专利名称：GeXP多重基因表达遗传分析系统在9种脑炎相关病毒检测中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术应用领域，涉及各级疾病预防控制机构，哨点医院等用于脑炎相关疾病患者血液及脑脊液标本的9种脑炎相关病毒(包括版纳病毒，GI乙脑病毒、GIII乙脑病毒，蜱传脑炎病毒，Tahyna病毒，辽宁病毒，科萨努尔森林热病毒，辛德毕斯病毒，及云南环状病毒)感染的同时检测和分型。具体在NCBI下载9种脑炎病毒代表株的核苷酸序列，通过查阅文献和多序列比对，确定病原体相对保守区，设计多重特异性引物。进行单管多重(13重)PCR检测9种脑炎病毒保守区，整个反应不到2个小时。本专利克服了病毒培养法、直接荧光抗体法、芯片检测方法的操作繁琐，时间较长，成本较高等缺点，为脑炎病毒分型技术提供了新的思路，其高特异性、高灵敏度、快速的特点为脑炎相关病毒的快速准确筛查和分型提供了有力的技术支撑，对研究我国脑炎症候群的病原谱和分子流行病学调 查有重要意义。
背景技术：
病毒性脑炎(virus encephalitis)是指由各种病毒感染所引起的脑实质炎症。其主要临床表现为发热、头痛、意识障碍、抽搐和脑膜刺激症状等。目前报道全世界约有100余种病毒可以引起中枢神经系统感染。其中虫媒病毒包括乙型脑炎病毒(JEV)、蜱传脑炎病毒(TBEV)及科萨努尔森林热病毒(KFDV)、西尼罗病毒(WNV)等；非虫媒病毒包括单纯疱疹病毒I型(HSVl)和2型(HSV2)、肠道病毒的柯萨奇病毒(COXV)、肠道病毒71型(EV-71)、风疹病毒，和其它病毒如朊病毒、登革热病毒等。目前病毒性脑炎的实验室诊断主要依靠病毒分离培养、血清学检测和分子生物学方法。病毒分离培养是诊断病毒性脑炎的金标准，但由于脑组织标本难收集，脑脊液中病毒含量低，因此阳性率很低，且耗时耗力。应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测病毒特异抗体是目前较常用的方法，其操作简单，敏感性和特异性高，但由于缺乏理想的诊断试剂因此只能对十余种病毒性脑炎做出实验室诊断。近几年，以PCR技术为基础的各种分子生物学诊断方法得到广泛应用和发展，其中包括SYBR Green I实时PCR及TaqMan PCR等，但基本都是用于单种病毒检测(如乙型脑炎病毒)而难以对未知病原感染病例做出准确诊断。本研究基于GeXP多基因遗传表达分析系统及多重逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)建立了一种多重检测方法，同时检测国内常见能引起病毒性脑炎的九种虫媒病毒版纳病毒，GI乙脑病毒、GIII乙脑病毒，蜱传脑炎病毒，Tahyna病毒，辽宁病毒，科萨努尔森林热病毒，辛德毕斯病毒，及云南环状病毒。
发明内容
I.在 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nucleotide/)下载上述 9 种脑炎相关病毒代表株的核苷酸序列，通过查阅文献和多序列比对，确定病原体相对保守区，输入GeXPeXpress Profiler软件设计多重特异性引物(Specific-Primer, SP-Primer)。将设计的引物通过NCBI Primer-Blast, Primer Premier5. O分析评价，使各引物具有相对一致的Tm值。在全部正向引物和反向引物的5’端分别加入一段非同源性序列作为通用引物(Tag)，构成特异性嵌合引物。上游通用引物标签的5’端标记荧光染料Cy5(Cy5-Tag_F)。在整个引物体系中加入一对扩增人类RNase P基因的引物Rnasep(F/R)，以检验人源样品质量。引物信息见表I。2.建立了如下的检测过程，详见如下(I)合成引物引物均由上海Invitrogen公司合成，除Cy5-Tag_F采用HPLC纯化夕卜，其余引物均PAGE纯化。(2)使用QIAamp Viral RNAMini Kit提取病毒RNA，洗脱体积为30 μ 1，分装置于-80°C保存。(3)建立同时检测9种脑炎相关病毒的多重RT-PCR反应体系，并对其特异性和灵敏度进行验证。·(4)用该13重RT-PCR检验临床标本，对体系进行验证评估。表IGeXP 13重RT-PCR检测9种脑炎相关病毒引物信息表
权利要求
1.一种单管13重PCR同时检测9种脑炎相关病毒，包括用于检测脑炎相关病毒版纳病毒，G I乙脑病毒、GIII乙脑病毒,蝶传脑炎病毒，Tahyna,辽宁病毒,科萨努尔森林热病毒，辛德毕斯病毒及云南环状病毒的型特异性引物。
2.权力要求I所述的13重PCR技术的引物和通用引物包括核酸序列表所列的基因序列及其每种序列的互补序列或变体。
3.权力要求I所述的13重PCR检测技术包括脑炎相关病毒版纳病毒，GI乙脑病毒、GIII乙脑病毒，蜱传脑炎病毒，Tahyna，辽宁病毒，科萨努尔森林热病毒，辛德毕斯病毒及云南环状病毒。
4.权力要求I所述的本发明的应用范围包括各级疾病预防控制机构，哨点医院用于脑 炎相关病毒版纳病毒，G I乙脑病毒、GIII乙脑病毒,蝶传脑炎病毒，Tahyna,辽宁病毒,科萨努尔森林热病毒，辛德毕斯病毒及云南环状病毒同时检测。
5.权力要求I所述的同时检测脑炎相关病毒版纳病毒，GI乙脑病毒、GIII乙脑病毒，蜱传脑炎病毒，Tahyna,辽宁病毒，科萨努尔森林热病毒，辛德毕斯病毒及云南环状病毒的多重PCR技术的反应程序和检测程序。
全文摘要
本发明属于生物技术应用领域，涉及各级疾病预防控制机构、哨点医院等用于病毒性脑炎病患标本的9种脑炎病毒(包括版纳病毒，G I乙脑病毒、GIII乙脑病毒，蜱传脑炎病毒，Tahyna，辽宁病毒，科萨努尔森林热病毒，辛德毕斯病毒及云南环状病毒)感染的同时检测和分型。具体在NCBI下载9种脑炎相关病毒代表株的核苷酸序列，通过查阅文献和多序列比对，确定病原体相对保守区，设计多重特异性引物。进行单管多重(13重)PCR检测9种脑炎病毒保守区，整个反应不到2个小时。本专利既克服了常规单管多重荧光定性PCR检测不能分型的缺点，也克服了常规芯片检测方法的操作繁琐，时间较长，成本较高等缺点，为脑炎病毒分型技术提供了新的思路，其高特异性、高灵敏度、快速的特点为脑炎病毒的快速准确筛查和分型提供了有力的技术支撑，对研究我国脑炎症候群患者感染病原谱和分子流行病学调查有重要意义。
文档编号C12Q1/70GK102952893SQ20111024205
公开日2013年3月6日 申请日期2011年8月23日 优先权日2011年8月23日
发明者马学军, 何玢, 梁国栋, 王环宇, 秦萌 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所