利用MicroRNA156及其靶基因调控植物挥发油含量的方法
【专利摘要】本发明涉及利用MicroRNA156及其靶基因调控植物挥发油或其中倍半萜含量的方法。首次揭示一种调控植物挥发油或其中倍半萜类物质合成的关键基因——Squamosa启动子结合蛋白基因(SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE genes，SPLs)，该基因是miR156的靶基因。SPLs通过直接与倍半萜合酶启动子结合激活其转录；并通过转基因技术，证实该机制在多种植物中发挥作用，可基于此获得高产植物挥发油的植物。
【专利说明】利用Micr〇RNA156及其靶基因调控植物挥发油含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及利用MicroRNA156及 其靶基因调控植物挥发油或其中倍半萜含量的方法。
【背景技术】
[0002] 植物挥发油（精油）是具有一定挥发性的油状液体的统称，是植物芳香物质的提 取物。含挥发油的中草药非常多，亦多具芳香气味，尤以唇形科（薄荷、紫苏、藿香等）、伞 形科（茴香、当归、芫荽、白芷、川芎等）、菊科（艾叶、茵陈篙、苍术、白术、木香等）、芸香科 (橙、桔、花椒等）、樟科（樟、肉桂等）、姜科（生姜、姜黄、郁金等）等科更为丰富。植物挥 发油成分复杂，主要由萜类化合物构成，芳香族化合物次之，还包含少量的脂肪酸衍生物。 其中萜类化合物又分为单萜、倍半萜以及少量的二萜，常见的如薄荷中的薄荷酮、广藿香中 的广藿香醇等。挥发油大多具有抑菌杀毒、凝神静气、解热镇痛、矫味定香等作用，在医药、 食品、日化用品等方面应用广泛。目前植物挥发油的研究主要集中在提取工艺优化、化学成 分分析以及精油成分的生物活性研究等方面，挥发油合成途径的转录调控研究很少。
[0003] 模式植物拟南芥开花后，花序会释放以单萜和倍半萜为主的挥发性成分，其中 大部分倍半萜由TPS21和TPS11两个倍半萜合酶催化合成，其中TPS21主要催化法尼基 焦磷酸合成石竹烯，它们在拟南芥花器官特异表达，而在叶片中几乎不表达（Chen，F.等 (2003).The Plant celll5,481-494 ;Tholl,D.等（2005).The Plant journal:for cell and molecular biology42, 757-771)。推测植物发育因子在调控植物廠类合成的时空特异 性方面发挥重要作用。拟南芥中最近的研究表明SPL9通过破坏花青素合成的转录激活复 合体MYB-bHLH-WD40抑制了拟南芥中花青素的积累。
[0004] 广藿香（Pogostemon cablin)是唇形科多年生草本植物，所产生的广藿香精 油被广泛应用于香料及医疗行业。与其它唇形科植物产生的混合型精油不同，广藿香 精油主要是由倍半廠构成（Deguerry，F.等（2006) .Archives of biochemistry and biophysics454,123-136)。广藿香精油包含约 24 种倍半廠（Bur6，C.M.等（2004). Journal of Essential Oil Researchl6，17_19)，其中广藿香醇（(-)-patchoulol)约占 35%，是其 重要组分。广藿香醇香味持久、独特宜人是良好的定香剂，目前作为天然香料被广泛用于日 化产品中。此外，广藿香醇还具有抑制真菌繁殖，驱除和毒杀白蚁的作用。广藿香醇合酶 (patchoulol synthase，PTS)是一个多功能酶，负责合成广藿香叶片提取物中广藿香醇以 及其它13种倍半廠产物（Deguerry et al. ,2006)。
[0005] 本领域有必要对植物挥发油在植物中等产生机制进行有效研究，并基于此改进植 物中植物挥发油有效成分的含量。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供利用Micr〇RNA156及其靶基因调控植物挥发油或其中倍 半萜含量的方法。
[0007] 在本发明的第一方面，提供一种调节植物（如芳香植物）挥发油或其中的倍半萜 含量的方法，所述方法包括：调节植物中Squamosa启动子结合蛋白基因的表达。
[0008] 在一个优选例中，所述的调节植物中Squamosa启动子结合蛋白基因的表达是：上 调植物中Squamosa启动子结合蛋白基因的表达，从而提高植物挥发油或其中的倍半萜含 量。
[0009] 在另一优选例中，所述的上调植物中Squamosa启动子结合蛋白基因的表达包括： 将Squamosa启动子结合蛋白基因转化植物，获得过表达Squamosa启动子结合蛋白基因的 转基因植物，所述的转基因植物的挥发油或其中倍半萜含量提高。
[0010] 在另一优选例中，所述的将Squamosa启动子结合蛋白基因转化植物包括：
[0011] (a)提供携带表达载体的农杆菌，所述表达载体中含有构建物，所述的构建物含有 Squamosa启动子结合蛋白基因的表达盒；
[0012] (b)将植物细胞、组织或器官与步骤（a)中的农杆菌接触，从而使所述的构建物转 入植物。
[0013] 在另一优选例中，所述方法还包括：
[0014] (c)选择出转入了所述构建物的植物细胞、组织或器官；以及
[0015] (d)将步骤（c)中的植物细胞、组织或器官再生成植物。
[0016] 在另一优选例中，所述的Squamosa启动子结合蛋白基因（SPL)是miR156祀向的 Squamosa 启动子结合蛋白基因；更佳地，选自：SPL3，SPL4，SPL5，SPL9，SPL15，SPL2，SPL10， SPL11, SPL6, SPL13A, SPL13B。
[0017] 在另一优选例中，所述的SPL9基因选自：(a)At2g42200所示核苷酸序列的多核苷 酸；或（b)核苷酸序列在严格条件下能够与（a)限定的多核苷酸序列杂交且编码的蛋白具 有At2g42200编码的蛋白同样功能的多核苷酸；（c)核苷酸序列与（a)限定的多核苷酸序 列有70%以上（较佳地80%以上；更佳地90%以上；更佳地95%以上；更佳地99%以上）相 同性且编码的蛋白具有At2g42200编码的蛋白同样功能的多核苷酸。
[0018] 在另一优选例中，所述的SPL10基因选自：（a'）ATlG27370所示核苷酸序列的多核 苷酸；或（b'）核苷酸序列在严格条件下能够与（a'）限定的多核苷酸序列杂交且编码的蛋 白具有AT1G27370编码的蛋白同样功能的多核苷酸；(c'）核苷酸序列与（a'）限定的多核 苷酸序列有70%以上（较佳地80%以上；更佳地90%以上；更佳地95%以上；更佳地99%以 上）相同性且编码的蛋白具有AT1G27370编码的蛋白同样功能的多核苷酸。
[0019] 在另一优选例中，所述的上调植物中Squamosa启动子结合蛋白基因的表达包括： 将下调miR156表达的抑制分子转化植物，通过下调miR156来上调Squamosa启动子结合蛋 白基因的表达，获得的转基因植物的挥发油或其中倍半萜含量提高。
[0020] 在另一优选例中，所述的下调miR156表达的抑制分子是MM156或其活性片段 (发挥抑制作用的关键位点片段）；较佳地，所述的Μ頂156的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所 示，所述的MM156的活性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2中第237-256位所示。
[0021] 在另一优选例中，所述的调节植物中Squamosa启动子结合蛋白基因的表达是：下 调植物中Squamosa启动子结合蛋白基因的表达，从而降低植物挥发油或其中倍半萜含量。
[0022] 在另一优选例中，所述的下调植物中Squamosa启动子结合蛋白基因的表达包括： 将Squamosa启动子结合蛋白基因的表达抑制分子转化植物，获得Squamosa启动子结合蛋 白基因表达受抑制的转基因植物，所述的转基因植物的挥发油或其中倍半萜含量降低。
[0023] 在另一优选例中，所述的Squamosa启动子结合蛋白基因的表达抑制分子是 miR156f ;较佳地，所述的miR156f具有SEQ ID NO: 1中第82-101位所示核苷酸序列；所述 的miR156f前体具有SEQ ID NO: 1或其中第82-171位所示核苷酸序列。
[0024] 在另一优选例中，所述的植物包括（但不限于）：十字花科植物（如拟南芥），唇形 科植物（如广藿香，薄荷，罗勒），伞形科植物，菊科植物，芸香科植物，樟科植物，姜科植物， 禾本科植物，茄科植物。
[0025] 在另一优选例中，所述的倍半萜包括（但不限于）：石竹烯，广藿香醇，广藿香 烯，广藿香烯，α-广藿香烯，β-榄香烯，α-愈创木烯，4, 11-愈创木二烯，α-布藜 烯。
[0026] 在本发明的另一方面，提供Squamosa启动子结合蛋白的用途，用于提高植物挥发 油或其中倍半萜含量。
[0027] 在本发明的另一方面，提供下调miR156表达的抑制分子的用途，用于提高植物挥 发油或其中倍半萜含量。
[0028] 在一个优选例中，所述的下调miR156表达的抑制分子是MM156或其活性片段；较 佳地，所述的MM156的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，所述的MM156的活性片段的核苷 酸序列如SEQ ID N0: 2中第237-256位所示。
[0029] 在本发明的另一方面，提供Squamosa启动子结合蛋白基因的表达抑制分子的用 途，用于降低植物挥发油或其中倍半萜含量。
[0030] 在一个优选例中，所述的Squamosa启动子结合蛋白基因的表达抑制分子是 miR156f ;较佳地，所述的miR156f具有SEQ ID NO: 1中第82-101位所示核苷酸序列；所述 的miR156f前体具有SEQ ID NO: 1或其中第82-171位所示核苷酸序列。
[0031] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【专利附图】
【附图说明】
[0032] 图l、miR156f、rSPLs (以SPL10为例）的双元植物表达载体构建示意图。
[0033] A、截取miR156f基因组中包含前体序列（下划线标出）共计276bp长的片段构建 Pro35S:MIR156f 双元载体。
[0034] B、将SPL10基因 cDNA中miR156靶位点的核苷酸序列进行同义突变。单下划线： SPL10基因中原始miR156靶位点的核苷酸序列；方框：靶位点的核苷酸序列对应的氨基酸 序列；黑色：SPL10基因中miR156靶位点突变后的核苷酸序列。
[0035] C、PCR突变SPL10中miR156靶位点的核苷酸序列示意图。P1(S)和P2(AS)为片 段全长序列。P3(AS)为突变位点上游反向引物。P4引物5'端15-20bp与引物P3互补，3' 端20bp左右与突变位点下游序列互补，中部为突变后序列。
[0036] 图 2、TPS21 受 miR156 调控。其中，thujopsene :罗汉柏烯； trans-β -Caryophyllene (Caryophyllene):石竹烯；n-Nonyl acetate :乙酸壬酉旨。
[0037] A 和 B、GC-MS 检测 Pro35S:MIR156 和 Pro35S:MIM156 植物花序中倍半萜含量。** 代表P〈0. 01，*代表P〈0. 05,即与野生型拟南芥相比具有显著差异。
[0038] C、Pro35S:MIR156 和 Pro35S:MIM156 植物花序中 TPS21、TPS11 表达水平 qRT-PCR 检测。
[0039] 图3、miR156靶基因 SPLs激活TPS21表达。
[0040] A、qRT-PCR 检测 TPS21 在 Pro35S:rSPL3、ProSPL9:rSPL9、Pro35S:rSPL10 花序中 表达。
[0041] B、qRT-PCR 检测 TPS21 在诱导体系 ProAlcA:MIR156f 和 ProSPL9:rSPL9-GR 植物 中的瞬时表达水平。
[0042] C-E、ProTPS21:⑶S 在野生型（C)、Pro35S:MIR156(D)、Pro35S:MIM156(E)背景下 花序的⑶S染色结果。Bar=lcm。
[0043] 图4、SPL9直接结合TPS21启动子。
[0044] A、TPS21上游1376bp片段包含SPL蛋白结合位点GTAC(以黑色三角标注）示意图。 cisl、cis2、cis3代表用于EMSA实验的3个片段；I、II、III、IV代表ChIP实验中Real-time 扩增片段位置。
[0045] B、体外EMSA验证SPL9与TPS21启动子结合。上行是不同浓度HIS - SPL9融合蛋 白（0、30、90ng)分别与Cy5标记的cisl、cis2、cis3以及负对照kasO启动子片段结合实 验；下行是cisl、cis3分别与各自未标记的冷探针的竞争实验。
[0046] C、体内ChIP富集实验证明GFP-rSPL9蛋白结合TPS21启动子。收集生长4周的 Pr〇SPL9:GFP-rSPL9和野生型对照的花序作为ChIP实验材料。TPS21启动子不同区域富集 倍数计算：首先以GFP抗体沉淀得到DNA中基因丰度比加 HA抗体沉淀得到DNA中基因丰 度，再以ProSPL9: GFP-rSPL9植物中该比值比野生型植物中该比值。
[0047] 图5、转基因广藿香阳性植株筛选。
[0048] A、qRT_PCR检测SPL10在Pro35S:rSPL10叶片中表达。以空质粒转基因广藿香为 对照组，以广藿香Patl8S(EF529587)作为内标基因。"L+数字"表示相应转基因株系中不 同植株编号，后续同。
[0049] B、qRT-PCR检测Pro35S:MIR156转基因广藿香叶片中成熟miR156水平。以空质 粒转基因广藿香为对照组，以广藿香Patl8S(EF529587)作为内标基因。
[0050] 图6、转基因广藿香阳性植株中PTS表达水平检测。
[0051] A、qRT_PCR检测PTS在Pro35S:rSPL10叶片中表达。以空质粒转基因广藿香为对 照组，以广藿香Patl8S(EF529587)作为内标基因。
[0052] B、qRT_PCR检测Pro35S:MIR156转基因广藿香叶片中PTS水平。以空质粒转基因 广藿香为对照组，以广藿香Patl8S(EF529587)作为内标基因。
[0053] 图7A-B、miR156靶向的SPL基因调控广藿香精油成分的合成。n-Nonyl acetate :乙酸壬酯；β -patchoulene : β -广藿香烯；β -elemene : β -榄香烯； trans-β -caryophyllene ：石竹烯；a -guaiene : α -愈创木烯；a -patchoulene : α -广藿香烯；γ -patchoulene : γ -广藿香烯；guai-4, 11-diene :4, 11-愈创木二烯； a-bulnesene : α -布藜烯；（-)-patchoulol :广藿香醇；pogostone :广藿香酮。
[0054] 图8、一月大T1代转基因广藿香叶片中PTS表达水平和广藿香醇含量检测。
[0055] A、qRT-PCR 检测 PTS 在 Pro35S:rSPL10 和 Pro35S:MIR156f 转基因植物叶片中表 达。空质粒转基因广藿香为对照组，广藿香Patl8S(EF529587)作为内标基因。
[0056] B、Pro35S:rSPL10、空质粒、Pro35S:MIR156f叶片中广藿香醇含量检测。首先与内 标相比，然后除以样品鲜重，得出百分比。#代表P〈0. 01/代表P〈0. 05,即与空质粒转基因 广藿香相比具有显著差异。
[0057] 图9、扫描电镜检测广藿香叶片表皮毛。
[0058] A、广藿香叶片三种表皮毛：非腺毛（左）、头状腺毛（中）、盾状腺毛（右）扫描电 镜图。
[0059] B-C、广藿香近轴面B和远轴面C叶片表皮毛扫描电镜图。
[0060] D、广藿香近轴面和远轴面叶片表皮毛密度统计结果。**代表P〈0. 01，*代表 P〈0. 05,即与空质粒转基因广藿香相比具有显著差异。
【具体实施方式】
[0061] 本发明人经过深入的研究，首次揭示一种调控植物挥发油或其中倍半萜类物 质合成的关键基因-Squamosa启动子结合蛋白基因 （SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE genes，SPL(s))，该基因是miR156的靶基因。SPL通过直接与倍半萜合酶启 动子结合激活其转录；并通过转基因技术，证实该机制在多种植物（包括香料植物）中发挥 作用，可基于此获得高产植物挥发油的植物。
[0062] 如本文所用，所述的"植物"包括但不限于：十字花科植物、唇形科植物等。比如， 所述的"植物"包括但不限于：十字花科鼠耳芥属植物如拟南芥（Arabidopsis thaliana)， 唇形科广霍香属植物如广藿香（Pogostemoncablin)。较佳地，所述的"植物"为香料植物， 例如但不限于唇形科薄荷和罗勒、禾本科的柠檬香茅、茄科的番茄等。所述的植物适合进行 基因的转化操作。
[0063] 本发明人以拟南芥为模式植物，发现拟南芥miR156靶基因 SPL9直接结合TPS21 启动子，并激活TPS21转录，从而使TPS21催化产物石竹烯成为拟南芥花序的主要挥发成 分，含量翻倍。广藿香（学名Pogostemon cablin)是唇形科植物，多年生草本直立植物，有 香气；拟南芥miR156靶基因 SPL10能够提高广藿香中PTS转录水平，从而提高了广藿香精 油重要组分广藿香醇及大部分倍半萜成分的含量（如广藿香醇及其他8种PTS催化的倍半 萜产物）。本发明的研究结果提示，miR156靶基因 SPLs同样调控了十字花科（拟南芥）和 唇形科（广藿香）的其他香料作物，甚至伞形科、菊科、芸香科、樟科、姜科等的作物中植物 挥发油含量，提供了通过基因工程改进作物中植物挥发油含量的方法。
[0064] 在本发明中，"Squamosa启动子结合蛋白（SPL) "指具有提高植物挥发油或其中倍 半萜含量功能的多肽。较佳地，所述的SPL是编码基因受到miR156调控的一类SPL。例如， 拟南芥中，miR156可调控11个SPL靶基因，进一步分为SPL3/4/5，SPL9/15，SPL2/10/ll和 SPL6/13A/B共4个分枝。作为本发明的优选方式，所述的SPL是SPL9或SPL10 ;所述的SPL9 可以具有At2g42200所示核苷酸序列或其同源序列、衍生物或变异体；所述的SPL10可以具 有AT1G27370所示核苷酸序列或其同源序列、衍生物或变异体。
[0065] 本发明还包括具有与SPL蛋白相同功能的、SPL蛋白的变异形式。这些变异形式包 括（但并不限于）：若干个（通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10 个，还更佳如1-8个、1-5个）氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端 添加或缺失一个或数个（通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内）氨基 酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功 能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。 该术语还包括SPL蛋白的活性片段和活性衍生物。
[0066] 本发明还包括SPL蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语"片段"、"衍生 物"和"类似物"是指基本上保持本发明的SPL蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发 明的多肽片段、衍生物或类似物可以是（i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基（优 选保守性氨基酸残基）被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗 传密码编码的，或（ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽。根据本文的定义 这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0067] 任何一种SPL蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，SPL蛋白的生 物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的SPL蛋白的全部或部分功能。 通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50%的全长SPL蛋白的活性。在更优选的条件 下，所述活性片段能够保持全长SPL蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。 [0068] 多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突 变体、在高或低的严紧度条件下能与SPL蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗 SPL蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含SPL蛋白或其片段 的融合蛋白。
[0069] 任何与所述的SPL蛋白同源性高（比如与SEQ ID N0:2所示的序列的同源性为 70%或更高；优选的，同源性为80%或更高；更优选的，同源性为90%或更高，如同源性95%， 98%或99%)的、且具有SPL蛋白相同功能的蛋白也包括在本发明内。
[0070] 本发明还涉及编码本发明SPL蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。所述的 多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。 DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。术语"编码多肽的多核苷酸 (编码基因）"可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编 码序列的多核苷酸。
[0071] 本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多 肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或 非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本 领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、 缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
[0072] 本发明还包括与本发明的核苷酸序列具有70%以上，更优选80%以上，更优选90% 以上，最优选95%以上相同性的核酸，所述核酸也具有SEQ ID NO: 1所示序列相同的调控作 用。"相同性"是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平（即序列同源 性、相似性或同一'I"生）。
[0073] 应理解，虽然本发明的SPL基因优选获自十字花科植物，但是获自其它植物的与 拟南芥SPL基因高度同源（如具有70%以上，如80%，85%、90%、95%、甚至98%序列相同性） 的其它SPL基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周 知的，例如BLAST。
[0074] 本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或SPL基因工程产 生的宿主细胞。
[0075] SPL基因可插入到重组表达载体中。术语"重组表达载体"指本领域熟知的细菌质 粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主 体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起 点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
[0076] 包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适 当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等 真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌 属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。
[0077] 所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会 使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于 启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强 子和宿主细胞。
[0078] 用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物 可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转 化的植物组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得植物挥发油性状发生改变的植 物。
[0079] 本发明的SPL基因可由组织特异启动子驱动，特异性表达。所述的特异启动子可 以是外源（异源）的。对所述特异启动子的核酸序列没有特别的限制（如一种结构性核酸 序列），例如某些在农业或植物改良上具有重要器官特异性的启动子。
[0080] 用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物也 可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转 化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。
[0081] 作为一种方式，制备转基因植物的方法是：将携带启动子序列和目的基因（可操 作地连接）的表达载体转入农杆菌，农杆菌再将含启动子和目的基因的载体片段整合到植 物的染色体上。涉及的转基因受体植物例如是拟南芥，广藿香。
[0082] 本发明提供了所述的SPL蛋白或SPL基因的用途，用于提高植物挥发油或其中倍 半萜含量。
[0083] 本发明还涉及SPL的上调剂或下调剂及其用途。由于SPL的上调剂或下调剂可调 节SPL的表达和/或调节SPL的活性等，因此，所述的SPL的上调剂或下调剂也可通过对 SPL的影响来调节植物挥发油或其中倍半萜含量，从而达到改良植物的目的。
[0084] 任何可提高SPL蛋白的活性、提高SPL蛋白的稳定性、促进SPL蛋白的表达、延长 SPL蛋白有效作用时间、或促进SPL的转录和翻译的物质均可用于本发明，用于提高植物挥 发油或其中倍半萜含量。任何可降低SPL蛋白的活性、降低SPL蛋白的稳定性、抑制SPL蛋 白的表达、减少SPL蛋白有效作用时间、或降低SPL的转录和翻译的物质均可用于本发明， 作为SPL的下调剂、拮抗剂或抑制剂（即：下调SPL蛋白表达的物质），如抗所述SPL蛋白 的抗体，干扰所述SPL蛋白的编码基因表达的干扰分子（如可形成microRNA的干扰分子）。 所述的下调剂、拮抗剂或抑制剂可用于通过下调SPL的表达，降低植物挥发油或其中倍半 萜含量。在得知了靶序列后，制备干扰特定基因表达的干扰分子的方法是本领域人员熟知 的。
[0085] 本发明还涉及一种改良植物的方法，该方法包括调节所述植物中SPL基因的表 达。
[0086] -方面，本发明还提供了一种提高植物挥发油或其中倍半萜含量的方法，所述的 方法包括：上调所述植物中SPL基因的表达（包括使SPL基因过表达）。
[0087] 在得知了所述的SPL蛋白的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节 所述的SPL蛋白的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带SPL基因的表达单位 (比如表达载体或病毒等）递送到靶点上，并使之表达活性的SPL蛋白。
[0088] 此外，也可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低SPL基因的表达或使之缺失 表达，比如将靶向SPL基因的miRNA或携带反义SPL基因的表达单位（比如表达载体或病 毒等）递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达SPL基因。
[0089] 作为本发明的一种实施方式，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：（1)将外 源的SPL基因转入植物组织、器官或组织，获得转化入SPL基因的植物细胞、组织、器官或种 子；和（2)将步骤（1)获得的转入了外源SPL基因的植物组织、器官或种子再生成植物植 株。
[0090] 作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：（si)提供携带表达载体的农杆菌， 所述的表达载体含有SPL基因；（s2)将植物组织、器官与步骤（si)中的农杆菌接触，从而 使SPL基因转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；（s3)选择出转入SPL基因的 植物细胞、组织、器官或种子；以及（s4)将步骤（s3)中的植物细胞、组织、器官或种子再生 成植物。
[0091] 作为另一种优选方式，鉴于SPL基因是miR156的靶基因，可通过下调miR156来上 调SPL基因的表达。可下调miR156的抑制分子例如是MM156。
[0092] 其它增加 SPL基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强 启动子驱动从而增强SPL基因或其同源基因的表达。或者通过增强子（如水稻waxy基因 第一内含子、Actin基因第一内含子等）来增强该SPL基因的表达。适用于本发明方法的 强启动子包括但不限于：35s启动子，水稻、玉米的Ubi启动子等。
[0093] 优选的，还提供了一种降低植物中SPL基因的表达的方法，所述的方法包括：（1) 将SPL基因表达抑制分子转入植物组织、器官或种子，获得转化入所述表达抑制分子的植 物组织、器官或种子；（2)将步骤（1)获得的转入了所述表达抑制分子的植物组织、器官或 种子再生成植物。较佳地，所述的表达抑制分子是miR156f。
[0094] 本发明还包括利用前述任一种方法获得的植物，所述的植物包括：转入了 SPL基 因或其同源基因的转基因植物；或者SPL蛋白表达量（包括低表达或不表达）降低的植物 等。
[0095] 可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。
[0096] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0097] 实施例1、拟南芥miR156和SPL10基因的分离
[0098] 依据拟南芥信息资源网站（The Arabidopsis Information Resource，TAIR)网站 上AT5G26147(miR156f)的基因组序列信息，序列是（SEQ ID N0:1) :TGGCTAGGGTTTATAGATG TATGTGATATTAAGAGATATGAAACATATTTGTCGACGGTTTGAGTGGTGAGGAATTGATGGTGACAGAAGAGAGTG AGCACACATGGTGGCTTTCTTGCATATTTGAAGGTTCCATGCTTGAAGCTATGTGTGCTCACTCTCTATCCGTCACC CCCTTCTCTCCCTCTCCCTCTCTCTCTCTCTCTCTACAGCATTTCATTTAGTTTTTAGAGTTAAACATTTTGATTTT GATTTTTACATCCATTCTTTTGGTTT。
[0099] 合成引物 miR156-F-BamHI、miR156-R-SacI，PCR 扩增得到拟南芥 miR156f 基因组 部分序列（图ΙΑ);根据AT1G27370(SPL10)序列信息，合成引物SPL10-F、SPL10-R，PCR扩增 得到编码拟南芥 SQUMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN LIKE 基因 SPL10 序列。将 miR156f 和SPL10的PCR扩增片段ΤΑ克隆到pMD18-T载体中，测序正确后作为模板。
[0100] 表1、载体构建及qRT-PCR引物列表
[0101]
【权利要求】
1. 一种调节植物挥发油或其中的倍半萜含量的方法，其特征在于，所述方法包括：调 节植物中Squamosa启动子结合蛋白基因的表达。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的调节植物中Squamosa启动子结合蛋 白基因的表达是：上调植物中Squamosa启动子结合蛋白基因的表达，从而提商植物挥发油 或其中的倍半萜含量。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的上调植物中Squamosa启动子结合蛋 白基因的表达包括：将Squamosa启动子结合蛋白基因转化植物，获得过表达Squamosa启动 子结合蛋白基因的转基因植物，所述的转基因植物的挥发油或其中倍半萜含量提高。
4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的上调植物中Squamosa启动子结合 蛋白基因的表达包括：将下调miR156表达的抑制分子转化植物，通过下调miR156来上调 Squamosa启动子结合蛋白基因的表达，获得的转基因植物的挥发油或其中倍半萜含量提 商。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的下调miR156表达的抑制分子是 MM156或其活性片段；较佳地，所述的MM156的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，所述的 MM156的活性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2中第237-256位所示。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的调节植物中Squamosa启动子结合蛋 白基因的表达是：下调植物中Squamosa启动子结合蛋白基因的表达，从而降低植物挥发油 或其中倍半萜含量。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的下调植物中Squamosa启动子结合 蛋白基因的表达包括：将Squamosa启动子结合蛋白基因的表达抑制分子转化植物，获得 Squamosa启动子结合蛋白基因表达受抑制的转基因植物，所述的转基因植物的挥发油或其 中倍半萜含量降低。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的Squamosa启动子结合蛋白基因的表 达抑制分子是miR156f ;较佳地，所述的miR156f具有SEQ ID NO: 1中第82-101位所示核 苷酸序列；所述的miR156f前体具有SEQ ID NO: 1或其中第82-171位所示核苷酸序列。
9. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物包括：十字花科植物，唇形科植 物，伞形科植物，菊科植物，芸香科植物，樟科植物，姜科植物，禾本科植物，茄科植物。
10. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的倍半萜包括：石竹烯，广藿香醇， β -广藿香烯，Y -广藿香烯，α -广藿香烯，β -榄香烯，α -愈创木烯，4, 11-愈创木二烯， α -布藜烯。 11. Squamosa启动子结合蛋白的用途，用于提高植物挥发油或其中倍半萜含量。
12. 下调miR156表达的抑制分子的用途，用于提高植物挥发油或其中倍半萜含量。
13. 如权利要求12所述的用途，其特征在于，所述的下调miR156表达的抑制分子是 MM156或其活性片段；较佳地，所述的MM156的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，所述的 MM156的活性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2中第237-256位所示。 14. Squamosa启动子结合蛋白基因的表达抑制分子的用途，用于降低植物挥发油或其 中倍半萜含量。
15. 如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述的Squamosa启动子结合蛋白基因的 表达抑制分子是miR156f;较佳地，所述的miR156f具有SEQ ID N0:1中第82-101位所示 核苷酸序列；所述的miR156f前体具有SEQ ID NO: 1或其中第82-171位所示核苷酸序列。
【文档编号】C12N15/113GK104232655SQ201310237889
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月14日 优先权日:2013年6月14日
【发明者】陈晓亚, 于宗霞, 王凌健, 王佳伟 申请人:中国科学院上海生命科学研究院