专利名称：一种检测s1核酸酶及其抑制剂的荧光方法
技术领域：
本发明属于生物传感及分析领域，特别涉及一种利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测核酸酶及其抑制剂的荧光检测方法。
背景技术：
核酸酶是指作用于核酸的磷酸二酯键的酶。依据底物不同分类，可分为DNA酶和 RNA酶；依据切割部位不同，又可分为核酸内切酶、限制性内切酶和核酸外切酶。生物体内的核酸酶负责细胞内外催化核酸的降解，对生命过程起着非常重要的作用。核酸酶的用途包括参与DNA的合成与修复及RNA转录后的剪切、修饰和降解等重要基因复制和基因表达过程；负责清除多余的、结构和功能异常的核酸，同时也可以清除侵入细胞的外源性核酸； 在消化液中降解食物中的核酸以利吸收；是体外重组DNA技术中的重要工具酶。由于核酸酶生理功能的重要意义，近年来受到科学家们越来越多的关注，因此迫切需要寻找快速、简便、高灵敏度的方法来检测核酸酶。随之，对核酸酶的检测材料和方法的开发研究成为一个热点。目前针对于核酸酶检测的新型分析方法已经在生命科学研究和疾病分子诊断等领域得到迅速发展。对核酸酶研究的不断深入，必将对生命本质的探索和人类的未来作出更大的贡献。近年来氧化石墨烯以其特殊的力学、量子学和电学性质，颇受物理和材料学界重视。由于其具有优异的电学性能、导热性好、水溶性好、比表面积大等优点，也为生物分子的检测提供了新的思路。目前随着单壁碳纳米管在生物传感中的成功应用，氧化石墨烯也逐渐成为传感领域青睐的对象。由于氧化石墨烯的特殊性质，使得检测过程操作简单、反应快速，这样大大减少了实验的步骤，同时可以显著的提高检测的灵敏度和特异性。
发明内容
技术问题本发明要解决的技术问题是针对现有的核酸酶检测方法存在的不足， 提供一种利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测Si核酸酶及其抑制剂的荧光方法，其具有较高的特异性和灵敏度。技术方案本发明检测Sl核酸酶及其抑制剂的荧光方法，其特征在于该方法包括以下步骤a.将染料标记的寡核苷酸荧光探针加入到缓冲溶液中，以480nm为激发波长，进行荧光检测，记录该探针的荧光发射谱带；b.将氧化石墨烯加入到上述溶液中，氧化石墨烯作为固相载体吸附自由卷曲状态的寡核苷酸探针，形成寡核苷酸/氧化石墨烯复合物，此时染料的荧光被氧化石墨烯猝灭；c.经Sl核酸酶切割的寡核苷酸互补链，加入到寡核苷酸/石墨烯复合物中进行反应；d.寡核苷酸互补链经过Sl核酸酶的特异性降解作用形成小的碱基片段，无法与氧化石墨烯表面的寡核苷酸链探针形成双螺旋结构，从而寡核苷酸探针不能脱离氧化石墨烯的表面，染料的荧光信号不能恢复；根据荧光信号恢复的程度实现对Sl核酸酶的定性及定量检测；e.寡核苷酸互补链在抑制剂腺苷三磷酸存在下经Sl核酸酶降解作用，加入寡核苷酸/氧化石墨烯复合物中进行反应；f.寡核苷酸互补链在抑制剂腺苷三磷酸存在下不会被Sl核酸酶降解，与寡核苷酸探针形成双螺旋结构，寡核苷酸探针脱离氧化石墨烯的表面，染料的荧光信号得以恢复； 根据荧光信号恢复的程度实现对抑制剂腺苷三磷酸的定性及定量检测。其中步骤a)所述的将染料标记的寡核苷酸荧光探针加入到缓冲溶液中，用荧光分光光度计进行检测，所用染料为荧光素；染料标记在寡核苷酸探针的5’端；寡核苷酸探针碱基组成为5，-FAM-ATCTTGACTATGTGGGTGCT-3，；所用缓冲溶液为 20mM Tris-HCl, IOOmM NaCl, 5mM KCl,5mM MgCl2, pH = 7. 4 ；所用荧光检测方法为将探针溶液加入到1. 6mL缓冲溶液中进行荧光发射光谱的扫描，激发波长为480nm，发射波长扫描范围为490-650nm。步骤b)所述的寡核苷酸/氧化石墨烯复合物的形成，是通过非共价键相互作用使寡核苷酸探针吸附到氧化石墨烯表面；寡核苷酸吸附到氧化石墨烯表面后，染料的荧光被氧化石墨烯猝灭，将氧化石墨烯加入到含有寡核苷酸探针的缓冲溶液中后，室温放置5分钟，然后进行荧光检测，激发波长为480nm，扫描范围为490-650nm。步骤c)经Sl核酸酶切割的寡核苷酸互补链，加入到寡核苷酸/石墨烯复合物中进行反应，所用的寡核苷酸互补链探针碱基组成为5’ -AGCACCCACATAGTCAAGAT-3’ ；加入含有S 1酶的寡核苷酸互补链溶液或其它等体积的对照溶液后荧光信号恢复所用的时间为室温，25分钟左右。所述的荧光信号用荧光分光光度计进行检测，激发波长为480nm，发射波长扫描范围为490-650nm。所述的荧光探针为任意一段单链寡核苷酸，染料标记在5’端，或是3’端。 所述的染料标记是荧光素或异硫氰酸荧光素。步骤d)所述的寡核苷酸互补链经Sl核酸酶降解作用，是通过Sl核酸酶对单链 DNA或RNA特异性的降解作用，形成5’磷酸结构。Sl核酸酶对寡核苷酸互补链的酶切过程所用酶切溶液为2mM CH3COONa, 15mMNaCl,0. ImMZnSO4, pH = 4. 6 ；酶切温度为 37°C，时间为 30 分钟。步骤e)所述的寡核苷酸互补链在抑制剂腺苷三磷酸存在下经Sl核酸酶降解作用，是腺苷三磷酸能够抑制Sl核酸酶对单链DNA或RNA切割的特异性降解作用；当抑制剂腺苷三磷酸存在时，Sl核酸酶对寡核苷酸互补链的作用条件与上述酶切条件相同。有益效果根据本发明所述的荧光检测方法，可同时实现对Sl核酸酶及其抑制剂腺苷三磷酸的检测。当体系中含有其它核酸酶及抑制剂时，仍然可以实现对其高灵敏度检测。因此，本发明方法有望为实际临床样品中核酸酶的检测提供一种简便、快速的方法。
图1为本发明利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测核酸酶及其抑制剂的荧光检测方法的工作原理图。图2为本发明利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测检测未经Sl酶降解的DNA链的荧光检测结果图。a为寡核苷酸探针；b为寡核苷酸探针+氧化石墨烯；c为寡核苷酸探针+ 互补链+氧化石墨烯；d为寡核苷酸探针+非互补链+氧化石墨烯。图3为Sl酶及其抑制剂检测过程中不同反应体系荧光检测结果对比图。a为寡核苷酸探针；b为寡核苷酸探针+氧化石墨烯；c为寡核苷酸探针+Sl核酸酶+互补链+氧化石墨烯；d为寡核苷酸探针+Sl核酸酶+腺苷三磷酸+互补链+氧化石墨烯。
具体实施例方式一种利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测Sl核酸酶及其抑制剂的荧光检测方法，包括以下步骤1)将染料标记的寡核苷酸探针加入到缓冲溶液中，对溶液进行荧光检测，记录该探针的荧光发射谱带；该探针为任意序列的一段单链核酸，一端标记有荧光素。2)将氧化石墨烯作为固相载体加入到缓冲溶液中，由于氧化石墨烯表面具有能与寡核苷酸探针进行非共价键结合的化学基团，可以使染料标记的寡核苷酸探针吸附到氧化石墨烯的表面，从而形成寡核苷酸/氧化石墨烯复合物，此时染料与氧化石墨烯之间发生高效的能量转移，染料的荧光被氧化石墨烯有效猝灭。3)在寡核苷酸/氧化石墨烯复合物中加入寡核苷酸互补链进行反应，通过碱基互补配对作用，两条单链核苷酸杂交形成双螺旋结构。4)互补链介导的双螺旋结构的形成使其从氧化石墨烯表面脱离，此时染料基团与氧化石墨烯之间的距离较远，不能发生有效的能量转移，标记在探针末端的染料的荧光信号得到恢复，可以检测到较强的荧光信号。5)当寡核苷酸互补链经Sl核酸酶降解形成小的碱基片段后，加入到寡核苷酸/石墨烯复合物中进行反应，降解后的碱基片段不能与寡核苷酸链形成双螺旋结构。6)寡核苷酸互补链由于受到Sl核酸酶降解作用无法与寡核苷酸形成双螺旋结构，从而寡核苷酸探针不能从氧化石墨烯的表面脱离，染料的荧光信号也不能恢复。7)当寡核苷酸互补链在抑制剂腺苷三磷酸存在下经Sl核酸酶作用后，加入到寡核苷酸/石墨烯复合物中进行反应，互补链在抑制剂腺苷三磷酸存在下不会被Si核酸酶降解，因此能够与寡核苷酸形成双螺旋结构。8)寡核苷酸互补链由于在抑制剂腺苷三磷酸作用下不被Sl核酸酶降解，能够与寡核苷酸探针形成双螺旋结构，从而使寡核苷酸探针脱离氧化石墨烯的表面，染料的荧光信号得以恢复。根据本发明，步骤1)为将染料标记的寡核苷酸探针加入到缓冲溶液中，对溶液进行荧光检测；其中，本发明所述的寡核苷酸探针是任意序列的一段单链核酸。根据本发明，步骤2、中所述的将氧化石墨烯作为固相载体加入到缓冲溶液中，染料标记寡核苷酸探针吸附到氧化石墨烯表面的温度可以是室温，优选的是25°C。根据本发明，步骤2、中所述的寡核苷酸探针吸附到氧化石墨烯表面的速度非常快，观察到荧光猝灭的时间约为2分钟。根据本发明，步骤幻中所述的在寡核苷酸/氧化石墨烯复合物中加入互补链进行反应的温度可以是室温，优选的是25°C。通过碱基互补配对作用，形成双螺旋结构。根据本发明，步骤4)中所述的寡核苷酸与其互补链形成双螺旋结构后，从氧化石墨烯表面脱离的时间约为25分钟。根据本发明，步骤5)中所述的寡核苷酸互补链经Sl核酸酶的降解作用的反应温度可以是四°C 39 °C，优选的是37 °C。根据本发明，步骤幻中所述的寡核苷酸互补链经过Sl核酸酶的降解作用的时间为30分钟。根据本发明，步骤6)中所述的经过Sl核酸酶降解后的寡核苷酸互补链，加入寡核苷酸/石墨烯复合物中进行反应的时间为25分钟。根据本发明，步骤7)中所述的当抑制剂腺苷三磷酸存在时，在寡核苷酸互补链中加入Sl核酸酶进行作用，反应温度和反应时间同步骤5)。根据本发明，步骤8)中所述的当抑制剂腺苷三磷酸存在时，经过Sl核酸酶作用后的寡核苷酸互补链，加入寡核苷酸/石墨烯复合物中进行反应的时间约为25分钟。下面结合附图，用Sl核酸酶的检测实施例来进一步说明本发明。但本发明并不仅限于检测核酸酶及其抑制剂，也并不受实施例中其他条件的限制。荧光检测所用的仪器为荧光分光度计(RF-5301，日本)。荧光光谱测量条件氙灯激发，激发和发射狭缝宽度为5. Onm和10. Onm,电压为950V，响应时间2S，激发波长为 480nm，发射波长扫描范围490 650nm ；用3mL石英比色皿进行测量，样品体积1. 60mL ；室本发明实施例中所用的氧化石墨烯是根据文献(W. S. Hummers, R. Ε. Offeman， J. Am. Chem. Soc. 1958，80，1339-1339)中 Hummers 的方法合成的。本发明实施例中所用的寡核苷酸探针及互补链均购自上海生物工程技术有限公司，序列分别为(5，-FAM-ATCTTGACTATGTGGGTGCT-3，)和(5，-AGCACCCACATAGTCAAGAT-3，)； Sl核酸酶和腺苷三磷酸购自上海生物工程技术有限公司；酶切液成分为OmM CH3COONa, 15mM NaCl,0. ImMZnSO4, pH 4. 6 ；所用的缓冲溶液成分为20mM Tris-HCl, IOOmM NaCl, 5mMKCl,5mM MgCl2, pH 7· 4。实施例1制备寡核苷酸/氧化石墨烯复合物将1 μ L浓度为2 μ M的荧光素标记的寡核核苷酸探针加入到ImL的Tris-HCl缓冲溶液中，再加入0. 6mL水进行荧光检测；然后再加入1. 8 μ L浓度为lmg/mL的氧化石墨烯溶液，该探针会迅速吸附到氧化石墨烯表面，并将荧光素的信号猝灭。实施例2寡核苷酸互补链的检测检测1 将1 μ L浓度为30 μ M的寡核苷酸互补链加入到寡核苷酸/氧化石墨烯复合物中，互补链与寡核苷酸探针形成双螺旋结构，从氧化石墨烯表面脱离，进行荧光检测 (激发波长480nm，发射波长490 650nm)，可以观察到荧光的恢复现象。同时将1 μ L浓度为50μΜ的非互补链加入作为对照，其它条件相同。实施例3核酸酶及其抑制剂的检测检测2 将IyL浓度为1.6μ M的荧光素标记的寡核核苷酸探针加入到ImL的 Tris-HCl缓冲溶液中，再加入0. 6mL的水进行荧光检测；然后再加入1. 5 μ L浓度为lmg/mL 的氧化石墨烯溶液，该探针会迅速吸附到氧化石墨烯表面，并将荧光素的信号猝灭。将3uL浓度为0. OlU的Sl核酸酶和1 μ L浓度为30 μ M的寡核苷酸互补链加入到 3uL 酶切液 QmM CH3COONa, 15mM NaCl, 0. ImM ZnSO4,pH 4.6)中，37°C下反应 30 分钟；再将反应后的混合液加入到寡核苷酸/氧化石墨烯复合物中，作为对照，其它条件与检测1中相同。同时，做如下试验作为对比。检测3 将2. 5 μ L浓度为150mM的腺苷三磷酸和1 μ L浓度为30 μ M的寡核苷酸互补链加入到 3uL 酶切液中(pH 4. 6,2mM CH3COONa, 15mM NaCl，0. ImM ZnSO4)，再加入 3uL 浓度为0. OlU的Sl核酸酶，37°C下反应30分钟；将反应后的混合液加入到寡核苷酸/氧化石墨烯复合物中，作为对照，其它条件与检测1中相同。结果检测1中寡核苷酸互补链和非互补链的荧光信号恢复强度相比相差很大。可见实验的选择性很强。检测2和3中寡核苷酸互补链经Sl核酸酶降解作用及当腺苷三磷酸存在时的降解作用相比，荧光强度相差很大。可见本发明对核酸酶及其抑制剂的检测具有高度的特异性。
权利要求
1.一种检测Sl核酸酶及其抑制剂的荧光方法，其特征在于该方法包括以下步骤a.将染料标记的寡核苷酸荧光探针加入到缓冲溶液中，以480nm为激发波长，进行荧光检测，记录该探针的荧光发射谱带；b.将氧化石墨烯加入到上述溶液中，氧化石墨烯作为固相载体吸附自由卷曲状态的寡核苷酸探针，形成寡核苷酸/氧化石墨烯复合物，此时染料的荧光被氧化石墨烯猝灭；c.经Sl核酸酶切割的寡核苷酸互补链，加入到寡核苷酸/石墨烯复合物中进行反应；d.寡核苷酸互补链经过Sl核酸酶的特异性降解作用形成小的碱基片段，无法与氧化石墨烯表面的寡核苷酸链探针形成双螺旋结构，从而寡核苷酸探针不能脱离氧化石墨烯的表面，染料的荧光信号不能恢复；根据荧光信号恢复的程度实现对Si核酸酶的定性及定量检测；e.寡核苷酸互补链在抑制剂腺苷三磷酸存在下经Sl核酸酶降解作用，加入寡核苷酸/ 氧化石墨烯复合物中进行反应；f.寡核苷酸互补链在抑制剂腺苷三磷酸存在下不会被Sl核酸酶降解，与寡核苷酸探针形成双螺旋结构，寡核苷酸探针脱离氧化石墨烯的表面，染料的荧光信号得以恢复；根据荧光信号恢复的程度实现对抑制剂腺苷三磷酸的定性及定量检测。
2.根据权利要求1所述的检测Sl核酸酶及其抑制剂的荧光方法，其特征是步骤a) 所述的将染料标记的寡核苷酸荧光探针加入到缓冲溶液中，用荧光分光光度计进行检测，所用染料为荧光素；染料标记在寡核苷酸探针的5’端；寡核苷酸探针碱基组成为 5，-FAM-ATCTTGACTATGTGGGTGCT-3，；所用缓冲溶液为 20mOTris-HCl，IOOmM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl2,pH = 7.4 ；所用荧光检测方法为将探针溶液加入到1. 6mL缓冲溶液中进行荧光发射光谱的扫描，激发波长为480nm，发射波长扫描范围为490-650nm。
3.根据权利要求1所述的检测Sl核酸酶及其抑制剂的荧光方法，其特征是步骤b)所述的寡核苷酸/氧化石墨烯复合物的形成，是通过非共价键相互作用使寡核苷酸探针吸附到氧化石墨烯表面；寡核苷酸吸附到氧化石墨烯表面后，染料的荧光被氧化石墨烯猝灭，将氧化石墨烯加入到含有寡核苷酸探针的缓冲溶液中后，室温放置5分钟，然后进行荧光检测，激发波长为480nm，扫描范围为490-650nm。
4.根据权利要求1所述的检测Sl核酸酶及其抑制剂的荧光方法，其特征是步骤c)经 Sl核酸酶切割的寡核苷酸互补链，加入到寡核苷酸/石墨烯复合物中进行反应，所用的寡核苷酸互补链探针碱基组成为5’ -AGCACCCACATAGTCAAGAT-3’ ；加入含有S 1酶的寡核苷酸互补链溶液或其它等体积的对照溶液后荧光信号恢复所用的时间为室温，25分钟左右。
5.根据权利要求1所述的检测Sl核酸酶及其抑制剂的荧光方法，其特征是所述的荧光信号用荧光分光光度计进行检测，激发波长为480nm，发射波长扫描范围为490-650nm。
6.根据权利要求1所述的检测Sl核酸酶及其抑制剂的荧光方法，其特征是所述的荧光探针为任意一段单链寡核苷酸，染料标记在5’端，或是3’端。
7.根据权利要求1所述的检测Sl核酸酶及其抑制剂的荧光方法，其特征是所述的染料标记是荧光素或异硫氰酸荧光素。
8.根据权利要求1所述的检测Sl核酸酶及其抑制剂的荧光方法，其特征是步骤d)所述的寡核苷酸互补链经Sl核酸酶降解作用，是通过Sl核酸酶对单链DNA或RNA特异性的降解作用，形成5’磷酸结构。
9.根据权利要求8所述的检测Sl核酸酶及其抑制剂的荧光方法，其特征是Sl核酸酶对寡核苷酸互补链的酶切过程所用酶切溶液为2mM CH3COONa, 15mMNaCl,0. ImM ZnSO4,pH = 4. 6 ；酶切温度为37°C，时间为30分钟。
10.根据权利要求1所述的检测Sl核酸酶及其抑制剂的荧光方法，其特征是步骤e)所述的寡核苷酸互补链在抑制剂腺苷三磷酸存在下经Si核酸酶降解作用，是腺苷三磷酸能够抑制Sl核酸酶对单链DNA或RNA切割的特异性降解作用；当抑制剂腺苷三磷酸存在时， Sl核酸酶对寡核苷酸互补链的作用条件与上述酶切条件相同。
全文摘要
本发明是一种利用寡核苷酸和氧化石墨烯检测S1核酸酶及其抑制剂的荧光方法。该方法以氧化石墨烯为固相载体，通过其与核酸碱基之间的相互作用使染料标记的寡核苷酸探针吸附在表面并将其荧光猝灭。未被降解的互补链可以与探针杂交形成双螺旋结构并从氧化石墨烯表面脱离，体系荧光得以恢复；当有S1核酸酶存在时，互补链被降解成小的碱基片段，不能与探针形成双螺旋结构，探针仍然吸附在氧化石墨烯表面，荧光呈猝灭状态；腺苷三磷酸可有效抑制核酸酶对互补链的降解作用，从而使体系的荧光恢复。因此，通过检测体系荧光强度的变化即可实现对S1核酸酶及其抑制剂的检测。本发明方法简便、快速、具有较高的灵敏度和选择性，在核酸酶检测方面具有重要的意义。
文档编号C12Q1/44GK102321759SQ20111024534
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月25日 优先权日2011年8月25日
发明者刘兴奋, 苗丽坤, 范曲立, 马延文, 黄维 申请人:南京邮电大学