专利名称：猪细小病毒样颗粒b细胞表位插入位点的分子设计的制作方法
技术领域：
本发明涉及猪细小病毒样颗粒B细胞表位插入位点的分子设计，属于基因工程疫苗领域。
背景技术：
猪细小病毒(PPV)病毒粒子外观呈六角形或圆形，无囊膜，二十面体等轴立体对称，衣壳由32个壳粒组成，PPV基因组编码2条结构多肽，VPl和VP2。分子质量分别为84ku 和64ku，另有一条结构多肽VP3由VP2水解而产生，分子质量60ku。其中VP2是构成病毒粒子的主要衣壳蛋白，该蛋白上包含了 PPV的主要保护性抗原。VPl蛋白C端氨基酸与VP2 的N端氨基酸序列相互重叠。VP2的C端暴露在该蛋白的表面，因此C段的完整性是保持该衣壳蛋白二级结构所必需的，而其N端位于二级结构的内部。病毒样颗粒(VLPs)作为疫苗递送工具，有两个突出的特色和优势第一，以化学交联或基因工程的方法可对其表面进一步修饰改造；第二，VLPs可包裹分子量及电荷适宜的核酸或非核酸分子。这两个特点为按照不同目的灵活多样地设计、优化疫苗提供了理想的平台。概而言之，不同疫苗形式如多肽、核酸、甚至佐剂都可以单独或组合地在VUs上挂载或负载，从而克服其各自不足。多肽-VUs嵌合疫苗多肽抗原易于制备，但免疫原性弱， 进入机体后易于降解，这限制了多肽疫苗的实际应用。如果将多肽整合入VLPs内，则可能克服这些障碍。VP2基因在哺乳动物细胞内或杆状病毒表达时能自主装配成病毒样颗粒并具有良好的免疫原性。kdlik等将PPV VP2 N末端和包含淋巴细胞脉络丛脑炎病毒(LCMV)的 118-132位氨基酸的抗原决定簇区相连，然后克隆于杆状病毒表达载体PACYM，转染表达 VP2-LCMV蛋白，利用该重组蛋白免疫鼠可以诱导强烈的细胞毒性T细胞反应(CTL反应)， 在体内持续时间长达9个月，并可抵抗致死量的LCMV攻击。Richard等用PPV VP2共价结合乙肝病毒HBSAg决定簇区多肽，然后免疫小鼠诱导产生很强的针对插入的HBSAg决定簇的T细胞反应，并能抵抗乙肝病毒致死性攻击。现有研究表明可以利用VP2自我包装成空壳粒子的特性，将外源基因片段插入到N末端，表达外源基因，作为一种抗原载体使用，但其携带的外源基因只能刺激T淋巴细胞诱导细胞免疫。VUs暴露的重复结构域能够诱导强烈的抗体应答，这使得这些结构域非常适合引入外源抗原形成VLPs，但插入位点，抗原表位大小常会干扰正确的VLPs形成。Alicia Hurtado等分别缺失犬细小病毒(CPV) VP2 loop 1，2，3，4内的相应基因，再用杆状病毒表达系统表达，结果loop 1，3，4的缺失突变株均不能表达出病毒样颗粒，而loop 2Q17 234)的缺失突变株则能装配出规则的病毒样颗粒。他们进一步研究证明loop 2能容纳外源抗原决定簇。Rueda曾将脊髓灰质炎病毒OB细胞抗原决定簇的基因分别插入CPV VP2 基因的4个环内和C末端后进行融合表达，结果只有插入环2第225位氨基酸的融合蛋白能产生抗多肽反应，但不能产生抗骨髓灰质炎病毒中和反应。于是改在环2第226、227、228 位氨基酸处插入，结果这些融合蛋白能产生抗骨髓灰质炎病毒中和反应。
有研究表明，PPV病毒样颗粒表面的三重轴方向有棘状突起(spike)，它是由loop 形成的高级结构，位于衣壳的最表面，包含了 PPV的大部分抗原表位；五重轴方向有圆柱形通道(cylindrical structure)，由5个β -ribbon形成，N末端的部分氨基酸残基在里面折叠并使中和抗原表面化；此外，五重轴周围有峡谷区(canyon)，二重轴方向有凹陷 (depression)，它们可能是PPV的病毒受体。据此分析认为VP2的N端作为插入位点虽然能够形成病毒样颗粒，但是空颗粒的N端处于五重轴的圆柱形通道内，重组体不能刺激产生B细胞抗原表位的免疫应答；构成五重轴周围的峡谷区和二重轴方向凹陷的肽段同样不适合作为插入位点。
发明内容
技术问题本发明目的在于猪细小病毒样颗粒B细胞表位插入位点的分子设计及以该重组 PPVAVP2病毒样颗粒作为B细胞表位载体进行多价重组疫苗的研制。技术方案猪细小病毒样颗粒B细胞表位插入位点的分子设计，其特征在于，1) AVP2(Loop 2，4缺失)目的基因的克隆根据GenBank 中 NADL-2 (NC :001718)基因序列为模板，用软件 PrimerPremier 5. 0 设计引物 Loop 11，Loop 22，Loop 23，Loop 14，Loop 42 和 Loop 43，其中 Loop 11 和 Loop 14分别加入酶切位点，引物序列如下Loop 11 :5_gtc_gac_atg_agt_gaa_aat_gtg_gaa_caa_c_3(sal I)Loop 22 :5_tgg_att_tag_gtt_tct_gat_g_3Loop 23 ;5_cat_cag_aaa_cct_aaa_tcc_aga_ctc_aat_aca_aac_agg_act_3Loop 14 :5_gcc_ctc_gag_cta_gta_taa_ttt_tct_tgg_3(xhol)Loop 42 :5-ttg-ttg-ctt-tgg-agc-tct-tcc-3Loop 43 :5_gga_aga_gct_cca_aag_caa_caa_ctt_tta_cct_tca_gat_cc_3通过SOE法基因拼接以质粒pT VP2为模板，以引物Loop 11，Loop 22进行PCR 扩增VP2片段660bp，产物在琼脂糖凝胶上电泳后回收；以引物Loop 23, Loop 14进行 PCR扩增VP2片段1047bp，产物在1 %琼脂糖凝胶上电泳后回收；再以上述2个回收产物为模板，引物Loop 11，Loop 14PCR扩增VP2Loop 2缺失片段。分别以引物Loopll，Loop 42 和引物Loop 43, Loop 14扩增VP2片段1227bp和46^p，并分别回收作模板，再以引物Loop 11，Loop 14 PCR扩增VP2Loop 4缺失片段。将VP2 Loop2缺失片段和VP2 Loop 4缺失片段分别与PMD19-T Vector连接，转化E. coli DH5 α，碱裂解法提取质粒，分别用sal I和 xho I双酶切鉴定，获得阳性质粒ρΤ Δ VP2-2和ρΤ Δ VP2-4,并经大连宝生物技术有限公司测序。2)重组质粒 pShuttle- Δ VP2-2, pShuttle- Δ VP2-4 的构建与鉴定 利用双酶切位点sal I和xho I将ρΤ Δ VP2-2和ρΤ Δ VP2-4克隆至转移载体pShuttle-CMV中；用PCR、sal I和xho I双酶切及测序分析进行鉴定，分别命名为 pShuttle-ΔVP2-2 和 pShuttle-ΔVP2-4。
3)重组PPV Δ VP2-2, PPV Δ VP2-4病毒样颗粒的获得
用Riie I酶切该重组质粒，使其线性化，然后与骨架载体pAdEaSyTMVeCt0r在 1. 8kV、25 μ F和200 Ω条件下电转化至大肠杆菌BJ5183感受态细胞，使pShuttle- Δ VP2-2 和pShuttle-AVP2_4与pAdEasyTM Vector发生同源重组，转化至DH5 α宿主菌，挑选出阳性克隆，用PCRJacI酶切鉴定重组是否正确，构建成重组质粒，分别命名为pAd- Δ VP2-2和 pAd-AVP2-4。4)将重组质粒pAd- Δ VP2-2和pAd_ Δ VP2-4转染ΗΕΚ493Α细胞，获得重组病毒 rAd- Δ VP2-2和rAd- Δ VP2-4 ；重组腺病毒表达蛋白在ΗΕΚ493Α细胞中自我装配成病毒样颗粒PPV = AVLPs,即为获得的Loop 2，4基因缺失的重组PPVVP2病毒样颗粒。上述猪细小病毒样颗粒B细胞表位插入位点的分子设计及以该重组PPV Δ VP2病毒样颗粒在制备疫苗方面的应用可以获得猪细小病毒样颗粒载体多价重组疫苗。有益效果本发明的特点和优点如下1、本发明应用的腺病毒表达系统是缺失了 El和Ε3基因的人腺病毒血清5型 (Ad5)，具有无致病性、复制效率高、克隆空间大(可容纳7. 5Kb的外源片段)、能在大多数哺乳动物细胞和组织中表达重组蛋白、在同种细胞和组织中可同时表达多个基因等特点，可对外源基因进行正确的翻译和修饰，使表达的蛋白具有与天然蛋白相同的生物活性。使用该系统构建的重组病毒用于猪体，还可以避免由于猪体自身产生的腺病毒抗体影响免疫效^ ο2、使用生物信息学软件sybyl软件进行了 vp2蛋白的结构建模，同时使用 Discovery Mudio软件与NAMD软件在“刀片机”上进行进行分子动力学计算，得出了正确的vp2蛋白三维结构，分析其三维结构，确定VPM个突出的Loop结构所在区Loop 1 86aa-101aa ；Loop 2 :212aa-245aa ；Loop 3 :279aa-333aa ；Loop 4 :413已已一424已已0 ^〒 模拟和文献支持的基础上，我们推测loop 2,4区可作为外源表位基因插入位点。3,Sadeyen等[2003]将HBV核心抗原的一个免疫显性表位多肽DPASRE分别插入 HPV16 Ll-VLPs外表面的6个环区，这6种嵌合VLPs均能诱导出HBc特异性抗体，但在BC 环区插入外源肽后，机体产生的抗HPV16 Ll的中和性抗体滴度则明显下降。提示BC环区是形成HPV16 Ll构象表位的关键位置，在此处插入常会干扰正确的VLPs形成。本发明分别缺失PPV VP2 loop 2，4内的相应基因，再用腺病毒表达系统表达，结果loop 2，4的缺失突变株均能表达出病毒样颗粒，初步验证loop 2(212aa-245aa), Loop 4 (413aa-424aa) 能容纳外源抗原决定簇。4、病毒样颗粒(VLPs)作为疫苗递送工具，有两个突出的特色和优势第一，以化学交联或基因工程的方法可对其表面进一步修饰改造；第二，VLPs可包裹分子量及电荷适宜的核酸或非核酸分子。这两个特点为按照不同目的灵活多样地设计、优化疫苗提供了理想的平台。概而言之，不同疫苗形式如多肽、核酸、甚至佐剂都可以单独或组合地在VUs上挂载或负载，从而克服其各自不足。Saini[2003]将日本脑炎病毒(JEV)E蛋白的一个表位多肽，通过一个柔性连接子(Gly44er) 3与Johnson草花斑病毒(JGMV)的C端缺失衣壳蛋白连接后，形成一种嵌合VLPs ；这种嵌合VLPs不需佐剂免疫小鼠后，产生的中和抗体，可有效地保护小鼠免于致死性日本脑炎病毒攻击。本发明构建重组PPV Δ VP2病毒样颗粒作为B 细胞表位载体进行多价重组疫苗的研制，不但安全性高、价廉，而且制备多种病原体和/或多个亚型病原体的嵌合PPV VLps疫苗。
5四
图1 =PPV VP2目的基因扩增图2 :VP2蛋白三维结构分析图 3 Δ VP2 (Loop 2,4 缺失)目的基因扩增 Δ VP2-2 (a)，Δ VP2-4 (b)图 4 重组质粒 pShuttle- Δ VP2-2 (a)，pShuttle- Δ VP2-4 (b) sal I/xhoI 双酶切酶切鉴定图 5 重组质粒 pAd- Δ VP2-2 (a)和 pAd- Δ VP2-4 (b) PacI 酶切鉴定图谱图6 重组腺病毒rAd- Δ VP2-2和rAd- Δ VP2-4间接免疫荧光图 rAd- Δ VP2-2 (a)，rAd- Δ VP2-4 (b)，和细胞对照(c)图7 免疫转印鉴定 8 =PPVA VP2 病毒样颗粒电镜图 rAd- Δ VP2-2 (a)，rAd- Δ VP2-4 (b)
五具体实施例方式1)PPVVP2基因的克隆根据GenBank 中 NADL-2 (NC :001718)基因序列为模板，用软件 PrimerPremier 5. 0设计引物Pl和P2，分别加入酶切位点，引物序列如下Pl 5-acc-gga-tcc-atg-ggg-ggg-gtt-ggt-gtg-tct-ac-3(BamH I)P2 5-atc-ctc-gag-cta-gta-taa-ttt-tct-tgg-3(xho I)以PPVNADL-2弱毒株(见参考文献潘群兴，等，检测PCV2、PPV、PRV疫苗株与野毒株的多重PCR方法，中国病毒学，2005,20(6)603 606 ；购自中国兽药监察所；平台资源号1511C0006H00000087，国家兽医微生物菌种保存中心菌株保藏编号HVRIPPV0003) 为模板，以引物Pl和P2进行PCR扩增，产物在琼脂糖凝胶上电泳后，回收并将其与 PMD19-T Vector (宝生物工程(大连)有限公司)连接，转化E.coli DH5 α (宝生物工程 (大连)有限公司)，碱裂解法提取质粒，分别用BamH I和xhol双酶切鉴定，获得阳性质粒 PT VP2，并经大连宝生物技术有限公司测序。2)vp2蛋白的结构建模及分析在通过数据库多序列比较确认后，我们使用生物信息学软件sybyl软件进行了 vp2蛋白的结构建模，同时使用Discovery Studio软件与NAMD软件在“刀片机”上进行进行分子动力学计算，得出了正确的vp2蛋白三维结构，分析其三维结构，确定VPM个突出的 Loop πI^JBf^:IS (Loop 1 :86aa-101aa ；Loop2 :212aa-245aa ；Loop3 :279aa-333aa ；Loop4 413aa-424aa)。3) Δ VP2 (Loop 2，4缺失)目的基因的克隆根据GenBank 中 NADL-2 (NC :001718)基因序列为模板，用软件 PrimerPremier 5. 0 设计引物 Loop 11，Loop 22，Loop 23，Loop 14，Loop 42 和 Loop 43，其中 Loop 11 和 Loop 14分别加入酶切位点，引物序列如下Loop 11 ;5_gtc_gac_atg_agt_gaa_aat_gtg_gaa_caa_c_3(sal I)Loop 22 :5_tgg_att_tag_gtt_tct_gat_g_3Loop 23 ;5_cat_cag_aaa_cct_aaa_tcc_aga_ctc_aat_aca_aac_agg_act_3
Loop 14 :5_gcc_ctc_gag_cta_gta_taa_ttt_tct_tgg_3 (xhol)Loop 42 :5-ttg-ttg-ctt-tgg-agc-tct-tcc_3Loop 43 :5_gga_aga_gct_cca_aag_caa_caa_ctt_tta_cct_tca_gat_cc_3通过SOE法基因拼接以质粒pT VP2为模板，以引物Loop 11，Loop 22进行PCR 扩增VP2片段660bp，产物在琼脂糖凝胶上电泳后回收；以引物Loop 23, Loop 14进行 PCR扩增VP2片段1047bp，产物在1 %琼脂糖凝胶上电泳后回收；再以上述2个回收产物为模板，引物Loop ll,Loop 14 PCR扩增VP2 Loop 2缺失片段。分别以引物Loop ll,Loop 42 和引物Loop 43, Loop 14扩增VP2片段1227bp和46^p，并分别回收作模板，再以引物Loop 11，Loop 14 PCR扩增VP2 Loop 4缺失片段。将VP2 Loop2缺失片段和VP2 Loop 4缺失片段分别与pMD19-T((宝生物工程(大连)有限公司)Vector连接，转化E. coli DH5a，碱裂解法提取质粒，分别用sal I和xhol双酶切鉴定，获得阳性质粒ρΤ Δ VP2-2和ρΤ Δ VP2-4, 并经大连宝生物技术有限公司测序。4)重组质粒 pShuttle- Δ VP2-2, pShuttle- Δ VP2-4 的构建与鉴定利用双酶切位点sal I和xho I将ρΤ Δ VP2-2和ρΤ Δ VP2-4克隆至转移载体 pShuttIe-CMV (见参考文献Construction and immunogenicity of recombinant adenovirus expressing the capsid protein of porcine circovirus 2 (PCV2)in mice. Vaccine. 2006，12 ；24(16) :337 480)中；用 PCR、sal I 和 xho I 双酶切及测序分析进行鉴定，分别命名为 pShuttle-Δ VP2-2 和 pShuttle-Δ VP2-4。5)重组PPV Δ VP2-2, PPV Δ VP2-4病毒样颗粒的获得用Riie I酶切该重组质粒，使其线性化，然后与骨架载体pAdEasy Vector (见参考文献Construction and immunogenicity of recombinant adenovirus expressing the capsid protein of porcine circovirus 2 (PCV2)in mice. Vaccine. 2006,12 ； 24 (16) 337 480)在1. 8kV、25 μ F和200 Ω条件下电转化至大肠杆菌BJ5183 (见参考文献Construction and immunogenicity of recombinant adenovirus expressing the capsid protein of porcine circovirus 2 (PCV2)in mice.Vaccine. 2006,12 ；24 (16) 337 480)感受态细胞，使 pShuttle- Δ VP2-2 和 pShuttle- Δ VP2-4 与 pAdEasyTM Vector 发生同源重组，转化至DH5 α宿主菌，挑选出阳性克隆，用PCR、PacI酶切鉴定重组是否正确，构建成重组质粒，分别命名为PAd- Δ VP2-2和pAd- Δ VP2-4。3)重组病毒的获得与纯化按照脂质体转染试剂操作方法，将预先用I^cI线性化的重组质粒pAd-AVP2_2 和 pAd-AVP2-4 转染 HEK-293A 细胞(见参考文献 Construction and immunogenicity of recombinant adenovirus expressing the capsid protein of porcine circovirus 2 (PCV2) in mice. Vaccine. 2006，12 ；24(16) :337 480)，5% C02，37°C静置培养 IOd 以上， 显微镜观察细胞病变，当细胞病变达70 %时，收毒。经3次噬斑纯化实验，获得重组病毒 rAd- Δ VP2-2 和 rAd-AVP2_4 的滴度分别为 1011·8TCID50/mL 和 101L5TCID50/mL。 4) PPV Δ VP2病毒样颗粒生物学特征研究①间接免疫荧光将重组腺病毒稀释后接种于长满单层的ΗΕΚ493Α细胞，5% C02、37°C培养，约 24h，弃去上清，用PBS洗涤一次，37°C干燥45min，-20 V冷冻45min，再以冷的无水乙醇4 V固定45min，PBST洗涤3次；分别加入50 μ L 1 40稀释的猪抗PPV的血清(b)，37°C作用 Ih,用PBST洗涤3次；加入1 100FITC-SPA，37°C作用lh，洗涤3次；显微镜观察。重组腺病毒(rAd-AVP2-2a)和rAd-Δ VP2-4 (b)呈现较强的荧光，而细胞对照孔(c)没有荧光出现(图6)。说明重组腺病毒在细胞中表达了 PPV :AVP2蛋白。②蛋白质印记用8% PEG-6000浓缩重组腺病毒ΗΕΚ493Α细胞培养物，同时设定正常ΗΕΚ493Α 细胞培养物为对照。将上述浓缩蛋白进行SDS-PAGE电泳，转印到硝纤膜后，10%脱脂乳封闭过夜；加入1 40猪抗PPV的血清室温作用池；洗涤3次，加入1 20000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG，室温作用1. 5h ；洗涤4次，加入化学发光法显色液(DAB)，观察特异蛋白条带。浓缩的重组腺病毒经电泳转印显色后显示，在66KD处均有一条明显的条带，而对照正常的ΗΕΚ493Α细胞没有(图7)，说明重组腺病毒在细胞中表达了 AVP2蛋白。③嵌合病毒样粒子的粗纯化与电镜观察收集病变细胞，用PBS洗两次，1000r/min离心15min，重悬于50mmol/l NaHC03中， 超声波裂解后，24000r/min离心15min，上清液中含有表达蛋白。腺病毒野毒做同样处理后做对照。加入1 10稀释的猪抗PPV血清37°C作用Ih后再4°C过夜，以12000r/min离心 90min,沉淀重悬于少量水中，用3%的磷钨酸负染后经透射电镜观察。在电镜下可以看到大量病毒样粒子存在，呈圆型，直径为30 40nm左右比全病毒粒子稍大，其形态均与全病毒粒子相似(图8)，说明重组腺病毒rAd- Δ VP2-2和rAd- Δ VP2-4在细胞中表达的Δ VP2蛋白能自我组装成病毒样颗粒。④红细胞凝集试验参照《动物病毒学》，使用0.7%豚鼠红细胞的生理盐水悬液。重组腺病毒 ^(1-八评2-2和^(1-八评2-4血凝效价均为1 64，空的腺病毒野毒没有血凝活性，说明重组腺病毒表达Δ VP2蛋白保持PPV原有的生物学活性。5、PPVVLps插入位点分析病毒样颗粒(VLPs)作为疫苗递送工具，两个突出的特色和优势第一，以化学交联或基因工程的方法可对其表面进一步修饰改造；第二，VUs可包裹分子量及电荷适宜的核酸或非核酸分子。这两个特点为按照不同目的灵活多样地设计、优化疫苗提供了理想的平台。概而言之，不同疫苗形式如多肽、核酸、甚至佐剂都可以单独或组合地在VUs上挂载或负载，从而克服其各自不足Saini[2003]将日本脑炎病毒(JEV)E蛋白的一个表位多肽， 通过一个柔性连接子(Gly41er) 3与Johnson草花斑病毒(JGMV)的C端缺失衣壳蛋白连接后，形成一种嵌合VLPs ；这种嵌合VLPs不需佐剂免疫小鼠后，产生的中和抗体，可有效地保护小鼠免于致死性日本脑炎病毒攻击。Vietheer[2007]将丙型肝炎病毒囊膜蛋白E2高变区(HVRl)插入HBsAg-S主要抗原位点(a决定簇)形成的高免疫性嵌合VLPs，仍可保持插入HVRl序列的抗原性。Kanda[2008]将人乳头瘤病毒(HPV)HPV16 Ll和L2型共同表位嵌合VLPs，成功地将L2肽呈递于VLPs表面，免疫家兔诱导了足以发挥保护作用的Ll和L2 中和抗体。为寻找PPV VLps有效组装的外源B细胞表位插入位点，通过PPV VUs三维结构和抗原表位分布图分析，我们推测loop 2,4区可作为外源表位基因插入位点；并在腺病毒表达系统中表达验证，结果loop 2,4的缺失突变株均能表达出病毒样颗粒，初步验证1οορ2，4区能容纳外源抗原决定簇。 本文重组PPV Δ VP2病毒样颗粒可作为B细胞表位载体进行多价重组疫苗的研制， 构建可有效递呈不同来源B细胞表位的PPV VLPs技术平台，为发展同时抗一个或多个病原的疫苗开辟了新的思路。
权利要求
1.猪细小病毒样颗粒B细胞表位插入位点的分子设计，其特征在于， DLoop 2，4缺失的AVP2目的基因的克隆根据GenBank中登录号为NC =001718的NADL-2基因序列为模板，用软件 PrimerPremier 5. O 设计弓|物 Loop 11, Loop 22, Loop 23, Loop 14, Loop 42 禾口 Loop 43, 其中Loop 11和Loop 14分别加入酶切位点，引物序列如下Loop 11 ;5_gtc_gac_atg_agt_gaa_aat_gtg_gaa_caa_c_3 sal I Loop 22 5-tgg-att-tag-gtt~tct-gat-g-3Loop 23 5-cat-cag-aaa-cct-aaa-tcc-aga-ctc-aat-aca-aac-agg-act-3 Loop 14 :5_gcc_ctc_gag_cta_gta_taa_ttt_tct_tgg_3xhoI Loop 42 :5-ttg-ttg-ctt-tgg-agc-tct-tcc_3Loop 43 ;5_gga_aga_gct_cca_aag_caa_caa_ctt_tta_cct_tca_gat_cc_3 通过SOE法基因拼接以质粒pT VP2为模板，以引物Loop 11，Loop 22进行PCR扩增 VP2片段660bp，产物在质量比琼脂糖凝胶上电泳后回收；以引物Loop 23，Loop 14进行PCR扩增VP2片段1047bp，产物在1 %琼脂糖凝胶上电泳后回收；再以上述2个回收产物为模板，引物Loop 11，Loop 14PCR扩增VP2Loop2缺失片段；分别以引物Loop ll,Loop 42和引物Loop 43,Loop 14扩增VP2片段 1227bp和465bp， 并分别回收作模板，再以引物Loop ll,Loop 14PCR扩增VP2Loop 4缺失片段；将VP2 Loop 2缺失片段和VP2Loop 4缺失片段分别与pMD19-T Vector连接，转化E. ColiDH5 α，碱裂解法提取质粒，分别用sal I和xho I双酶切鉴定，获得阳性质粒ρΤ Δ VP2-2和ρΤ Δ VP2-4,并测序；2)重组质粒pShuttle-AVP2-2，pShuttle-Δ VP2-4 的构建与鉴定利用双酶切位点sal I和xho I分别将PTAVP2-2和pTAVP2-4克隆至转移载体 pShuttIe-CMV中；用PCR、sal I和xho I双酶切及测序分析进行鉴定，分别命名为重组质粒 pShuttle-ΔVP2-2, pShuttle-ΔVP2-4 ；3)重组PPVΔ VP2-2, PPV Δ VP2-4病毒样颗粒的获得用Pme I分别酶切重组质粒pShuttle-Δ VP2-2和pShuttle-Δ VP2-4,使其线性化， 然后与骨架载体PAdEasy "Vector在1. 8kV、25 μ F和200 Ω条件下电转化至大肠杆菌 BJ5183 感受态细胞，使 pShuttle- Δ VP2-2 和 pShuttle- Δ VP2_4rShuttle_ Δ VP2-2pAdEasy TM Vector发生同源重组，转化至DH5 α宿主菌，挑选出阳性克隆，用PCR、PacI酶切鉴定重组是否正确，构建成重组质粒，分别命名为PAd- Δ VP2-2和pAd- Δ VP2-4 ；4)将重组质粒pAd-Δ VP2-2和pAd- Δ VP2-4转染ΗΕΚ493Α细胞，获得重组病毒 rAd- Δ VP2-2和rAd- Δ VP2-4 ；重组腺病毒表达蛋白在ΗΕΚ493Α细胞中自我装配成病毒样颗粒PPV = AVLPs,即为获得的Loop 2，4基因缺失的重组PPVVP2病毒样颗粒。
2.权利要求1所述Loop2，4基因缺失的重组PPV VP2病毒样颗粒在制备疫苗方面的应用。
全文摘要
本发明涉及猪细小病毒样颗粒B细胞表位插入位点的分子设计，属于基因工程疫苗领域。使用生物信息学软件对猪细小病毒(PPV)衣壳蛋白VP2结构建模，经三维结构分析确定VP24个突出的Loop结构所在区；首先在分子模拟和文献支持的基础上，我们推测loop 2，4区可作为外源表位基因插入位点。试验证明，分别缺失PPV VP2 Loop2(212aa～245aa)，Loop4(413aa-424aa)内的相应基因，再用腺病毒表达系统表达，结果Loop2，4缺失突变重组病毒均能装配出规则的病毒样颗粒[PPVΔVLPs]。本发明还涉及该重组病毒表达外源基因的重组PPVΔVP2病毒样颗粒在疫苗免疫等方面的应用。
文档编号C12N7/01GK102417912SQ20111030717
公开日2012年4月18日 申请日期2011年10月11日 优先权日2011年10月11日
发明者何孔旺, 李彬, 欧阳伟, 温立斌, 潘群兴, 王晓丽, 王永山, 肖琦, 郭容利 申请人:江苏省农业科学院