抗als抑制剂类除草剂播娘蒿的pcr检测方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供用于检测抗ALS抑制剂类除草剂播娘蒿的特异性PCR引物对，包括用于特异性扩增播娘蒿B-ALS-1基因的引物对（Seq?ID?No.1-2）以及用于特异性扩增播娘蒿B-ALS-2基因的引物对（Seq?ID?No.3-4）。采用该引物的PCR检测方法具有极好的特异性和灵敏性，经特异性试验证明（图1、2）能够将播娘蒿的两个ALS基因扩增出来。由于PCR方法操作简便快捷，基于对核苷酸的检测，当季就可以取样检测，从取样到出结果仅需2～4天。其灵敏度和特异性能够实现对田间疑似抗ALS抑制剂播娘蒿的快速鉴定和突变位点的确认，从而指导生产实践中抗性杂草的科学治理。
【专利说明】抗ALS抑制剂类除草剂播娘蒿的PCR检测方法及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及抗除草剂杂草检测技术，具体地说，涉及一种抗ALS抑制剂类除草剂播娘蒿的PCR检测方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002]乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase,简称ALS),也称乙酰轻酸合酶(acetohydroxyacid synthase,简称AHAS),是诱导植物和微生物体内纟颜氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成过程中关键性酶，也是一种重要的除草剂靶标。ALS抑制剂类除草剂的开发及使用始于上世纪80年代初，由于此类除草剂有超高活性、对人及动物低毒、环境友好等明显的优势，受到广泛关注，目前已有50多个品种被开发和使用。上世纪80年代开始，我国陆续在冬小麦田推广使用苯磺隆、甲磺隆、氯磺隆、噻吩磺隆、二甲碘磺隆、氟唑磺隆、啶磺草胺等，2009年仅苯磺隆在我国的产量就达230多吨(有效成分)，相当于麦田化除面积2亿多亩。苯磺隆作为小麦田最经济、有效的优秀除草剂，对控制播娘蒿、荠菜等阔叶杂草起到了非常重要的作用。但由于该类除草剂分子靶标单一，长期使用易引起杂草抗药性，近些年来，以常规剂量喷施苯磺隆无法有效防除播娘蒿的问题在我国河北、陕西、山东、河南、山西等地的一些麦田非常突出，并且发现，有些麦田抗苯磺隆的播娘蒿对双氟磺草胺、氯磺隆等ALS抑制剂也产生了交互抗性。麦田杂草对上述几种ALS抑制剂产生交互抗性，使这些农田不能继续使用该类除草剂，而在生产中由于农民对杂草抗药性的认识上的不足，盲目增大用药剂量，不仅增加了成本，使药害风险加大，严重影响农民收入和国家粮食安全。因此，目前迫切需要一个简便，快速的抗药性杂草检测鉴定方法。
[0003]我国抗药性杂草的研究起步较晚，传统的抗药性杂草检测通常采用室内生物测定法，既对田间采集的疑似抗性的杂草的种子在室内进行培养，在一定叶龄喷施除草剂后，调查株防效和地上部分生物量来计算抗性指数。这种方法能够客观地评价某种杂草对相应除草剂的抗性情况，但也有其局限性，主要表现在以下两方面:一是不能当季、当时进行检测，二是占地多、时间长、工作量大。随着分子生物学技术在杂草抗药性机理研究方面的应用，越来越多的杂草的抗药性机理得到明确。其中，播娘蒿对苯磺隆等ALS抑制剂类除草剂产生抗性的原因已明确为编码苯磺隆靶标的ALS保守区某一位点发生点突变引起的。研究中发现，播娘蒿具有两个ALS基因，分别命名为B-ALS-1和B-ALS-2，这两个基因都具有功能，任意一个基因在保守区发生突变，都能够引起抗药性产生。因此，可以通过分子生物学手段检测其靶标酶ALS的保守区突变位点来检测播娘蒿是否发生抗药性。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种抗ALS抑制剂类除草剂播娘蒿的PCR检测方法。
[0005]本发明的另一目的是提供一种用于检测抗ALS抑制剂类除草剂播娘蒿的试剂盒。
[0006]为了实现本发明目的，本发明首先提供用于检测抗ALS抑制剂类除草剂播娘蒿的特异性PCR引物对，包括用于特异性扩增播娘蒿B-ALS-1基因的引物对以及用于特异性扩增播娘蒿B-ALS-2基因的引物对，引物序列如下:
[0007]I)用于特异性扩增播娘蒿B-ALS-1基因的引物对:
[0008]正向引物B-ALS-1F:5’ -TCTATCTCTCGCTCCTCTCC-3’
[0009]反向引物B-ALS-1R: 5 ’ -CAAACAAACAGCAGTAGCG-3 ’
[0010]2)用于特异性扩增播娘蒿B-ALS-2基因的引物对:
[0011]正向引物B-ALS-2F: 5，-CTTCTTCTCCTCCAACGA-3 ’
[0012]反向引物B-ALS-2R: 5，-GCCATCTCCTTCCGTTATGA-3，
[0013]本发明还提供含有上述引物对的用于检测抗ALS抑制剂类除草剂播娘蒿的试剂盒。
[0014]优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液等中的至少一种。
[0015]更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
[0016]本发明还提供一种抗ALS抑制剂类除草剂播娘蒿的PCR检测方法，其利用上述引物对或试剂盒检测抗ALS抑制剂类除草剂播娘蒿。
[0017]前述方法，包括以下步骤:
[0018]I)提取样品中的DNA ；
[0019]2)以步骤I)中提取的DNA为模板，进行PCR扩增反应；
[0020]3)分析PCR产物。
[0021 ] PCR反应体系以20 μ I计为:
[0022]
【权利要求】
1.用于检测抗ALS抑制剂类除草剂播娘蒿的特异性PCR引物对，其特征在于，包括用于特异性扩增播娘蒿B-ALS-1基因的引物对以及用于特异性扩增播娘蒿B-ALS-2基因的引物对，引物序列如下: 1)用于特异性扩增播娘蒿B-ALS-1基因的引物对: 正向引物 B-ALS-1F:5’ -TCTATCTCTCGCTCCTCTCC-3’ 反向引物 B-ALS-1R:5’ -CAAACAAACAGCAGTAGCG-3’ 2)用于特异性扩增播娘蒿B-ALS-2基因的引物对: 正向引物 B-ALS-2F:5’ -CTTCTTCTCCTCCAACGA-3’ 反向引物 B-ALS-2R:5’ -GCCATCTCCTTCCGTTATGA-3’。
2.含有权利要求1所述引物对的用于检测抗ALS抑制剂类除草剂播娘蒿的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的至少一种。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
5.抗ALS抑制剂类除草剂播娘蒿的PCR检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述引物对或权利要求2-4任一项所述试剂盒检测抗ALS抑制剂类除草剂播娘蒿。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)提取样品中的DNA； 2)以步骤I)中提取的DNA为模板，进行PCR扩增反应； 3)分析PCR产物。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以20μ I计为:
8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为:94°C3分钟；94°C 1分钟，56°C 1分钟，72°C 1分钟，共30个循环；72°C 10分钟。
【文档编号】C12Q1/68GK103923996SQ201410158000
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月18日 优先权日:2014年4月18日
【发明者】崔海兰, 李香菊, 王藏月 申请人:中国农业科学院植物保护研究所