专利名称：可直接观察HBV cccDNA在肝组织中分布定位的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种原位检测乙肝病毒cccDNA的方法，特别是涉及一种可直接观察 HBVcccDNA在肝组织中分布和定位的的方法和试剂盒。
背景技术：
乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，以下简称为 HBVcccDNA)的检测在病毒疾病的发病机理和抗病毒治疗研究方面具有重要意义。目前，有文献采用套式PCR方法在肝组织中原位检测HBVcccDNA表达，此方法无法排除非闭合环状DNA和整合HBV DNA的干扰。PCR技术能够在反应管中将微量的核酸扩增几百万倍用于分析，但不能反映扩增产物与组织结构之间的关系。原位杂交技术虽然能够反映扩增产物与组织结构之间的关系，但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下，该方法的敏感性明显下降。原位PCR技术将PCR技术和原位杂交技术结合起来，是直接在细胞或组织标本上原位扩增目的DNA片段，并在原位检测其扩增产物的技术。1990年Haase等首先报道了一个成功的原位PCR实验，随后许多实验室相继有了报道。按检测方式不同主要分为直接原位和间接原位PCR.直接原位PCR是使用标记的引物或游离核苷酸进行原位PCR反应，这种标记分子随后进入扩增产物中，扩增结果可直接观察而不需要进行原位杂交。直接原位PCR具有操作简便、流程短、省时的优点。但直接原位PCR易发生引物错配或非特异性退火，容易出现假阳性；此外，标记的引物还会降低PCR效率。间接原位PCR是在没有标记物的情况下进行PCR反应，扩增反应结束后，再用原位杂交技术来检测扩增的信号。该方法可以克服由于DNA修复或引物错配引起的非特异性问题。该方法需要进行扩增反应后的洗脱和原位杂交过程，因而所需时间相对较长。滚环扩增(rolling cycle amplification,RCA)是一种体外等温核酸扩增方法。原理是寡核苷酸引物与环状模板结合后，在特异的聚合酶的作用下循环扩增。中国专利申请20101023T281. 4 “检测石蜡包埋肝组织乙肝病毒cccDNA”是本发明人先前的工作，采用滚环扩增加跨缺口实时荧光PCR技术检测闭合环状DNA的方法定量检测HBV cccDNA，较好地解决了制约HBV cccDNA定量检测的瓶颈。虽然，该方法与常规使用的荧光探针定量检测等技术相比，可同时提高检测反应特异性和灵敏度，以及与仅用滚环扩增方法相比，可进行HBV cccDNA定量检测，但是仍存在以下缺点与不足一是检测方法比较复杂，必须先把肝组织制成勻浆，把细胞破坏，从中抽提出核酸做模板，然后在反应管中用荧光定量PCR仪进行定量检测。结果判定需要制做标准曲线，以 β-actin作为内参照。此外，该方法是用来定量检测肝组织中HBVcccDNA的特异性方法，但不能将 HBVcccDNA的分布与肝组织形态或组织病理特征相联系，不能反映HBVcccDNA与肝组织结
3构的关系，不能观察HBVcccDNA在肝细胞内的分布和定位。
发明内容
本发明的目的是提供一种可在显微镜下肉眼直接观察到HBV cccDNA在肝组织中的分布和定位的原位HBV cccDNA检测方法，反映HBVcccDNA与肝组织结构的关系。本发明的另一目的是开发可直接观察HBVcccDNA在肝组织中的分布及定位的检测试剂盒。本方法的技术方案是一种直接观察HBVcccDNA在肝组织中分布定位的检测方法，步骤为将患者肝组织样本固定，消化，然后进行PCR扩增，最后检测扩增产物；其特征是1)所述样本固定是将肝组织样本经10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片；2)所述消化是用蛋白酶和PSAD酶进行消化；3)所述PCR扩增是在肝组织切片上进行原位滚环加跨缺口 PCR扩增；4)扩增产物的检测是在滚环加跨缺口 PCR扩增后的肝组织切片上滴加碱磷酶标记的抗地高辛抗体，孵育一定时间后，滴加NBT/BCIP;室温普通显微镜下肉眼直接观察肝组织切片显色情况，细胞核出现蓝色、紫色及紫蓝色颗粒者为HBVcccDNA表达阳性，细胞核出现红色者为HBVcccDNA表达阴性；5)整个检测过程均在载有肝组织切片的玻璃载玻片上进行。所述肝组织样本固定的方法是将肝组织样本经10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，二甲苯脱蜡后，梯度乙醇脱水，室温干燥。所述消化是先采用蛋白酶消化肝组织切片增加组织通透性，然后采用PSAD酶消化组织中非共价闭合环状DNA。所述进行原位滚环加跨缺口 PCR扩增所用仪器为原位PCR仪。进行原位滚环加跨缺口 PCR扩增是在肝组织切片上加入滚环扩增引物和跨缺口引物，进行滚环加跨缺口原位PCR扩增HBVcccDNA，所述滚环扩增引物和跨缺口引物是 RCA1、RCA2、RCA3、RCA4、RCA5、RCA6、RCA7、RCA8、P59、P83 十个引物(引物的序列见实施例 1)。所述加入滚环扩增引物和跨缺口引物是加入所述十个引物，每个引物0.8 μ 1， 在95°C保温;3min，55°C保温15s，33°C保温15s，20°C保温IOmin ；再将上述每个引物各取 0. 8μ 1，加入 Phi29DNA 聚合酶 1μ 1，Phi29 buffer 1 μ 1，BSA 0. 2 μ 1，dNTP 1.6μ1，无菌去离子水4. 2μ 1，滴加到组织上中，在30°C保温18个小时。所述扩增产物的检测是在组织切片上滴加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，37°C 孵育，IX TBS洗涤；滴加NBT/BCIP，暗处室温显色；0. 1 %核固红复染胞核，室温干燥后中性树胶封片，显微镜下观察并记录结果。如果肝组织中有HBV cccDNA的表达，则经原位滚环加跨缺口 PCR扩增后，在组织切片上滴加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，该抗体就会与扩增产物中的地高辛结合， 再与组织切片上滴加的NBT/BCIP反应。原理是BCIP+NBT(四唑硝基蓝)是碱性磷酸酶最佳的底物组合之一，在碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AP)作用下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的 NBT—formazan。
由于碱性磷酸酶与NBT/BCIP反应产生蓝色、蓝紫色颗粒，加上核固红复染胞核， 在显微镜下不仅可直接观察到HBV cccDNA在肝组织中的分布和定位，同时还能观察组织的
病理变化。核固红复染试剂是一种旨在通过核固红染料的使用，使细胞核呈现淡红色，从而与组织化学中的样品染色产生色彩差异和对比，便于观察。用本发明的方法可以制备肝组织原位检测乙型肝炎病毒cccDNA的试剂及试剂
品.ο一种可直接观察HBVcccDNA在肝组织中的分布及定位的检测试剂盒，含有去污剂、dNTP和1XPBS，其特征是还含有以下一种或多种物质组织切片固定剂、脱蜡试剂、封闭试剂、蛋白酶、PSAD酶、Phi四DNA聚合酶、滚环引物和地高辛标记引物。优选的，组织切片固定剂是10%甲醛；蛋白酶是蛋白酶K，脱蜡试剂是二甲苯，封闭试剂是BSA、去污剂是TritonX-IOO。试剂盒中还可以含有Wii29 buffer、碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体、1XTBS、 NBT/BCIP、核固红。上述试剂盒的检测方法是将肝组织样本固定，石蜡包埋，进行消化，然后进行原位滚环加跨缺口 PCR扩增，最后在显微镜下肉眼直接观察肝组织切片颜色。本发明的有益效果是1、直接观察到HBV cccDNA在肝组织中的分布和定位有助于研究病毒疾病的发病机理和病理过程。尤其在研究病毒和肿瘤的关系方面，发挥着重要作用。2、方法比较简便，不需要将肝组织制成勻浆，抽提出核酸做模板；判定结果也不需要制做标准曲线。3、灵敏度高当乙肝患者病毒含量较低，用现有原位杂交技术无法检测到时，用本方法仍可检测到肝组织中HBV cccDNA。4、特异性强通过PSAD酶消化，去除非共价闭合环状DNA的干扰，在此基础上进行滚环扩增加跨缺口 PCR，进一步去除PSAD酶未消化完全的非闭合环状DNA和整合DNA，进一步增强了特异性。5、重复性、稳定性好从实施例给出的实验结果可证实，对临床来源的10份样本进行3次重复检测，组内组间差异无显著性(P < 0. 05)。
图1是不同检测方法检测慢性乙型肝炎患者肝组织中HBV cccDNA比较图，其中A 原位PCR方法检测慢性乙型肝炎患者肝组织中HBV cccDNA ；B =PSAD消化+跨缺口原位PCR法检测慢性乙型肝炎患者肝组织中HBV cccDNA ；C 本发明的PSAD消化+RCA+跨缺口原位PCR法检测慢性乙型肝炎患者肝组织中 HBV cccDNA ；
图2是不同检测方法检测乙肝肝硬化患者肝组织中HBV cccDNA，其中A 原位PCR方法检测乙肝肝硬化患者肝组织中HBV cccDNA ；B =PSAD消化+跨缺口原位PCR法检测乙肝肝硬化患者肝组织中HBV cccDNA ；C 本发明的PSAD消化+RCA+跨缺口原位PCR法检测乙肝肝硬化患者肝组织中 HBVcccDNA ；图3是不同检测方法检测肝癌患者肝组织中HBV ccc DNA，其中A 原位PCR方法检测肝癌患者肝组织中HBV cccDNA ；B =PSAD消化+跨缺口原位PCR法检测肝癌患者肝组织中HBV cccDNA ；C 本发明的PSAD消化+RCA+跨缺口原位PCR法检测肝癌患者肝组织中 HBVcccDNA ；图4是阴性对照，即采用本发明方法检测丙型肝炎患者、健康人、转基因小鼠肝组织中HBV cccDNA ；对乙肝肝癌患者肝组织分别设立无引物、无地高辛标记引物、无TaqDNA 聚合酶反应体系作为阴性对照。
具体实施例方式以下实施例中提到的PSAD酶和PhU9 DNA聚合酶分别购自Epicentre和New England Biolab，滚环引物由上海生物工程有限公司合成。实施例1直接观察HBVcccDNA在肝组织中分布定位的检测方法一、研究样本研究对象为解放军302医院2010年3月 2011年5月期间50例慢性乙型肝、肝硬化、肝细胞癌患者，其中男34例，女16例，年龄范围7 68岁。诊断符合2000年第十次全国病毒性肝炎会议修订的病毒性肝炎诊断标准，排除甲、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒及输血传播病毒、巨细胞病毒、EB病毒感染以及酒精性、药物性、自身免疫性肝病。另收集非乙肝患者肝组织样本作为阴性对照。二、方法1、组织切片的处理把来自患者的肝穿组织放入10%甲醛固定液(85%无水乙醇、10%甲醛、5%冰醋酸)70°C，20分。梯度乙醇溶液脱水95%乙醇I 70°C 20分一95%乙醇II70°C 20分一无水乙醇I 70°C 20分一无水乙醇II70°C 20分乙醇；二甲苯透明20分；石蜡浸蜡30分； 包埋框包埋。肝组织切片。为防止组织脱落并使PCR反应成分穿透组织到达肝细胞核内， 并充分的与靶基因结合，首先将石蜡包埋的肝组织切成5 μ m,贴于用APES硅化处理过的载玻片上，60°C烘烤池。组织切片按常规脱蜡至水洗；用0. 2mmol/L的HCL室温作用3分钟， IxPBS洗涤；0. 1 %的TritonX-IOO室温10分钟，IxPBS洗涤；50 μ g/ml蛋白酶K室温消化 5分钟，IxPBS洗涤；梯度乙醇脱水，室温干燥。2、设计、合成引物与地高辛标记探针根据我国常见的HBV基因型B，C基因组全序列，设计引物及探针RCAl CATCCTCACAATA*C*CRCA2 GGCTATTCTCCTOOCRCA3 AGTATGGGAGTGG*G*C
RCA4 AGTTTGTCCAAGG*G*CRCA5 ATGCAACTTTTTC*A*CRCA6 CTAGCAGAGCTTG*GRCA7 TACAAGAAGAACT*CRCA8 CCCGGGACATATT*GP59 :5-GGCCACCTCTCTTTA-3P83 5-DIGCGGCACAGCTTGGAGG-33、Plasmid safe ATP_d印endent Dnase 酶消化在玻片上滴加现配的PSAD酶(反应缓冲液1微升，ΑΤΡ0. 6微升，PSAD酶0. 5微升，H20 13.3微升)在组织上，37 0C 30分。4、滚环扩增在组织上力口入RCAl、RCA2、RCA3、RCA4、RCA5、RCA6、RCA7、RCA8 八个弓丨物，每个弓I 物 0. 8μ 1。95°C 3min，55°C 15s，33°C 15s，20°C IOmin ；再将上述八个引物0. 8 μ 1/每个引物，PhU9DNA 聚合酶 1 μ l，PhU9 buffer 1 μ 1，BSA 0. 2 μ 1，d NTP 1. 6 μ 1，无菌去离子水 4. 2 μ 1滴加到组织上。30°C 18个小时。5、原位PCR扩增肝组织中HBVcccDNA 在肝组织上滴加原位PCR反应液(标记了地高辛的引物1 μ 1，Mg2+3y 1, dNTP 5μ l，Taq酶 1μ 1，PCR 缓冲液 10μ 1)，95°C 3 分，94°C 1 分，58°C 1 分，72°C 1 分，30 个循环， 72 °C 10 分。6、信号检测用无水乙醇浸泡10分钟，4%多聚甲醛固定30分钟，IxTBS洗涤3次；3% BSA室温3分钟，滴加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，37°C孵育2h，IxTBS洗涤；滴加NBT/BCIP， 暗处室温显色0. 5h ；0. 核固红复染胞核；室温干燥后中性树胶封片，显微镜下观察分析并记录结果。阳性胞核为蓝色、紫色及紫蓝色，阴性胞核为红色细胞内阳性颗粒半定量分析(“)未见阳性结果；(+)细胞核上存在散在、稀疏的阳性颗粒；(++)胞核上阳性颗粒易见；(+++)介于(++)与(++++)之间；(++++)阳性结果布满整个胞核。组织切片阳性分析根据切片中阳性信号表达数量/该片中估算的细胞总量，计数5-10个视野，计算肝细胞中总阳性表达率的平均值。7、特异性、灵敏度和可重复性实验分别用原位PCR(PCR-ISH)、PSAD消化HBV非共价闭合环状DNA后直接原位PCR 法(PSAD+PCR-ISH)及PSAD消化HBV非共价闭合环状DNA后用RCA+跨缺口原位PCR法 (PSAD+RCA+PCR-ISH，本发明方法)进行HBV cccDNA原位检测，对临床来源的10份样本分别进行3次重复实验。以丙型肝炎患者、健康人、转基因小鼠肝组织作为阴性对照。8、慢乙肝、乙肝肝硬化、肝细胞癌患者肝组织HBV cccDNA检测采用PSAD酶消化后用RCA+跨缺口原位PCR方法(PSAD+RCA+PCR-ISH)分别对50 例慢乙肝、肝硬化、肝细胞癌患者进行HBV cccDNA检测。三、实验结果
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1、方法特异性、灵敏度和稳定性实验分别以慢乙肝、肝硬化、肝癌患者肝组织为样本，分三组进行特异性实验I组肝组织直接原位PCR方法(PCR-ISH)；II组肝组织经PSAD消化后直接跨缺口原位PCR(PSAD+PCR-ISH)；III组肝组织经PSAD消化后用RCA+跨缺口原位PCR扩增(PSAD+RCA+PCR-ISH， 本发明方法)；阳性标本中均可见原位扩增后的HBV cccDNA阳性信号(图1 3)，以核型为主， 呈浓密的蓝紫色显色。对照组均为阴性(图4)。结果提示HBV-cccDNA主要存在于细胞核中，为乙肝病毒持续感染及复制的根源。图IA和图IB分别采用PCR-ISH和PSAD+PCR-ISH法检测慢性乙型肝炎患者肝组织标本HBV cccDNA, HBV cccDNA阳性信号很弱(隐约可见蓝色)。图IC采用本发明的PSAD消化+RCA+跨缺口原位PCR (PSAD+RCA+PCR-ISH)法检测慢性乙型肝炎患者肝组织标本HBV cccDNA,HBV cccDNA阳性信号(蓝紫色)主要分布在肝细胞核(X400)。图2A和图2B分别采用PCR-ISH和PSAD+PCR-ISH法检测乙肝肝硬化患者肝组织标本HBV cccDNA, HBV cccDNA阳性信号很弱(隐约可见蓝色)。图2C采用本发明的PSAD消化+RCA+跨缺口原位PCR法检测乙肝肝硬化患者肝组织标本HBV-cccDNA，HBV-cccDNA阳性信号(蓝紫色)主要分布在肝细胞核(X400)。图3A和图;3B分别采用PCR-ISH和PSAD+PCR-ISH法检测肝癌患者肝组织样本 HBVcccDNA, HBV cccDNA阳性信号很弱(隐约可见蓝色)。图3C采用本发明的PSAD消化+RCA+跨缺口原位PCR (PSAD+RCA+PCR-ISH)法检测肝癌患者肝组织标本HBV cccDNA, HBV cccDNA阳性信号(蓝紫色)主要分布在肝细胞核 (X400)。图4HCV采用本发明的PSAD消化+RCA+跨缺口原位PCR (PSAD+RCA+PCR-ISH)法检测丙型肝炎患者肝组织标本HBV-cccDNA，胞核为红色，未见HBV cccDNA阳性信号(蓝紫色) (X20)；图4HCC采用本发明的PSAD消化+RCA+跨缺口原位PCR (PSAD+RCA+PCR-ISH)法检测肝癌患者肝组织标本HBV cccDNA,反应体系中不加引物，胞核为红色，未见HBVcccDNA阳性信号(蓝紫色)(X20)；图4health adult采用本发明的PSAD消化+RCA+跨缺口原位 PCR(PSAD+RCA+PCR-ISH)法检测健康人肝组织标本HBV cccDNA,胞核为红色，未见HBV cccDNA阳性信号(蓝紫色)(X20)；图4transgenic mice采用本发明的PSAD消化+RCA+跨缺口原位 PCR(PSAD+RCA+PCR-ISH)法检测转基因鼠肝组织标本HBV cccDNA,胞核为红色，未见HBV cccDNA阳性信号(蓝紫色)(X20)。采用本发明方法，对临床来源的10份样本进行3次重复检测，组内组间差异无显著性(ρ < 0. 05)。表明本方法稳定性及可重复性较好。通过分析50例患者肝组织中HBV cccDNA分布可知，肝组织中HBV cccDNA大多分布于细胞核，呈浓密的蓝色或紫蓝色，呈颗粒状、弧形或圆形团块状，主要在核及核膜上表达，(+)—(++++)之间不等。阴性患者及阴性对照肝细胞胞核为红色，未见阳性细胞。四、实验结论采用滚环扩增加跨缺口原位PCR的方法检测乙型肝炎患者肝细胞内HBVcccDNA的分布和定位情况，具有较好的特异性和可靠性。滚环扩增(RCA)的特点是只能扩增闭合环状DNA，因而用来扩增HBV cccDNA可提高检测的特异性；通过PSAD酶消化，可去除非共价闭合环状DNA的干扰。由于HBVcccDNA 的含量通常较低，滚环扩增具有在相应引物存在下能同温滚动复制的特征，在PSAD酶消化基础上进行滚环扩增，可以大大提高检测的灵敏度；加跨缺口 PCR，进一步去除PSAD酶未消化完全的非共价闭合环状DNA，进一步增强了特异性。综上证实，本方法具有较好的特异性、灵敏性和稳定性。
权利要求
1.一种直接观察HBVcccDNA在肝组织中分布定位的检测方法，步骤为将患者肝组织样本固定，消化，然后进行PCR扩增，最后检测扩增产物；其特征是1)所述样本固定是将肝组织样本经10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片；2)所述消化是用蛋白酶和PSAD酶进行消化；3)所述PCR扩增是在肝组织切片上进行原位滚环加跨缺口PCR扩增；4)扩增产物的检测是在滚环加跨缺口PCR扩增后的肝组织切片上滴加碱磷酶标记的抗地高辛抗体，孵育一定时间后，滴加NBT/BCIP ；室温普通显微镜下肉眼直接观察肝组织切片显色情况，细胞核出现蓝色、紫色及紫蓝色颗粒者为HBVcccDNA表达阳性，细胞核出现红色者为HBVcccDNA表达阴性；5)整个检测过程均在载有肝组织切片的玻璃载玻片上进行。
2.权利要求1所述的方法，所述肝组织样本固定的方法是将肝组织样本经10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，二甲苯脱蜡后，梯度乙醇脱水，室温干燥。
3.权利要求1所述的方法，所述消化是先采用蛋白酶消化肝组织切片增加组织通透性，然后采用PSAD酶消化肝组织中非共价闭合环状DNA。
4.权利要求1所述的方法，进行原位滚环加跨缺口PCR扩增所用仪器为原位PCR仪。
5.权利要求1或4所述的方法，进行原位滚环加跨缺口PCR扩增是在组织切片上加入滚环扩增引物和跨缺口引物，进行滚环加跨缺口原位PCR扩增HBVcccDNA。
6.权利要求1所述的方法，所述扩增产物的检测是在组织切片上滴加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，37°C孵育，IX TBS洗涤；滴加NBT/BCIP，暗处室温显色；0. 核固红复染胞核，室温干燥后中性树胶封片，显微镜下观察并记录结果。
7.一种可直接观察HBVcccDNA在肝组织中的分布及定位的检测试剂盒，含有去污剂、 dNTP和1XPBS，其特征是还含有以下一种或多种物质组织切片固定剂、脱蜡试剂、封闭试剂、蛋白酶、PSAD酶、PhU9 DNA聚合酶、滚环引物和地高辛标记引物。
8.权利要求7所述的试剂盒，还含有I^i29buffer、碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体、 1XTBS、NBT/BCIP、核固红；且所述组织切片固定剂是10%甲醛；所述蛋白酶是蛋白酶K，所述脱蜡试剂是二甲苯，所述封闭试剂是BSA、所述去污剂是TritonX-100。
9.权利要求7所述的试剂盒，其检测方法是将肝组织样本固定，石蜡包埋，进行消化， 然后进行原位滚环加跨缺口 PCR扩增，最后在显微镜下肉眼直接观察肝组织切片颜色。
全文摘要
本发明涉及一种原位检测乙肝病毒cccDNA的方法和试剂盒。将肝组织样本切片固定，进行消化，然后进行原位滚环加跨缺口PCR扩增，最后检测扩增产物。本方法可直接观察到HBV cccDNA在肝组织中的分布和定位，且操作比较简便，不需要将肝组织制成匀浆，不需抽提出核酸做模板，判定结果也不需要制做标准曲线。
文档编号C12Q1/70GK102534047SQ20111032802
公开日2012年7月4日 申请日期2011年10月25日 优先权日2011年10月25日
发明者钟彦伟 申请人:钟彦伟