专利名称：一种转基因香石竹Moonlite的品系特异性定性、定量PCR检测方法
技术领域：
本发明属于转基因植物检测技术领域，具体涉及一种转基因香石竹Moonlite的品系特异性定性、定量PCR检测方法。
背景技术：
自从1994年第一个转基因番茄FLAVR SAVR被美国农业部批准进行商业化生产种植以来，越来越多的转基因植物已用于农业生产。转基因植物的产业化，尤其是转基因农作物的产业化可以减少农业对环境的影响，增加粮食产量，有助于解决全球粮食问题。据统计，1996年至2010年的15年期间，转基因农作物种植总面积超过十亿公顷。转基因农作物的种植面积从1996年的1. 7万公顷到2010年的148万公顷，增长了 87倍。2010年，全世界种植转基因农作物的国家数量达到四个，其中19个是发展中国家。随着转基因植物产业化水平不断提高，其安全问题已经引起国际社会和各国政府的广泛关注，并成为国家之间环境保护、国际贸易等合作的敏感议题，致使转基因产品的安全性问题由学术观点分歧， 发展到环境问题、经济问题甚至政治问题。为了加强对转基因植物的管理，世界各国纷纷制定了相应的法律法规。转基因产品标识制度已成为国际公约。澳大利亚和新西兰从2001 年7月开始对所有转基因食物实施标识制度，阈值为每种成分的1%，即当某一种成分内的转基因成分超过1%，则必须标识为转基因食物。巴西、以色列等国也把转基因成分阈值定为1%。韩国和日本分别为3%和5%。建立健全转基因产品标识制度，转基因产品的检测技术是关键。目前世界上常用的转基因检测方法主要有两种一种是基于核酸的检测方法，一种是基于蛋白质的免疫学检测方法。在转基因植物及其加工产品的检测过程中，以DNA检测为基础的核酸检测方法已经成为最主要、最适用的转基因植物及其加工产品的检测方法。基于DNA分子为基础的转基因产品检测方法经历了四个发展阶段，即(1)针对启动子、终止子、标记基因的筛选检测；O)目的基因特异性检测；C3)基因构建特异性检测；品系特异性(转化事件)检测。由于品系特异性检测方法具有高度特异性，目前国际上对于转基因产品检测方法已逐步过渡到品系特异性基因片段的检测方法。品系特异性检测是通过分析外源插入载体与植物基因组的连接区序列实现的。由于每一个转基因植物品系，都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，并且连接区序列是单拷贝的，所以品系特异性检测方法具有非常高的特异性和准确性。基于上述优点，品系特异性检测已经成为目前转基因检测研究的重点，并将为国际检测标准和国际各检测实验室所采用。许多国家已经明确规定了转基因标签的阈值，定量PCR检测已经成为转基因检测的必须方法，该方法已经为各国转基因检测实验室广泛使用。近年来，一些转基因植物的品系特异性定性、定量PCR检测方法已经建立，例如，M0N863，Oxy-235, MIR 604，Topas 19/2，M0N15985 等。香石竹(康乃馨)是最重要的切花品种之一，其生产面积和销售量居切花品种之首。随着经济发展和社会进步，人们对花卉尤其是对改变色、香、形的新品种的需求不断增加。澳大利亚Florigene公司和日本Suntory公司将二氢黄酮醇_4_还原酶基因(DFR)和类黄酮-3'，5'-羟基化酶基因(F3' 5' H)，通过农杆菌介导转化花色为白色的香石竹品种FE123，经筛选获得花色呈蓝紫色的转基因香石竹Moonlite。目前Moonlite已经在日本、澳大利亚、加拿大、美国、厄瓜多尔、哥伦比亚等国家通过了安全性评价，批准商品化种植。截止2008年，在美国、日本等国家销售的Moonlite已超过一千五百万支。目前日本Simtory公司正在申请将转基因香石竹Moonlite进口到中国并进行销售，因此研究开发准确、高效的转基因香石竹Moonlite品系特异性检测方法，已成为一项重要而紧迫的任务。目前国内科研单位尚未进行转基因香石竹检测技术的研究。为了保护知识产权，便于农业行政主管部门对转基因香石竹的监管，保护国家在世界贸易活动中的经济利益，有必要建立转基因香石竹Moonlite品系特异性定性、定量PCR检测方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种转基因花色香石竹Moonlite的品系特异性定性、定量PCR检测方法。本发明利用TAIL-PCR技术，测序分析了外源基因插入位点左边界旁邻序列，并设计特异性引物和探针序列，建立了适用于转基因香石竹Moonlite的品系特异性定性、定量PCR检测方法，并验证该检测方法的特异性和灵敏度。本发明的原理为根据已知表达载体左边界序列，设计三条同向且退火温度较高的特异性引物和退火温度较低的随机引物，进行TAIL-PCR反应，得到外源基因插入香石竹基因组DNA位点的旁邻序列。据此设计特异性引物和探针，优化PCR扩增条件，建立标准曲线，确定检测的灵敏度，对混合样品进行分析检测，建立适合于转基因香石竹Moonlite的品系特异性定性、定量PCR检测方法。为了达到上述目的，本发明的技术方案如下利用 Primer Express software version 3. O(Applied Biosystems, Foster City，CA)设计特异性引物和荧光探针。特异性引物和探针的序列具体参见表1。引物和探针由上海英骏公司(Invitrogen Co.，Ltd，Shanghai)合成。采用ans基因作为香石竹的内标准基因。特异性引物LB 1R/2R/3R和随机引物AD2用于TAIL-PCR扩增。LiteClF/lR用于品系特异性定性PCR扩增。LiteRlF/lR和探针Lite-Probe用于品系特异性定量PCR扩增。ANS-F 1/R1用于内标准基因ans定性PCR扩增。ANS-F2/R2和ANS-Probe用于内标准基因ans定量PCR扩增。GenomeClF/lR用于香石竹基因组DNA定性PCR扩增。表1.PCR体系所用的特异性引物和探针
权利要求
1.一种转基因香石竹Moonlite的品系特异性定性、定量PCR检测方法，包括以下步骤1)转基因香石竹Moonlite基因组DNA的提取；2)转基因香石竹Moonlite外源基因插入位点左边界旁邻序列的扩增和确认，其三条巢式引物LB 1R/2R/3R序列分别如SEQ ID No 1、SEQ ID No 2和SEQ ID No 3所示，随机引物AD2序列如SEQ ID No 4所示，香石竹基因组定性PCR扩增引物对GenomeClF/lR序列如 SEQ ID No 9 和 SEQ ID No 10 所示；3)转基因香石竹Moonlite的定性PCR检测方法的建立和验证，其Moonlite品系特异性定性引物对LiteClF/lR序列如SEQ ID No 7和SEQ IDNo 8所示，内标准基因ans特异性定性引物对ANS-F1/R1序列如SEQ ID No5和SEQ ID No 6所示；4)转基因香石竹Moonlite定量PCR检测方法的建立和验证，其Moonlite品系特异性定量引物对LiteRlF/LiteRlR和探针Lite-Probe序列分别如SEQID No 13、SEQ ID No 14和SEQ ID No 16所示，内标准基因ans特异性定量引物对ANS-F2/ANS-R2序列和探针 ANS-Probe 序列如 SEQ ID No 11、SEQID No 12 和 SEQ ID No 15 所示。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述外源基因插入位点左边界旁邻序列的扩增利用TAIL-PCR方法。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述TAIL-PCR方法的扩增反应体系为第一轮扩增反应总体积 20 μ L，2 μ L 1\ 0 缓冲液，0.8“1^21111 dNTPs,0. 3μ L 10 μ M 所述特异性引物LBlR，4yL 10 μ M所述随机引物AD2，0. 2 μ L 5U Taq DNA聚合酶，2 μ L Moonlite DNA，10. 7 μ L 双蒸水；第二轮反应总体积 25 μ L，2. 5 μ L IXPCR 缓冲液，IyL 2mM dNTPs,0. 5μ L 10 μ M 所述特异性引物 LB2R，5 μ L 10 μ M 所述随机引物 AD2，0. 16 μ L 5U Taq DNA聚合酶，14. 84 μ L双蒸水和1 μ L 40倍稀释的第一轮PCR产物；第三轮反应 总体积50yL，5yL IXPCR缓冲液，2 μ L 2mM dNTPs, 1 μ L 10 μ M所述特异性引物LB3R， 10 μ L ΙΟμΜ所述随机引物AD2，0. 3μ L 5U Taq DNA聚合酶，30. 7 μ L双蒸水和1 μ L 10倍稀释的第二轮PCR产物。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述定性PCR检测方法的定性PCR反应体系为反应体系总体积25 μ L, 5 μ L Moonlite DNA, 2. 5 μ LlXPCR缓冲液，2. 5 μ L 2mM dNTPs, 12. 7 μ L双蒸水，10 μ M所述Moonlite品系特异性定性引物对LiteClF/lR或所述内标准基因ans特异性定性引物对ANS-F1/R1各1 μ L和0. 3 μ L 5U Taq DNA聚合酶；反应程序-MV，5min ；94°C，30s, 58°C，30s, 72°C，30s, 35 循环；72°C，7min。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述定量PCR检测方法的PCR反应条件为反应体系总体积 25 μ L，2. 5 μ L 1 XPCR缓冲液，2. 5 μ L2mM dNTPs, 5 μ L 25mM MgCl2, 10μM所述M00nlite品系特异性定量引物对LiteRlF/LiteRlR或所述内标准基因ans特异性定量引物对ANS-F2/ANS-R2各0· 5 μ L，0· 5 μ L 10 μ M所述探针Lite-Probe或所述探针 ANS-Probe，0. 3μ L 5U Taq DNA 聚合酶，5 μ L Moonlite DNA 和 8. 2 μ L 双蒸水；反应程序: 50°C，2min ；95°C, IOmin ；95°C，15s，60°C，45s，45 循环。
全文摘要
本发明公开了一种转基因香石竹Moonlite的品系特异性定性、定量PCR检测方法，包括以下步骤1)转基因香石竹Moonlite基因组DNA的提取；2)转基因香石竹Moonlite外源基因插入位点左边界旁邻序列的扩增和确认；3)转基因香石竹Moonlite定性PCR检测方法的建立和验证；4)转基因香石竹Moonlite定量PCR检测方法的建立和验证。本发明成功建立了适用于转基因香石竹Moonlite的品系特异性定性、定量PCR检测方法，并验证该检测方法的特异性和灵敏度，为转基因香石竹的进口检测、监管及环境安全评价提供依据。
文档编号C12Q1/68GK102286624SQ201110247859
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月26日 优先权日2011年8月26日
发明者唐雪明, 朱宏, 李鹏, 潘爱虎, 王金斌, 白蓝, 蒋玲曦, 贾军伟 申请人:上海市农业科学院