6％的转双基因株系UGPase活性大于或等于未转基因株系，45.5％的转双基因株系GBSS活性大于或等于未转基因株系；其中33.3％的株系在这两个指标上均有所增加。该结果说明，部分转双基因株系中，双基因已在翻译水平上增强表达，提高了目标产物(UGPase和GBSS)的活性。
经步骤17～步骤22的鉴定与检测，可以确定获得转多糖合成双基因(ugp基因和gbss基因)的黄芪毛状根。
23)HPLC-ELSD法测定黄芪甲苷的含量样品的提取与制备样品粉碎，过80目筛，每种样品称取3份，每份0.300g，加80％甲醇10ml，浸泡过夜后，80℃超声提取3次，每次30min，抽滤，合并滤液。蒸干滤液，残渣趁热加ddH2O 5ml溶解，转移至分液漏斗中，5ml水饱和正丁醇萃取3次，合并正丁醇液，0.15％NaOH洗涤1次，收集正丁醇液，蒸干正丁醇，残渣用甲醇溶解定容至2ml，摇匀后0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试液。
色谱条件色谱柱Inertsil ODS-3(4.6*250mm，5μm)；流动相∶乙腈-水(35∶65)；流速1.0ml/min；柱温室温；ELSD参数蒸发温度100℃，雾化温度80℃，出口温度60℃；载气流速1.2ml/min。
标准曲线的绘制精密称取黄芪甲苷对照品2.31mg，用甲醇溶解并定容至2ml，0.45μm微孔滤膜过滤。依次吸取滤液1、2、5、10、15、20μl分别按上述色谱条件分析，测定峰面积。以对照品含量(μg)的对数值为横坐标(X)，对照品峰面积(A)的对数值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。并得回归方程、相关系数及线性范围为Y＝1.5856X+0.5769，r＝0.9995，1.155～23.100μg。
精密度实验精密吸取黄芪甲苷对照品溶液10μl，重复5次进样测定，结果黄芪甲苷RSD＝1.114％(n＝5)。
稳定性实验同一样品分别在0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24h进样，计算含量，测定日内稳定性，结果RSD＝0.79％。
重复性实验同种样品称取5份，每份0.300g，按3.2.3项下方法提取测定黄芪甲苷含量，计算得黄芪甲苷的平均含量17.352mg/g，RSD为2.30％。
回收率实验精密称取5份已知黄芪甲苷含量未转基因黄芪毛状根样品，每份0.300g，分别精密加入黄芪甲苷标准品，同法提取测定黄芪甲苷含量，测得平均回收率为96.72％，RSD＝2.04％。
样品的测定称取山西产商品膜荚黄芪药材、未转基因黄芪毛状根、转多糖合成双基因黄芪毛状根粉末，每种3份，每份0.300g，同法制备供试液，按相同色谱条件测定供试液中黄芪甲苷的含量，外标法计算峰面积。
测定结果结果显示转多糖合成双基因黄芪毛状根黄芪甲苷含量普遍很高，如株系11与22的黄芪甲苷含量分别为22.24mg/g和22.13mg/g，明显高于非转基因黄芪毛状根(黄芪甲苷含量为3.30mg/g)和山西产膜荚黄芪药材(黄芪甲苷含量为1.77mg/g)。
图9.1黄芪甲苷结构图；图9.2黄芪甲苷标准品HPLC图；图9.3样品(转多糖合成双基因黄芪毛状根)黄芪甲苷测定HPLC图；图中ASI为黄芪甲苷(Astragaloside IV)的缩写24)遗传稳定性和合成代谢产物的稳定性的检测分别取转化后稳定生长15天(即转化当代)、继代培养一年的转多糖合成双基因黄芪毛状根提取DNA进行ugp与gbss特征引物PCR；结果显示转入的双基因在一年后仍然稳定存在于转基因株系基因组中，表明转基因株系具有遗传稳定性。分别取转化当代与继代培养一年的转多糖合成双基因黄芪毛状根提取测定黄芪甲苷；结果说明转化当代与继代一年后的转多糖合成双基因黄芪毛状根中的黄芪甲苷含量无明显差异，该结果显示，转多糖合成双基因黄芪毛状根具有遗传稳定的合成黄芪甲苷的能力。
图中1、9一年生转双基因黄芪毛状根；2、10未转基因黄芪毛状根；3、11转化当代转双基因黄芪毛状根；4、12黄芪无菌苗；5、8阳性对照(LBA9402-UG)；6、71kb DNA Marker。
权利要求
1.一种内源基因超量表达技术提高黄芪甲苷含量的方法，其特征在于包括下列步骤1)总核糖核酸提取反应试剂的配制变性液26mM柠檬酸钠pH4.0，0.5％十二烷基肌氨酸钠，0.125M 2-巯基乙醇，4M异硫氰酸胍；NaAc2M，pH4.7；酚∶氯仿∶异戊醇25∶24∶1；70％乙醇；所有的试剂皆用0.1％焦碳酸二乙酯水处理过的无核糖核酸酶水配制，玻璃容器皆去核糖核酸酶；操作程序取适量新鲜植物组织置于陶瓷研钵中，加入液氮快速研磨至细粉末，转移至含有650μl变性液的1.5ml离心管中混匀；加入65μl 2M NaAc pH4.0，反复颠倒混匀；再加入650μl酚∶氯仿∶异戊醇25∶24∶1，混匀，冰浴15min；4℃，12000rpm，离心20min；上清转移至一新的1.5ml离心管中，加等体积异丙醇，混匀后-20℃置30min；4℃，12000rpm，离心10min沉淀核糖核酸；弃上清液，将核糖核酸溶于0.5ml变性液中，65℃加热尽快溶解；加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇，混合溶液重新抽提1次，即重复前步骤；离心后，弃上清液，加75％预冷乙醇1ml，漂洗沉淀，离心同上，弃上清；空气干燥后，加20μl无菌双蒸去离子水溶解核糖核酸，分光光度法和凝胶电泳检测浓度和纯度，余下部分-20℃保存备用；2)逆转录互补脱氧核糖核酸寡聚脱氧胸苷酸37.5μM 2μl，总核糖核酸10μg，无菌双蒸去离子水10.5μl，70℃反应10min，立即置冰上，5×逆转录缓冲液4μl，核糖核酸酶抑制剂40U/μl 0.5μl，10mM脱氧核酸核苷三磷酸1μl，逆转录酶200U/μl 1μl，42℃反应1.5h，70℃反应10min灭活逆转录酶；3)引物设计根据尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因和腺苷二磷酸葡萄糖苷转移酶基因的互补脱氧核糖核酸序列设计引物P25’-tcgagccttacaggtcctttgg-3’，PxbaI5’-tttctaatggccaccgctactgc-3’P205’-cctctagatgttgctcttactgctctctc-3’，P215’-ccgagctctgtggctcaaaatccttctg-3’构建双基因载体时扩增引物为Psf5’-cagaagtactattccagtatgacg-3’，Psr5’-tttcatgatctagtaacatagtgacac-3’4)聚合酶链式反应扩增互补脱氧核糖核酸1μl，引物15μM 2μl，引物25μM 2μl，10×缓冲液2μl，MgCl225mM1.6μl，脱氧核酸核苷三磷酸10mM 0.5μl，脱氧核糖核酸聚合酶3U/μl 0.3μl，无菌双蒸去离子水94℃变性5min→94℃变性0.5min→60℃退火0.5min→72℃延伸1.0min→30个循环→72℃延伸7min；5)连接pGEM-T载体T4脱氧核酸缓冲液10×1μl，pGEM easy载体50ng/μl 1μl，聚合酶链式反应纯化产物适量，T4脱氧核酸连接酶3U/μl 1μl，无菌双蒸去离子水，将反应液混匀后4℃放置；6)感受态细菌的制备从-70℃低温冰箱取出菌种DH5α，接种于LB平板，37℃培养过夜进行活化，从活化平皿上挑取单菌落，接入5ml不含抗生素的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜250rpm，次日按1％V/V比例转入新鲜的LB液体培养基中，37℃振摇培养至OD600＝0.3～0.6也可，在无菌条件下，将50～100ml培养液转入两个预冷的无菌离心管中，冰上静置10min。4℃，4000rpm离心10min，弃去上清液。倒置流尽培养液。加10ml预冷的0.1M CaCl2溶液，重悬浮细菌，冰浴30min，4℃，4000rpm离心10min，弃去上清液，加2ml预冷的0.1M CaCl2溶液，重悬浮细菌，即为感受态细胞，7)转化与克隆筛选在制得的感受态细胞中加4μl载体连接质粒脱氧核酸，冰浴30min后，于42℃热激1.5min，冰上冷却1～2min；加入SOC培养基800μl，于37℃，180rpm摇床培养1hr；取培养物100μl铺LB平板加相应的筛选抗生素，再加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷各5μl，37℃恒温培养箱过夜培养，根据蓝白斑筛选阳性克隆；8)分别以引物对腺苷二磷酸葡萄糖苷转移酶基因特征引物P20-P21、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因特征引物PxbaI-P2扩增腺苷二磷酸葡萄糖苷转移酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因模板1μl，引物15μM 2μl，引物5μM 2μl，10×缓冲液2μl，MgCl225mM 1.6μl，脱氧核酸核苷三磷酸10mM 0.5μl，脱氧核糖核酸聚合酶3U/μl 0.3μl，无菌双蒸去离子水94℃变性5min→94℃变性0.5min→45℃退火0.5min→72℃延伸1.0min→3个循环→94℃变性0.5min→55℃退火0.5min→72℃延伸1.0min→27个循环→72℃延伸7min，测序；9)双酶切10×双酶切缓冲液10μl，限制性核酸内切酶XbaI 10U/μl 3μl，限制性核酸内切酶SacI 10U/μl 3μl，脱氧核糖核酸10μg，无菌双蒸去离子水37℃水浴1hr，取出75℃灭活内切酶，取5μl电泳鉴定，其余部分酚∶氯仿∶异戊醇25∶24∶1纯化后，加1/10体积的3M NaAc，2体积的乙醇沉淀脱氧核糖核酸，静置10min后，12000rpm，4℃，离心10min，沉淀用70％乙醇洗涤两次后晾干约10min，加适量的无菌水溶解，进行与载体的连接或者-20℃保存待用；10)质粒pBI121的提取、双酶切反应试剂的配制LB液体培养基；溶液150mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM乙二胺四乙酸，pH8.0；溶液20.2M NaOH，1％十二烷基硫酸钠；溶液35M KAc 60ml，HAc 11.5ml，无菌双蒸去离子水28.5ml；酚∶氯仿∶异戊醇25∶24∶1混合液；核糖核酸酶20μg/ml；无水乙醇；70％乙醇；操作程序取2ml含抗生素的LB液体培养基，加入15ml的通气良好的试管中，然后从转化平板上挑一单菌落，37℃，300rpm，培养过夜；取1.5ml培养物，4℃，12000rpm，离心0.5min，倒去上清液，沉淀尽可能干燥；加100μl溶液1重新悬浮细菌，剧烈震荡；加200μl溶液2，盖紧盖子，快速颠倒混匀，置冰上；加150μl冰预冷的溶液3，盖紧盖子，颠倒混匀，置冰上3～5min；12000rpm，4℃，离心5min，上清转移；加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合液，振荡混匀，4℃，12000rpm，离心2min，转移上清液；在上清中加2倍体积乙醇，室温放置2分钟；12000rpm，4℃，离心5min；弃上清，沉淀晾干；再加1ml 70％乙醇洗涤沉淀，4℃，12000rpm，离心5min，沉淀空气干燥10min；加50μl含核糖核酸酶的无菌双蒸去离子水溶解脱氧核糖核酸，储存于-20℃待用；再按步骤9)方法双酶切；11)质粒与插入片段的连接10×连接缓冲液1μl，步骤9)双酶切纯化后脱氧核糖核酸，载体pBI121插入片段和载体的摩尔比例约为2∶1，T4脱氧核糖核酸连接酶5U/μl 1μl，无菌双蒸去离子水，16℃水浴过夜；12)转化在制得的感受态细胞中加4μl质粒连接产物，冰浴30min后，于42℃热激1.5min，冰上冷却1～2min；加入SOC培养基800μl，于37℃，180rpm摇床培养1hr；取培养物100μl铺LB平板加相应的筛选抗生素，37℃恒温培养箱过夜培养，PCR方法筛选阳性克隆；13)分别以腺苷二磷酸葡萄糖苷转移酶基因特征引物和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因特征引物聚合酶链式反应扩增筛选阳性克隆，按步骤7)方法进行；14)分别提取质粒pBI-GBSS、pBI-UGP，连接获得pBI-UG。其中对pBI-GBSS进行限制性核酸内切酶ScaI酶切，回收酶切片段。用引物对Psf-Psr，以质粒pBI-UGP为模板，进行聚合酶链式反应扩增，10×反应缓冲液2μl，MgCl225mM 1.6μl，脱氧核酸核苷三磷酸10mM 0.5μl，脱氧核糖核酸聚合酶5U/μl 0.2μl，引物1 Psf 5μM 2μl，引物2 Psr 5μM 2μl，质粒pBI-UGP0.5μl，无菌双蒸去离子水，聚合酶链式反应循环条件与步骤7)相同。聚合酶链式反应产物进行切胶回收，再用限制性核酸内切酶ScaI进行酶切，回收酶切产物后与载体pBI-GBSS连接，筛选阳性克隆，获得pBI-UG；构建成功双基因表达载体pBI-UG，分别添加了CaMV 35s强启动子和Nos-ter强终止子序列；15)电穿孔法转化发根农杆菌接种发根农杆菌LBA9402在含有100μg/ml利福平的YMB固体培养基上，28℃培养至单菌落长出，挑单菌落接种于加100μg/ml利福平的YMB液体培养基，28℃，250rpm，培养约40hr，按1％的接种比例将农杆菌接种于YMB液体培养基中，28℃，250rpm培养至OD600为0.5。置冰上5min后，5000rpm，4℃离心10min，1mM N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸、pH7.0洗涤农杆菌沉淀2～3次，每次洗涤后分别5000rpm，4℃离心10min，10％甘油悬浮沉淀，取悬浮的细菌1ml，加转化质粒200ng左右，轻微混匀后，置冰上1min。取40μl上步的菌液置于2mm的电穿孔杯中，加2500V电压，25uF电容，电穿孔10mS后，将菌液转移至0.5ml YMB液体培养基中，25℃培养2～3hr后铺于含50μg/ml卡那霉素的YMB平板，25℃培养3～4天后即见到单菌落，挑单菌落进行聚合酶链式反应鉴定按步骤7)方法进行，阳性菌落接种于含有100μg/ml利福平，50μg/ml卡那霉素的YMB液体培养基，28℃，250rpm，培养过夜，再对菌液进行聚合酶链式反应鉴定，确定阳性菌LBA9402-UG。16)转多糖合成双基因发根农杆菌侵染黄芪无菌苗接种发根农杆菌LBA9402-UG在含有100μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的YMB固体培养基上，28℃培养至单菌落长出，挑单菌落接种于加100μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的YMB液体培养基，28℃，250rpm，培养约40hr，按1％的接种比例将农杆菌接种于YMB液体培养基中，28℃，250rpm培养过夜，加适量乙酰丁香酮至终浓度50μM，再培养一天，无菌条件下，切取黄芪无菌苗的茎和叶片，在切口处接种悬浮培养过夜的转多糖合成双基因的发根农杆菌LBA9402-UG菌液OD600＝0.5，然后转移至MSOH固体培养基，25℃、黑暗条件下培养2天，无菌水洗涤外植体4～5次后，转移至含500mg/L凯福隆的固体MSOH培养基，25℃、黑暗条件下培养诱导产生毛状根。
全文摘要
本发明公开了一种内源基因超量表达技术提高黄芪甲苷含量的方法。本发明将多糖代谢途径的两个代谢反应偶连的关键酶基因ugp基因(尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因)和gbss基因(腺苷二磷酸葡萄糖苷转移酶基因)，经体外修饰，增加强化表达的调控元件，构建成功中间载体，通过电穿孔法将表达中间载体pBI－UG转入发根农杆菌LBA－9402，获得转多糖合成双基因的黄芪毛状根。其中黄芪甲苷的含量比未转基因的黄芪毛状根高6倍。
文档编号C12N15/09GK1699566SQ20051002602
公开日2005年11月23日 申请日期2005年5月20日 优先权日2005年5月20日
发明者杜旻, 胡之璧, 刘涤, 周吉燕, 王子艳, 倪跃元 申请人:上海中医药大学