专利名称：一种抗凝血水蛭肽的酶解制备方法
技术领域：
本发明涉及生物活性肽的酶解制备领域，具体涉及一种抗凝血水蛭肽的酶解制备方法。
背景技术：
菲牛蛭，俗称金边蚂蟥、蟥蜞、牛蜞，广泛分布于我国长江以南特别是广东、广西和海南等地区，是一味经典的传统中药，有破血、逐瘀、通经的功效，用于治疗症瘕痞块、血瘀闭经、跌打损伤等病症。李时珍的《本草纲目》记载咸走血，苦胜血；水蛭之咸苦，以除蓄血，乃肝经血分药，故能通肝经聚血。菲牛蛭主要成分为胶原蛋白，还含有少量脂肪酸和微量矿物质。现代科学研究表明，菲牛蛭发挥药效的物质基础是其体内的天然水蛭素，而天然水蛭素是迄今为止所发现的物质中最强的特异性天然抗凝血物质，对人类心脑血管疾病尤其是脑血栓等血栓性疾病有特效，然而水蛭素是一种分泌型生物活性物质，仅存在于菲牛蛭头部的唾液腺及其所分泌的唾液中。长期以来，国内对天然水蛭素的提取、分离研究难以有所突破，大都是取水蛭头部加有机溶剂提取、或整体捣碎成泥浆状后加溶剂提取、或活体生理盐水提取、或用机械方法从吸饱血后的水蛭中挤出血浆提取，然后经复杂的分离纯化方法得到水蛭素粗品。这些方法存在提取收率低、原料浪费、纯度低、工艺复杂、周期长、成本过高等的缺点。因此，现在国内市场上销售的各种天然水蛭素纯度、活性水平层次不齐， 而且价格非常昂贵，不利于水蛭素类抗凝血活性物质在医药领域的应用。正是基于目前产品价格高和活性低等情况，迫切需要开发一种能够降低成本、简单可行的制备方法。由于水蛭素是由菲牛蛭的唾液腺分泌而来，因此在菲牛蛭躯体胶原蛋白中必然含有抗凝血活性的功能区片段。于是采取可控酶解的方法，通过生物蛋白酶对菲牛蛭躯体胶原蛋白的催化水解作用，就有可能把其中所隐藏的抗凝血的功能区肽片段释放出来，从而制备出具有抗凝血活性的肽。目前，国内外对于生物活性肽的开发极为活跃，已从蛋白质水解液中分离出了高F值寡肽、ACE抑制肽、醒酒肽、抗氧化肽等。可以说，酶解制备抗凝血活性肽具有十分广阔的前景和重大的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种抗凝血水蛭肽的酶解制备方法，本发明方法能够实现原料的多重利用，并具有高活性、反应条件温和、环境友好、反应过程简单可控的生物催化剂制备抗凝血肽的新方法。本发明的目的通过如下技术方案实现
一种抗凝血水蛭肽的酶解制备方法，包括如下步骤取冷藏时间不超过Mh的新鲜菲牛蛭，加入水中勻浆，水和该菲牛蛭的重量比为广6:1，将勻浆液以lOOOOr/min高速离心 IOmin后，过滤沉淀，按沉淀与水的用量之比为3 15g:100ml混合于反应器中，控制pH值为7. 0 10. 0，再加入碱性蛋白酶为生物催化剂，该碱性蛋白酶与菲牛蛭躯体中胶原蛋白的重量之比为1 8:100，反应温度为40 70 °C、振荡速度为100 300 rpm、反应1 5h后，冷冻干燥，即可得到所需抗凝血水蛭肽粉。所述勻浆时，加入的水与菲牛蛭的重量比为广4:1。所述菲牛蛭躯体胶原蛋白与水的用量之比为6 12g: IOOml0所述碱性蛋白酶与菲牛蛭躯体胶原蛋白的重量之比为2 6:100。所述反应温度控制在50 70 °C。所述反应体系pH值控制为7. 5 9.0。所述反应器振荡速度为100 200 rpm。所述反应时间控制在1 池。本发明的原理在碱性条件下，以水解酶作为催化剂，催化菲牛蛭躯体胶原蛋白进行水解反应，得到抗凝血水蛭肽。与现有的技术相比，本发明具有如下的优点和有益效果
(1)对菲牛蛭勻浆液离心后所得上清液用来提取天然水蛭素，而对沉淀的躯体胶原蛋白酶解，避免了以往提取水蛭素过程中对菲牛蛭躯体原料的浪费，从而实现原料的多重利用。(2)用蛋白酶对新鲜菲牛蛭躯体胶原蛋白进行酶解，可以借助生物催化功能打开菲牛蛭躯体胶原蛋白中隐藏的抗凝血活性位点，得到抗凝血肽片段，反应过程简单可控、产物易分离；
(3)整个制备过程中，反应条件温和，未使用有机试剂，无含碱废液排放，环境友好。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。实施例1
取冷藏时间不超过Mh的新鲜菲牛蛭，加4倍水混合于打浆机中勻浆，将勻浆液 10000r/min离心lOmin，上清液冷藏备用，称取9g沉淀和100 ml水混合于三角瓶中，调pH 至8. O JnAAlcalase 2. 4L酶(碱性蛋白酶，诺维信公司生产)，置于55°C、150 rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应1. 5h后，在90°C水浴锅中灭酶lOmin，冷却后调pH至7. 0，冷冻干燥后可得到抗凝血活性大于500AT-U/g的抗凝血水蛭肽粉。实施例2
取冷藏时间不超过Mh的新鲜菲牛蛭，加3倍水混合于打浆机中勻浆，将勻浆液 10000r/min离心lOmin，上清液冷藏备用，称取12g沉淀和100 ml水混合于三角瓶中，调pH 至8. 5，加入Alcalase2. 4L酶，置于55°C、150 rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应2h后，在 90°C水浴锅中灭酶lOmin，冷却后调pH至7. 0，冷冻干燥后可得到抗凝血活性大于600AT-U/ g的抗凝血水蛭肽粉。实施例3
取冷藏时间不超过Mh的新鲜菲牛蛭，加2倍水混合于打浆机中勻浆，将勻浆液 10000r/min离心lOmin，上清液冷藏备用，称取15g沉淀和100 ml水混合于三角瓶中，调 pH至9. 0，加入Alcalase2. 4L酶，置于55°C、150 rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应2. 5h后，在90°C水浴锅中灭酶lOmin，冷却后调pH至7. 0，冷冻干燥后可得到抗凝血活性大于 600AT-U/g的抗凝血水蛭肽粉。实施例4
取冷藏时间不超过Mh的新鲜菲牛蛭，加4倍水混合于打浆机中勻浆，将勻浆液 10000r/min离心lOmin，上清液冷藏备用，称取9g沉淀和100 ml水混合于三角瓶中，调pH 至8. 5，加入Alcalase2. 4L酶，置于60°C、150 rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应2. 5h 后，在90°C水浴锅中灭酶lOmin，冷却后调pH至7. 0，冷冻干燥后可得到抗凝血活性大于 600AT-U/g的抗凝血水蛭肽粉。实施例5
取冷藏时间不超过Mh的新鲜菲牛蛭，加3倍水混合于打浆机中勻浆，将勻浆液 10000r/min离心lOmin，上清液冷藏备用，称取12g沉淀和100 ml水混合于三角瓶中，调pH 至9. 0，加入Alcalase2. 4L酶，置于60°C、150 rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应2h后，在 90°C水浴锅中灭酶lOmin，冷却后调pH至7. 0，冷冻干燥后可得到抗凝血活性大于600AT-U/ g的抗凝血水蛭肽粉。实施例6
取冷藏时间不超过Mh的新鲜菲牛蛭，加4倍水混合于打浆机中勻浆，将勻浆液 10000r/min离心lOmin，上清液冷藏备用，称取15g沉淀和100 ml水混合于三角瓶中，调pH 至8. 0，加入Alcalase2. 4L酶，置于60°C、150 rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应2h后，在 90°C水浴锅中灭酶lOmin，冷却后调pH至7. 0，冷冻干燥后可得到抗凝血活性大于600AT-U/ g的抗凝血水蛭肽粉。实施例7
取冷藏时间不超过Mh的新鲜菲牛蛭，加3倍水混合于打浆机中勻浆，将勻浆液 10000r/min离心lOmin，上清液冷藏备用，称取9g沉淀和100 ml水混合于三角瓶中，调pH 至9. 0，加入Alcalase2. 4L酶，置于65°C、150 rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应2h后，在 90°C水浴锅中灭酶lOmin，冷却后调pH至7. 0，冷冻干燥后可得到抗凝血活性大于550AT-U/ g的抗凝血水蛭肽粉。实施例8
取冷藏时间不超过Mh的新鲜菲牛蛭，加4倍水混合于打浆机中勻浆，将勻浆液 10000r/min离心lOmin，上清液冷藏备用，称取12g沉淀和100 ml水混合于三角瓶中，调 pH至8. 0，加入Alcalase2. 4L酶，置于65°C、150 rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应2. 5h 后，在90°C水浴锅中灭酶lOmin，冷却后调pH至7. 0，冷冻干燥后可得到抗凝血活性大于 550AT-U/g的抗凝血水蛭肽粉。实施例9
取冷藏时间不超过Mh的新鲜菲牛蛭，加3倍水混合于打浆机中勻浆，将勻浆液 10000r/min离心lOmin，上清液冷藏备用，称取15g沉淀和100 ml水混合于三角瓶中，调 pH至8. 5，加入Alcalase2. 4L酶，置于65°C、150 rpm的水浴恒温振荡器内振荡，反应1. 5h 后，在90°C水浴锅中灭酶lOmin，冷却后调pH至7. 0，冷冻干燥后可得到抗凝血活性大于 500AT-U/g的抗凝血水蛭肽粉。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种抗凝血水蛭肽的酶解制备方法，其特征在于，包括如下步骤取冷藏时间不超过24h的新鲜菲牛蛭，加入水中勻浆，水和该菲牛蛭的重量比为广6:1，将勻浆液以IOOOOr/ min高速离心IOmin后，过滤沉淀，按沉淀与水的用量之比为3 15g: IOOml混合于反应器中，控制PH值为7. 0 10. 0，再加入碱性蛋白酶为生物催化剂，该碱性蛋白酶与菲牛蛭躯体中胶原蛋白的重量之比为1 8:100，反应温度为40 70 °C、振荡速度为100 300 rpm、反应1 证后，冷冻干燥，即可得到所需抗凝血水蛭肽粉。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述勻浆时，加入的水与菲牛蛭的重量比为广4:1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述菲牛蛭躯体胶原蛋白与水的用量之比为6 12g: 100ml。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶与菲牛蛭躯体胶原蛋白的重量之比为2 6:100。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反应温度控制在50 70°C。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反应体系PH值控制为7.5 9. 0。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反应器振荡速度为100 200rpm 。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述反应时间控制在1 池。
全文摘要
本发明公开了一种抗凝血水蛭肽的酶解制备方法，包括取冷藏时间不超过24h的新鲜菲牛蛭，加入水中匀浆，水和菲牛蛭的重量比为1~6:1，匀浆液以10000r/min高速离心10min后，过滤沉淀，按沉淀与水的用量之比为3～15g:100ml混合于反应器中，控制pH值为7.0～10.0，再加入碱性蛋白酶，该碱性蛋白酶与菲牛蛭躯体中胶原蛋白的重量之比为1～8:100，反应温度为40～70℃、振荡速度为100～300rpm、反应1～5h后，冷冻干燥，即可。本发明突破天然水蛭素类抗凝血活性物质来源的局限性，实现了原料的多重利用，具有产品活性高、反应条件温和、环境友好、反应过程简单可控等优点。
文档编号C12P21/06GK102277407SQ201110242019
公开日2011年12月14日 申请日期2011年8月23日 优先权日2011年8月23日
发明者吴晖, 赖富饶, 钟超 申请人:华南理工大学