抗als抑制剂类除草剂菵草的pcr检测方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供用于检测抗ALS抑制剂类除草剂菵草的特异性PCR引物组合，包括用于特异性扩增菵草ALS基因的引物对(Seq?ID?No.1-4)。采用该引物组合的PCR检测方法具有极好的特异性和灵敏性，经特异性试验证明，能够将菵草的ALS基因扩增出来。由于PCR方法操作简便快捷，基于对核苷酸的检测，当季就可以取样检测，从取样到出结果仅需2～4天。其灵敏度和特异性能够实现对田间疑似抗ALS抑制剂菵草的快速鉴定和突变位点的确认，从而指导生产实践中抗性杂草的科学治理。
【专利说明】抗ALS抑制剂类除草剂茼草的PCR检测方法及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及抗除草剂杂草检测技术，具体地说，涉及一种抗ALS抑制剂类除草剂茼草的PCR检测方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002]乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase,简称ALS),也称乙酰轻酸合酶(acetohydroxyacid synthase,简称AHAS),是诱导植物和微生物体内缴氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成过程中关键性酶，也是一种重要的除草剂靶标。ALS抑制剂类除草剂的开发及使用始于上世纪80年代初，由于此类除草剂有超高活性、对人及动物低毒、环境友好等明显的优势，受到广泛关注，目前已有50多个品种被开发和使用。上世纪80年代开始，我国长江中下游陆续在冬小麦田推广使用氯磺隆、甲磺隆、二甲碘磺隆、啶磺草胺等防除禾本科杂草，对控制茼草、日本看麦娘等禾本科杂草起到了非常重要的作用。但由于该类除草剂分子靶标单一，长期使用易引起杂草抗药性，近些年来，以常规剂量喷施甲基二磺隆、甲磺隆等除草剂无法有效防除茼草的问题在我国长江中下游的一些麦田非常突出，并且发现，有些麦田抗甲基二磺隆的茼草对啶磺草胺等ALS抑制剂也产生了交互抗性。麦田杂草对上述几种ALS抑制剂产生交互抗性，使这些农田不能继续使用该类除草剂，而在生产中由于农民对杂草抗药性的认识上的不足，盲目增大用药剂量，不仅增加了成本，使药害风险加大，严重影响农民收入和国家粮食安全。因此，目前迫切需要开发一种简便、快速的抗药性杂草检测鉴定方法。
[0003]我国抗药性杂草的研究起步较晚，传统的抗药性杂草检测通常采用室内生物测定法，既对田间采集的疑似抗性的杂草的种子在室内进行培养，在一定叶龄喷施除草剂后，调查株防效和地上部分生物量来计算抗性指数。这种方法能够客观地评价某种杂草对相应除草剂的抗性情况，但也有其局限性，主要表现在以下两方面:一是不能当季、当时进行检测，二是占地多、时间长、工作量大。随着分子生物学技术在杂草抗药性机理研究方面的应用，越来越多的杂草的抗药性机理得到明确。
[0004]目前已有的研究报道显示，对ALS抑制剂产生抗性的植物在其靶标酶ALS保守区共发现了 8 个 SNP 位点(http://www.weedscience.0rg/Mutat1ns/Mutat1nDisplayAll.aspx)，这些位点的任意一个位点氨基酸突变为其他氨基酸都使植物对相应除草剂产生抗性。这8个氨基酸位点目前公认以拟南芥ALS为标准标注位点，包括122、197、205、376、377、574、653、654 位氨基酸(图 3)。进一步研究发现，茼草(Beckmannia syzigachne (Steud.)Fernald)，对甲基二磺隆等ALS抑制剂类除草剂产生抗性的原因也是编码靶标酶ALS的保守区某一位点发生点突变引起的。因此，可以通过分子生物学手段检测其靶标酶ALS的保守区突变位点来检测茼草是否发生抗药性。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种抗ALS抑制剂类除草剂茼草的PCR检测方法。[0006]本发明的另一目的是提供一种用于检测抗ALS抑制剂类除草剂茼草的试剂盒。
[0007]为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于检测抗ALS抑制剂类除草剂茼草的特异性PCR引物组合，包括用于特异性扩增茼草ALS基因的引物对I和引物对II。这两对引物扩增的ALS片段包含目前在其他抗ALS抑制剂类除草剂的植物上发现的所有8个SNP位点。引物序列如下:
[0008]引物对1:
[0009]正向引物WC-ALS-1 F:5，-CGCCTTACCCAAACCTACT-3’
[0010]反向引物WC-ALS-1 R:5’-ATGCGGCTGCTTGTTCTT-3’
[0011]引物对I1:
[0012]正向引物WC-ALS-1I F: 5 ’ -GATAAGGCTGACCTGTTGC-3 ’
[0013]反向引物WC-ALS-1I R: 5 ’ -TCACAGTTGACCACACTTC-3 ’
[0014]本发明还提供含有上述引物组合的用于检测抗ALS抑制剂类除草剂茼草的试剂盒。
[0015]优选地,所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液等中的至少一种。
[0016]更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
[0017]本发明还提供一种抗ALS抑制剂类除草剂茼草的PCR检测方法，其利用上述引物组合或试剂盒检测抗ALS抑制剂类除草剂茼草。
[0018]前述方法，包括以下步骤:
[0019]I)提取样品中的DNA ；
[0020]2)以步骤I)中提取的DNA为模板，进行PCR扩增反应；
[0021]3)分析PCR产物。
[0022]PCR反应体系以20 μ I计为:
[0023]
【权利要求】
1.用于检测抗ALS抑制剂类除草剂茼草的特异性PCR引物组合，其特征在于，包括用于特异性扩增茼草ALS基因的引物对I和引物对II，引物序列如下: 引物对1: 正向引物 WC-ALS-1 F:5’-CGCCTTACCCAAACCTACT-3’ 反向引物 WC-ALS-1 R:5，-ATGCGGCTGCTTGTTCTT-3，； 引物对II: 正向引物 WC-ALS-1I F:5’ -GATAAGGCTGACCTGTTGC-3’ 反向引物 WC-ALS-1I R:5’ -TCACAGTTGACCACACTTC-3’。
2.含有权利要求1所述引物组合的用于检测抗ALS抑制剂类除草剂茼草的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的至少一种。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
5.抗ALS抑制剂类除草剂茼草的PCR检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述引物组合或权利要求2-4任一项所述试剂盒检测抗ALS抑制剂类除草剂茼草。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)提取样品中的DNA； 2)以步骤I)中提取的DNA为模板，进行PCR扩增反应； 3)分析PCR产物。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以20μ I计为:模板DN AΙμL2.5mM ClNTiiSΙμL
ΙΟμΜ正向引物0.5μ1
ΙΟμΜ反向引物0,5μ17? DNA聚合酶IUi0 X PCR反应缓冲液2μ1ISmM Mg2'0.5μ1
ddH.0补足至20μΙ
8.根据权利要 求5或6所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为:94°C3分钟；94°C I分钟，56°C I分钟，72°C I分钟，共30个循环；72°C 10分钟。
【文档编号】C12N15/11GK104032019SQ201410274174
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月18日 优先权日:2014年6月18日
【发明者】崔海兰, 韩玉皎, 李香菊, 张宏军 申请人:中国农业科学院植物保护研究所