OsCIPK31及其编码基因在调控植物除草剂抗性中的应用

OsCIPK31及其编码基因在调控植物除草剂抗性中的应用
【专利摘要】本发明公开了OsCIPK31及其编码基因在调控植物除草剂抗性中的应用。OsCIPK31为氨基酸序列是序列1的蛋白质；OsCIPK31编码基因为如下1)或2)或3)：1)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码OsCIPK31的cDNA分子或基因组DNA分子；3)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交，且编码OsCIPK31的cDNA分子或基因组DNA分子。实验证明，向植物中导入OsCIPK31编码基因，植物抗除草剂能力增强，敲除该编码基因可导致植物对除草剂敏感，可以利用OsCIPK31及其编码基因调控植物的除草剂抗性。
【专利说明】
0SCIPK31及其编码基因在调控植物除草剂抗性中的应用
技术领域
[0001] 本发明设及生物技术领域中0SCIPK31及其编码基因在调控植物除草剂抗性中的 应用。
【背景技术】
[0002] 除草剂在现代农业中应用非常广泛，其施用可减少杂草生长并提高目的作物产 量。阿特拉津是一种常用的除草剂，它的杀草谱较广，适用范围广，但对作物也产生药害。因 此研究作物抗阿特拉津的机制和研发抗除草剂品种在农业生产实践中十分关键，既具有理 论价值，也具有实践意义。
[0003] C^ilcineurin B-l;Lke(CBL)-interacting protein kinase(CIPK)是化2+信号下游 关键因子。邸L特异性结合巧离子后激活其结合激酶蛋白CIPK传到下游信号。C化-CIPK复合 体已报道参与各种植物抗逆途径，如盐、干旱、低溫和渗透压带来的对植物的胁迫。

【发明内容】

[0004] 本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的除草剂抗性。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了调控CIPK蛋白质活性的物质或调控植物 CIPK蛋白质含量的物质在下述Dl)-D4)中任一种中的应用：
[0006] D1)调控植物除草剂抗性；
[0007] D2)培育抗除草剂植物；
[000引D3)制备调控植物除草剂抗性产品；
[0009] D4)制备培育抗除草剂植物产品。
[0010] 所述调控CIPK蛋白质活性可通过选自改变CIPK蛋白质表达量、改变CIPK蛋白质编 码基因的表达量、改变CIPK蛋白质编码基因拷贝数、启动子置换、启动子突变和基因突变的 一种或多种方法实现。
[00川上述应用中，CIPK蛋白质可来源于E1)、E2)或E3):E1)植物;E2)单子叶植物;E3)水 稻。在本发明的实施例中，CIPK蛋白质为来源于水稻的名称为0SCIPK31的蛋白质。
[0012]上述应用中，所述调控植物CIPK蛋白质含量的物质可为调控CIPK蛋白质编码基因 表达的物质。
[OOU] 上述应用中，CIPK蛋白质可为如下A1)、A2)或A3):
[0014] A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；
[0015] A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
[0016] A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
[0017] 为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的 蛋白质的氨基末端或簇基末端连接上如表1所示的标签。
[001引表1、标签的序列 「00191
[0020]上述A2)中的CIPK蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0021 ]上述A2)中的CIPK蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得 到。
[0022] 上述A2)中的CIPK蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或 几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5/端和/或 3/端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0023] 上述应用中，所述调控植物CIPK蛋白质含量的物质可为CIPK蛋白质或其相关生物 材料;所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：
[0024] B1)编码CIPK蛋白质的核酸分子；
[0025] B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
[0026] B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
[0027] B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或 含有B3)所述重组载体的重组微生物；
[0028] B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因 植物细胞系；
[0029] B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植 物组织；
[0030] B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植 物器官。
[0031] 上述应用中，所述编码CIPK蛋白质的核酸分子可为如下1)或2)或3):
[0032] 1)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；
[0033] 2)与1)限定的核巧酸序列具有75%或75% W上同一性，且编码CIPK蛋白质的cDNA 分子或基因组DM分子；
[0034] 3)在严格条件下与1)限定的核巧酸序列杂交，且编码CIPK蛋白质的cDNA分子或基 因组DNA分子。
[0035] 其中，所述核酸分子可W是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也可 W 是 RNA，如 mRNA 或 hnRNA 等。
[0036] 其中，序列2所示的DNA分子编码序列1所示的CIPK蛋白质。
[0037] 本领域普通技术人员可W很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的编码CIPK蛋白质的核巧酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发 明分离得到的CIPK蛋白质的核巧酸序列75%或者更高同一性的核巧酸，只要编码CIPK蛋白 质且具有CIPK蛋白质功能，均是衍生于本发明的核巧酸序列并且等同于本发明的序列。
[0038] 运里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本发 明的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核巧酸序列具有75%或更高，或85%或 更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核巧酸序列。同一性可W用肉眼或计算机软件 进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可W用百分比（％)表示，其可W 用来评价相关序列之间的同一性。
[0039] 上述应用中，所述严格条件是在2 X SSC，0.1 %SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜 2次，每次5min，又于0.5 X SSC，0.1 % SDS的溶液中，在68 °C下杂交并洗膜2次，每次15min; 或，0.1 X SS阳(或0.1 X SSC)、0.1 % SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。
[0040] 上述75%或75%W上同一性，可为80%、85%、90%或95%^上的同一性。
[0041] 上述应用中，B2)所述的含有编码CIPK蛋白质的核酸分子的表达盒(CIPK基因表达 盒），是指能够在宿主细胞中表达CIPK蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动CIPK基因转录的 启动子，还可包括终止CIPK基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。 可用于本发明的启动子包括但不限于:组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和 诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于:花挪菜花叶病毒的组成型启动子35S:来自西 红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肤酶（"LAP",化ao等人（1999)Plant Physiol 120: 979-992);来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关l(PRl)(由水杨酸和BTH(苯并嚷二 挫-7-硫代径酸S-甲醋)诱导）；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用 莱莉酬酸甲醋诱导）；热休克启动子(美国专利5，187,267);四环素诱导型启动子(美国专利 5,057,422);种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子口。128化化010631398(中国专利 200710099169.7))，种子胆存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、11曰口111，〇16〇3111和大 豆be化conglycin的启动子(Beachy等人（1985化MB0 J.4:3047-3053))。它们可单独使用 或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止 子包括但不限于:农杆菌姻脂碱合成酶终止子(N0S终止子）、花挪菜花叶病毒CaMV 35S终止 子、tml终止子、魏豆rbcS E9终止子和姻脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如:Ode 11 等人（l98日）Nature 313:810; Rosenberg等人（1987)Gene ,56:125;加 erineau等人（1991) Mol .Gen.Genet,262:141 ;P;roudfoot( 1991)Cell ,64:671;Sanfaeon等人Genes Dev. ,5: 141 ;Mogen等人（1990)Plant Cell，2:1261 ;Munroe等人（1990)Gene，91:151 ;Ballad等人 (1989)Nucleic Acids Res.17:7891;Joshi等人（1987)Nucleic Acid Res. ,15:9627)。
[0042] 可用现有的表达载体构建含有所述CIPK基因表达盒的重组载体。所述植物表达载 体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC2 5、pBin43 8、 pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或 pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3/端非翻译区 域，即包含聚腺巧酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺巧酸信 号可引导聚腺巧酸加入到mRNA前体的3/端，如农杆菌冠瘦瘤诱导(Ti)质粒基因（如姻脂碱 合成酶基因 Nos)、植物基因（如大豆胆存蛋白基因）3/端转录的非翻译区均具有类似功能。 使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子， 运些增强子区域可W是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅 读框相同，W保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的， 可w是天然的，也可w是合成的。翻译起始区域可w来自转录起始区域或结构基因。为了便 于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可 在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、蛋光素酶基因 等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptn基因，赋予对除草剂 麟丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的h地基因，和赋予对氨甲噪岭抗性的 化打基因，赋予对草甘憐抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等（如抗除莽剂基 因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-憐酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不 加任何选择性标记基因，直接W逆境筛选转化植株。
[0043] 上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、隧菌体或病毒载体。所述质粒具体可为 PGA1611载体。
[0044] B3)所述重组载体可含有序列2的DNA序列。进一步B3)所述重组载体具体可为 PGA1611-0SCIPK31。所述 PGA1611-0SCIPK31 为将 PGA1611 载体的 Hindlll 和 BamHI 识别序列 间的DNA序列替换为序列1所示的DNA片段得到的表达序列2所示的蛋白质的重组载体。
[0045] 上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如农 杆菌 LBA4404。
[0046] 上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包 括繁殖材料。
[0047] 上述应用中，所述除草剂可为阿特拉津。
[004引上述应用中，所述植物可为Ml)或M2) :M1)单子叶植物或双子叶植物;M2)水稻。
[0049] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述Xl)-X4)中任一所述的方法：
[0050] XI)培育抗除草剂转基因植物的方法，包括使受体植物中表达CIPK蛋白质，提高受 体植物中CIPK蛋白质的含量，或提高受体植物中CIPK蛋白质的活性；
[0051] X2)培育抗除草剂转基因植物的方法，包括向受体植物中导入所述CIPK蛋白质的 编码基因得到除草剂抗性高于所述受体植物的抗除草剂转基因植物；
[0052] X3)培育对除草剂敏感转基因植物的方法，包括降低受体植物中CIPK蛋白质含量， 或降低受体植物中CIPK蛋白质的活性；
[0053] X4)培育对除草剂敏感植物的方法，包括抑制受体植物中所述CIPK蛋白质的编码 基因的表达得到除草剂抗性低于所述受体植物的除草剂敏感植物。
[0054] 上述方法中，所述CIPK蛋白质的编码基因可为所述编码CIPK蛋白质的核酸分子。
[0055] 在本发明的实施例中，所述CIPK蛋白质的编码基因（即序列2所示的DNA分子)通过 含有CIPK基因表达盒的CIPK基因重组表达载体导入目的植物中。所述CIPK基因表达盒中， 启动CIPK基因转录的启动子为化iquitin启动子。
[0056] 上述方法中，其中所述CIPK基因可先进行如下修饰，再导入受体种子植物中，W达 到更好的表达效果：
[0057] 1)根据实际需要进行修饰和优化，W使基因高效表达;例如，可根据受体植物所偏 爱的密码子，在保持本发明所述CIPK基因的氨基酸序列的同时改变其密码子W符合植物偏 爱性;优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，W最好地实现植物中 导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35%、多于45%、多于50%或多于约60% ;
[0058] 2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，W使翻译有效起始;例如，利用在植物中已 知的有效的序列进行修饰；
[0059] 3)与各种植物表达的启动子连接，W利于其在植物中的表达;所述启动子可包括 组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的 选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于祀物种；例如组织或器官的特异性 表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定;尽管证明了来源于双子叶植物的许多 启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于 双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
[0060] 4)与适合的转录终止子连接，也可W提高本发明基因的表达效率；例如来源于 CaMV的tml，来源于rbcS的E9;任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可W与本发明 基因进行连接；
[0061] 5)引入增强子序列，如内含子序列（例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列 (例如来源于TMV，MCMV和AMV)。
[0062] 所述CIPK基因表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、 显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的 植物组织培育成植株。
[0063] 所述方法还包括从导入序列2所示的CIPK的编码基因的植株中筛选表达所述编码 基因的植株，得到所述转基因小麦。
[0064] 上述方法中，所述除草剂可为阿特拉津。
[0065] 上述方法中，所述受体植物可为Ml)或M2):Ml)单子叶植物或双子叶植物;M2)水 稻。
[0066] 为解决上述技术问题，本发明还提供了抗除草剂产品。
[0067] 本发明所提供的抗除草剂产品，含有CIPK蛋白质或所述生物材料。
[0068] 上述抗除草剂产品可WWCIPK蛋白质或所述生物材料作为活性成分，还可W将 CIPK蛋白质或所述生物材料与其它抗除草剂物质进行组合得到的组合物作为活性成分。
[0069] 本发明中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述化化F2基因转化目的植物得到 的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可W在该物种中繁殖该基因，也可 用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基 因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
[0070] 实验证明，本发明的CIPK蛋白质及其编码基因可W调控植物的除草剂抗性:将本 发明的CIPK蛋白质的编码基因导入植物后得到的转基因植物中CIPK蛋白质编码基因的表 达显著升高，将CIPK蛋白质的编码基因敲除得到的突变体中CIPK蛋白质编码基因的表达显 著下降。除草剂对转基因植物的鲜重抑制率显著低于野生型植物，对突变体的鲜重抑制率 显著高于野生型植物;除草剂对转基因植物的叶绿素抑制率显著低于野生型植物，对突变 体cipk31的叶绿素抑制率显著高于野生型植物。表明，向植物中导入CIPK蛋白质编码基因， 植物的抗除草剂能力增强;相反，敲除植物CIPK蛋白质编码基因可导致植物对除草剂敏感。 可W利用本发明的CIPK蛋白质及其编码基因调控植物的除草剂抗性。
【附图说明】
[0071] 图1为0SCIPK31基因敲除突变体中T-DNA(Ds)在0SCIPK31基因中的插入位置(A)和 PGA1611-〇sCIPK31 重组载体部分结构示意图（B)。其中，CIPK310X 表示 PGA1611-〇sCIPK31。
[0072] 图2为野生型(WT)、突变体cipk31和转PGA1611-〇sCIPK31水稻在是否经阿特拉津 处理的表型(A)和0SCIPK31基因表达差异(B)。
[0073] 图3为野生型(WT)、突变体ci地31和转PGA1611-0SCIPK31水稻的鲜重抑制率。
[0074] 图4为野生型(WT)、突变体ci地31和转PGA1611-0SCIPK31水稻的叶绿素抑制率。
[0075] 图 2-图 4中，CIPK310X 表示转 PGA1611-0SCIPK31水稻。
【具体实施方式】
[0076] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0077] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0078] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[00巧]下述实施例中的突变体cipk31(Piao H^Xuan YH,Park SH，Je BI,Park SJ,Park SH'Kim CM'Huang J'Wang GK'Kim MJ'Kang SM'Lee IJ'Kwon TR'Kim YH,化o US，Yi G, Son D,Han CD .OsCIPKS1,a CBL-interacting protein kinase is involved in germination and seedling growth under abiotic stress conditions in rice plants.Mol Cells.2010,30:19-27)为从水稻Ds突变体库中筛选出的0sCIPK31基因敲除突 变体，该突变体中T-DNA(Ds)在0SCIPK31基因中的插入位置如图1中A所示。
[0080]下述实施例中用到的限制性内切酶均为化kara产品。
[0081 ] 实施例1、用于过表达0SCIPK31基因的重组载体构建
[0082] 本发明提供了来源于水稻的0SCIPK31基因，0sCIPK31(L0C_0s03g20380)基因的核 巧酸序列为序列2第1-1350位核巧酸，编码的蛋白质的名称为0SCIPK31，该蛋白的氨基酸序 列为序列1。
[OOW] 提取水稻日本晴的RNA，反转录为cDNA。^此cDNA为模板，W5/- AAGCTTATGTATAGGGCTAAGAGGGCTG-3'和5' -GGATCCTCACGCCGCGGCGCCGTTG-3'为引物扩增，得 至化CR产物。
[0084] 用化ndin和BamHI酶切该PCR产物，将得到的含有序列2的酶切产物命名为酶切产 物1;用化ndin和BamHI酶切PGA1611 载体（Piao HL，Xuan YH,化rk SH，Je BI，Park SJ, Park SH,Kim CM,Huang J,Wang GK,Kim MJ,Kang SM,Lee IJ，Kwon TR,Kim YH，Yeo US,Yi G, Son D,Han CD.OsCIPKSl,a CBL-interacting protein kinase is involved in germination and seedl ing growth under abiotic stress conditions in rice plants.Mol Cells.2010,30:19-27)，得到PGA1611 骨架载体。连接酶切产物 1 与PGA1611 骨 架载体，使序列1所示的DNA分子插入PGA1611载体的化ndHI和BamHI位点间，得到重组载 体。
[0085] 经过测序，该重组载体为将序列表中序列1自5/末端第1位-1350位核巧酸所示的 0SCIPK31基因插入PGA1611载体的Hindlll和BamHI酶切位点间（结构示意图如图1中B所 示），将该重组载体命名为PGA1611-0SCIPK31。该重组载体中化iquitin基因的启动子 (pUbiquitin)启动0SCIPK31基因的表达。
[0086] 实施例2、获得转基因水稻
[0087] 1、过表达转基因株系的获得
[0088] 1)过表达转基因株系的获得
[0089] 将实施例1 获得的PGA1611-0SCIPK31 转入农杆菌LBA4404(Takara Bio company, 化1.9115)，得到重组菌。将该重组菌命名为1^844404作641611-〇3(：1?1(31。
[0090] 将LBA4404/PGA1611-0sCIPK31转化到水稻日本晴（w下也称为野生型水稻）中，潮 霉素筛选，获得了 20个To代转PGA1611-0SCIPK31水稻，即为CIPK31过表达转基因株系。
[0091] 2)分子鉴定
[0092] 对上述获得的20个To代转PGA1611-0SCIPK31水稻、突变体cipk31和野生型水稻 (WT)进行分子鉴定，提取水稻根的总RNA经反转录后，用如下引物进行RT-PCR方法鉴定：
[0093] 0sCIPK31-F:AGTAGCTCCATCCTTACATG
[0094] 0sCIPK31-R:TGGCAAAAACCACGTTCACG
[0095] 内参基因为Actin，内参引物为：
[0096] Actin-F:TCCATCTTGGCATCTCTCAG
[0097] Actin-R:GTACCCGCATCAGGCATCTG
[0098] 结果如图2所示，CIPK31敲除突变体(cipk31)中0SCIPK31基因的相对表达量低于 野生型水稻(WlOJo代转PGA1611-0SCIPK31水稻中0SCIPK31基因的相对表达量高于野生型 水稻(WT)，且差异均达到显著性水平，结果如图帥B所示。
[0099] 采用同样的方法将空载体PGA1611载体转入野生型水稻中，得到To代转PGA1611水 稻。
[0100] 将上述To代转PGA1611-0SCIPK31水稻和To代转PGA1611水稻均播种传代，分别得到 Ti 代转 PGA1611-0SCIPK31 水稻和 Ti 代转 PGA1611 水稻。
[0101] 2、RNA干扰转基因表型观察
[0102] 将野生型水稻（WT)、0sCIPK31基因敲除突变体cipk3lW及Tl代转PGA1611- 0sCIPK31水稻与Tl代转PGA1611水稻播种于阿特拉津-MS培养基（阿特拉津-MS培养基为向 MS培养基中加入阿特拉津得到的阿特拉津质量百分比浓度为2%的液体培养基），并用不含 阿特拉津的MS液体培养基作为对照，将播种当天记为处理第0天。
[0103] 每个株系10株，实验重复3次，结果取平均值。
[0104] 在处理第14天拍照（图2中A)，然后测定各植株的整株的鲜重与叶片中叶绿素含 量，计算鲜重抑制率与叶绿素抑制率，鲜重抑制率=(未经阿特拉津处理的植株鲜重-经阿 特拉津处理的植株鲜重)/未经阿特拉津处理的植株鲜重X100%，叶绿素抑制率=(未经阿 特拉津处理的植株叶绿素含量-经阿特拉津处理的植株叶绿素含量)/未经阿特拉津处理的 植株叶绿素含量X 100%。
[01化]Ti代转PGA1611水稻的鲜重抑制率与野生型水稻无显著差异，Ti代转PGA1611- 0SCIPK31水稻的鲜重抑制率(鲜重抑制率为38.7±6.4%)显著低于野生型水稻(￥1')(鲜重 抑制率为61.9±5.7%)，突变体cipk31的鲜重抑制率(鲜重抑制率为77.1 ±5.8%)显著高 于野生型水稻(WT)(图3)。
[0106] Ti代转PGA1611水稻的叶绿素抑制率与野生型水稻无显著差异，Ti代转PGA1611- 0SCIPK31水稻的叶绿素抑制率（叶绿素抑制率为29.7±5.6%)显著低于野生型水稻(WT) (叶绿素抑制率为54.9±4.9%)，突变体^9431的叶绿素抑制率(叶绿素抑制率为29.7± 5.6%)显著高于野生型水稻(WT)(图4)。
[0107]表明，向水稻中导入0SCIPK31基因，水稻的抗阿特拉津能力增强；相反，敲除 0SCIPK31基因可导致水稻对阿特拉津敏感。
【主权项】
1. 调控CIPK蛋白质活性的物质或调控植物CIPK蛋白质含量的物质在下述D1 )-D4)中任 一种中的应用： D1)调控植物除草剂抗性； D2)培育抗除草剂植物； D3)制备调控植物除草剂抗性产品； D4)制备培育抗除草剂植物产品。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：CIPK蛋白质来源于E1)、E2)或E3):E1)植 物;E2)单子叶植物;E3)水稻。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于:所述调控植物CIPK蛋白质含量的物质 为调控CIPK蛋白质编码基因表达的物质。4. 根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：CIPK蛋白质为如下A1)、A2)或 A3)： A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质； A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且具有相同功能的蛋白质； A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质； 所述调控植物CIPK蛋白质含量的物质为CIPK蛋白质或其相关生物材料;所述生物材料 为下述B1)至B7)中的任一种： B1)编码CIPK蛋白质的核酸分子； B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒； B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体； B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有 B3)所述重组载体的重组微生物； B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物 细胞系； B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组 织； B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器 官。5. 根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于:所述编码CIPK蛋白质的核酸分子 为如下1)或2)或3): 1) 编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子； 2) 与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码CIPK蛋白质的cDNA分子 或基因组DNA分子； 3) 在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交，且编码CIPK蛋白质的cDNA分子或基因组 DNA分子。6. 根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于:所述除草剂为阿特拉津;所述植 物为Ml)或M2): Ml)单子叶植物或双子叶植物;M2)水稻。7. 下述XI )-X4)中任一所述的方法： XI)培育抗除草剂转基因植物的方法，包括使受体植物中表达CIPK蛋白质，提高受体植 物中CIPK蛋白质的含量，或提高受体植物中CIPK蛋白质的活性； X2)培育抗除草剂转基因植物的方法，包括向受体植物中导入权利要求1-4中任一所述 CIPK蛋白质的编码基因得到除草剂抗性高于所述受体植物的抗除草剂转基因植物； X3)培育对除草剂敏感转基因植物的方法，包括降低受体植物中CIPK蛋白质含量，或降 低受体植物中CIPK蛋白质的活性； X4)培育对除草剂敏感植物的方法，包括抑制受体植物中权利要求1-4中任一所述CIPK 蛋白质的编码基因的表达得到除草剂抗性低于所述受体植物的除草剂敏感植物。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述CIPK蛋白质的编码基因为权利要求4 或5中所述编码CIPK蛋白质的核酸分子。9. 根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于:所述除草剂为阿特拉津;所述受体植物 为Ml)或M2): Ml)单子叶植物或双子叶植物;M2)水稻。10. 抗除草剂产品，其特征在于:所述产品含有权利要求1-4中任一所述CIPK蛋白质或 权利要求4或5中所述生物材料。
【文档编号】A01H5/00GK106047833SQ201610659128
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月12日 公开号201610659128.8, CN 106047833 A, CN 106047833A, CN 201610659128, CN-A-106047833, CN106047833 A, CN106047833A, CN201610659128, CN201610659128.8
【发明人】李天亚, 玄元虎, 刘景淼
【申请人】沈阳农业大学