专利名称：用于四霉素生物合成的蛋白系统及编码其的基因簇的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物技术领域的蛋白系统及编码其的基因簇，具体涉及的是一种用于四霉素生物合成的蛋白系统及编码其的基因簇。
背景技术：
四霉素(tetramycin)为刺孢吸水链霉菌北京变种的发酵代谢产物，对鞭毛菌、子囊菌和半知菌亚门真亚门真菌和细菌(革兰氏阴性和阳性)均有极强的杀灭作用，尤其对苹果树腐烂病、斑点落叶病和水稻稻瘟病等具有明显的预防和治疗作用，并能促进病疤、伤口、剪锯口组织愈合，对果树开甲后的甲口愈合有明显的作用。四霉素是经微生物发酵获得，内含多种营养成分，能促进弱苗根系发达、老化根系复苏，提高作物抗病能力和优化作物品质，毒性低、无公害、高效广谱、不污染环境，是生产无公害农产品的优质杀菌剂。关于 tetramycin的生物合成途径至今尚未阐明，根据结构推测其是由丁酸起始单元，10个丙二酰辅酶A及1个甲基丙二酰辅酶A为延伸单元形成碳骨架，后经过两个氧化还原酶，氨基海藻糖合成/转移酶等酶对其进行后修饰后形成的聚酮化合物。Tetramycin的生物活性与其结构密切相关，随着tetramycin整个生物合成基因簇的克隆与功能分析，可以从分子水平上阐明tetramycin独特的生物合成机理，在此基础上运用代谢工程的原理，合理修饰tetramycin的生物合成途径，探索生物利用度高，活性更好，并能通过微生物发酵大量生产的新型药物。经对现有技术的文献检索发现，尚未见到有关于四霉素生物合成基因簇的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供了一种用于四霉素生物合成的蛋白系统及编码其的基因簇。本发明提供的用于四霉素生物合成的蛋白系统及编码其的基因簇，该蛋白系统及基因簇能够实现生物合成四霉素，可用于医药，工业，农业等诸多领域。本发明的目的是通过以下技术方案实现的第一方面，本发明涉及一种用于四霉素生物合成的蛋白系统，包括(a)由SEQ ID NO. 2-SEQ ID NO. 21所示的氨基酸组成的蛋白质；或(b)在SEQ ID NO. 2-SEQ ID NO. 21所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由(a)衍生的蛋白质。第二方面，本发明涉及一种编码前述蛋白质系统的四霉素生物合成基因簇。
优选地，所述基因簇包括如SEQ ID NO. 1所示的碱基序列。进一步优选地，所述基因簇的碱基序列如SEQ ID NO. 1所示。第三方面，本发明还涉及前述的四霉素生物合成基因簇在生产四霉素中的用途。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果利用本发明的基因簇可实现以下目的本发明提供的用于四霉素生物合成的蛋白系统及编码其的基因簇，该蛋白系统能够实现生物合成四霉素，能够用于医药，工业，农业等诸多领域。
本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶链式反应(PCR)的方法或包含本发明序列的DNA作为探针进行Southern杂交的方法从其他微生物中得到四霉素生物合成基因的同源基因。本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的克隆DNA可用于从 Streptomyces hygrospinosusvar. bei jingensis基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包含本发明中的部分序列，也包含有基因组中以前临近区域未克隆的DNA。本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的克隆基因或DNA片段可以通过中断四霉素生物合成的一个或几个步骤或者引入其他同源基因而得到新的四霉素的前体或衍生物。本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以用来提高四霉素或其衍生物的产量。例如，转入更多拷贝的正调节基因或增强其表达。本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建质粒以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得新型生物合成途径。本发明所提供的序列或部分序列的克隆基因可以通过合适的表达系统在外源宿主中表达以得到修饰的酶或更高的生物活性或更高的产量。这些外源宿主包括链霉菌，大肠杆菌，芽孢杆菌，酵母，植物和动物细胞等。本发明所提供的序列或部分序列可以通过转化、转导、接合转移等方式转入到其他抗生素产生菌中，从而产生该抗生素的衍生物。本发明所提供的核苷酸序列可以被修饰或突变。这些途径包括插入或置换，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，或与其它来源的同源序列进行直接进化(DNA shuffling)，或提供紫外线或化学试剂诱变等。本发明所提供的氨基酸序列或部分序列可以用来分离所需要的蛋白质并可用于抗体的制备。本发明所提供的氨基酸序列或部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其它致力于得到的性质。本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达并通过DNA芯片技术了解它们在宿主代谢链中的功能。本发明提供的核苷酸序列或多个序列可以与载体序列融合而得到重组序列和相应的DNA分子。
图1为四霉素的化学结构示意图；图2为突变株构建及发酵产物HPLC分析结果；图3为四霉素合成基因簇结构示意图；图4为四霉素生物合成途径示意图；图5为实施例发酵液的提取物HPLC分析结果。
具体实施例方式以下结合附图对本发明的实施例作详细说明以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。以下实施例中所涉及的菌种保藏信息如下本发明中所涉及的“刺孢吸水链霉菌北京变种(Sti^ptomyces hygrospinosus var. beijingensis)，，已在《陶天申，岳莹玉等，刺抱吸水链霉菌新变种-北京变种，微生物学通报，1983年02期，49 50》中公开发表，相关菌种可从北京中国农科院农业菌种保藏中心取得，菌种编号为ACCC40033.该单位的地址为北京市海淀区中关村南大街12号中国农科院农业菌种保藏中心，邮编100081。大肠杆菌DHlOB 购买自美国马里兰州盖色斯堡生物制剂公司Gibco_BRL。棚列1、隨胃物☆成細馳雄1. 1 提耳又四霉素产牛菌 Streptomyces hygrospinosus var. bei iingensis 基因组 DNA接禾中 Streptomyces hygrospinosus var. beijingensis 至 TSBY(10. 3%蔴糖)培养基于含有弹簧的三角瓶中30°C培养48h。离心收集菌体，重悬于5ml SET 缓冲液中(75mM NaCl, 25mM EDTA pH8.0，20mM Tris-HCl ρΗ7· 5)。加入100 μ 1溶菌酶溶液(50mg/ml)，置37°C约60分钟。溶菌后然后加入140 μ 1蛋白酶K溶液(20mg/ml)混均勻，再加600 μ 1 10% SDS, 通过颠倒混勻，置55°C温浴2h，期间偶尔颠倒几次。再加入aiil 5M NaCl，彻底混勻，冷却置37°C后，加入5ml氯仿，于室温轻轻混勻。20°C、4500g 离心 15 分钟。转移上清至新管中，加入0. 6倍体积的异丙醇颠倒混勻，约3分钟后用玻棒挑取至含70% (ν/ν)乙醇的新管中洗涤，重复2次，空气中干燥，溶解在TE中。1. 2四霉素生物合成基因簇的克隆通过刺抱吸水链霄菌北京变种(Streptomyces hygrospinosus var. beijingensis)进行4 全基因组扫描计划，得到704个基因组序列重叠群(contig)，相加有187Mb。参考链霉菌常规基因组大小均在8Mb左右，故该扫描序列以约20倍覆盖率涵盖全基因组信息。使用生物信息学软件对187Mb序列进行功能分析，先用软件Glimmer将核酸序列翻译为氨基酸序列，再通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)的Blast比对，找到同源蛋白，从而实现对这段核酸编码蛋白的功能预测。通过以上生物信息学手段，找到一个501Λ大小的重叠群A，其序列编码包含有典型I型聚酮合酶并与匹马霉素同源。设计基因缺失突变株进行2139bp基因中断试验。用BamHI对cosmid IlAll进行酶切，回收6. 8_kb片段插入pJTU412的BamHI位点构成质粒PJTU5拟6。从质粒pIJ773上回收1371_bp的HindIII-EcoRI片段，并以此为模板，用引物41TGF/41TGR进行KOD PCR扩增1449_bp包含有oriT的阿泊拉霉素抗性基因 (aac (3) IV cassette)以及用于同源交换的39_bp序列。
通过PCR targeting的方法得到将6. 8-kb上的2139-bp片段替换1449-bp阿泊拉霉素抗性基因片段的过渡质粒，该质粒上保留了用于双交换的左右臂各^63-bp和 1754-bp。通过接合转移转入野生型刺孢吸水链霉菌北京变种(Sti^ptomyces hygrospinosus var. bei jingensis)中，通过筛选得到双交换突变株。对突变株和野生型菌种发酵产物进行HPLC分析，突变株构建及发酵产物HPLC分析结果如图2A、2B所示，其中A 为四霉素生物合成基因tetrB，tetraK的中断实验示意图，B为其突变株的HPLC检测图；由图2B可知该突变株丧失了产生四霉素的能力。1. 3四霉素牛物合成基因簇边界的确定通过对重叠群41序列的详细分析，只包含部分典型I型聚酮合酶，缺少了大部分的后修饰基因及调节基因，表明该重叠群只包含部分四霉素生物合成基因簇。为了获得全部的生物合成基因簇，接下来设计引物探针2对探针探针1 Forward 5 □ -CCTCGGTGACGAGTTCCGCCTGCTG-3 □，Reverse 5 □ -GGTGCCCCGTCCCGAACTGCTCATG-3 □；探针2 Forward 5 □ -CCGACCGGGCGATGCTGCGCTGGAC-3 □，Reverse 5 □ -GAGGACGGACGGGGTTCGGCGAGCAC-3 □。通过染色体步移(chromosome walkig)得到了另外四个粘粒，包含另外三个全基因组测序重叠群(重叠群79，445，150)的序列信息，加上重叠群41，共涵盖约1401Λ的序列。分析显示，这1401Λ的序列包含从tetrj到tetrE的基因，编码蛋白可以完成对四霉素的生物合成。四霉素结构鉴定结果如图1所示。根据基因编码蛋白的功能分析，四霉素的生物合成基因簇被确定为从基因tetrj 到tetrE，涵盖了染色体上约1001Λ的区域，包含20个开放读码框，其序列如SEQ ID NO. 1 所示。根据生物信息学分析，tetrj上游为跨膜蛋白，没有显示明显的四霉素生物合成相关性。tetrE是典型I型聚酮合酶，为四霉素合成所必须，而其下游基因编码的蛋白均为未知功能的蛋白，因此tetrj和tetrE被确定为四霉素生物合成基因簇的边界。四霉素合成基因簇结构示意图如图3所示，包括的20个基因如下所述基因tetrj，其基因核苷酸序列位于序列1中第5796 4447位，编码的氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示；所述基因tetrT I，其基因核苷酸序列位于序列1中第7647 4447位；编码的氨基酸序列如SEQ ID N0. 3所示；所述基因tetrT II，其基因核苷酸序列位于序列1中第9610 7625位；编码的氨基酸序列如SEQ ID N0. 4所示；所述基因tetrM I，其基因核苷酸序列位于序列1中第9809 10837位；编码的氨基酸序列如SEQ ID N0. 5所示；所述基因ttrR I，其基因核苷酸序列位于序列1中第11237 14131位；编码的氨基酸序列如SEQ ID N0. 6所示；所述基因ttrR II，其基因核苷酸序列位于序列1中第14157 16940位；编码的氨基酸序列如SEQ ID N0. 7所示；
所述基因ttrR III，其基因核苷酸序列位于序列1中第16989 19625位；编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示；所述基因ttrR IV，其基因核苷酸序列位于序列1中第20083 20706位；编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 9所示；所述基因tetrC，其基因核苷酸序列位于序列1中第21037 49549位；编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 10所示；所述基因tetrD，其基因核苷酸序列位于序列1中第49560 54941位；编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 11所示；所述基因tetrE，其基因核苷酸序列位于序列1中第54976 62004位；编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 12所示；所述基因tetrK，其基因核苷酸序列位于序列1中第63260 62070位；编码的氨基酸序列如SEQ ID N0. 13所示；所述基因tettB，其基因核苷酸序列位于序列1中第63516 83873位；编码的氨基酸序列如SEQ ID N0. 14所示；所述基因tetrL，其基因核苷酸序列位于序列1中第85605 84484位；编码的氨基酸序列如SEQ ID N0. 15所示；所述基因tetrA，其基因核苷酸序列位于序列1中第91044 85837位；编码的氨基酸序列如SEQ ID N0. 16所示；所述基因tetrF，其基因核苷酸序列位于序列1中第91306 91115位；编码的氨基酸序列如SEQ ID N0. 17所示；所述基因tetrG，其基因核苷酸序列位于序列1中第92574 91399位；编码的氨基酸序列如SEQ ID N0. 18所示；所述基因tetrMII，其基因核苷酸序列位于序列1中第93664 拟606位；编码的氨基酸序列如SEQ ID N0. 19所示；所述基因tetrMIII，其基因核苷酸序列位于序列1中第95109 93721位；编码的氨基酸序列如SEQ ID N0. 20所示；所述基因tetrO，其基因核苷酸序列位于序列1中第96987 95321位；编码的氨基酸序列如SEQ ID N0. 21所示。1. 4四霉素的生物合成途径通过四霉素基因簇上每个基因的生物信息学分析以及相关H(S的研究报道，四霉素的生物合成途径经历以下几个过程(推导的四霉素生物合成途径示意图如图4所示)首先通过iTetrA加载乙酸起始单位，后经过四个聚酮合酶基因(tetrB、tetrC、tetrD、 tetrE)共12个模块和TE的作用延伸、环化并释放四霉素的聚酮骨架；其次，经过P450单加氧酶、氨基海藻糖转移酶等后修饰基因的共同作用对聚酮骨架进行甲基化、羟化等后修饰并加载氨基海藻糖，形成具有生物活性的四霉素；最后通过ABC转运蛋白等作用将合成的四霉素转运至胞外。 按照实施例1. 1的方法提取四霉素产生菌Mi^ptomyces hygrospinosus var. beijingensis基因组DNA。之后进行如下步骤的操作
2. 1用于构津突变株的载体的构津用PCR方法以基因组DNA为模板扩增预敲除基因组DNA的两臂各约1. 51Λ，用KpnI 和McI将两臂中间(即如SEQ ID NO. 1所示的基因簇序列)插入卡那霉素抗性基因，形成三片段连接的中间载体。之后将该三片段连接于游离性质粒pSJT1278(He Y, J Microbiol Biotechnol,2010)，完成用于构建突变株的质粒载体。2. 2 四霍素产生菌 Streptomyces hyRrospinosus var. bei jinRensis 接合转移系统的律立收集生长于SFM培养基刺孢吸水链霉菌北京变种(Sti^ptomyces hygrospinosus var. bei jingensis)的新鲜孢子备用。步骤2. 1得到的质粒载体必须在辅助质粒pUZ8002(Bierman，Μ.，et al，Gene, 1992)的协助下，才能通过接合转移导入到北京变种(Sti^ptomyces hygrospinosus var. beijingensis)中；先)If 待转移至 Ij Streptomyces hygrospinosus var. bei jingensis 中的质粒载体转化大肠杆菌ET12567/pUZ8002(Bierman，Μ. , et al, Gene, 1992)，然后培养含目标质粒的大肠杆菌ET12567/pUZ8002，12h后收集菌体，用新鲜LB培养基洗涤菌体2次备用。作为受体的链霉菌北京变禾中(Streptomyces hygrospinosus var. bei jingensis) 孢子需经热激和预萌发处理。将链霉菌孢子重新悬浮于5ml 0. 05M pH8. O的TES缓冲液中， 在55°C水浴中热激10!^11，冷却至室温后加入等体积2乂孢子预萌发培养基(Oxide酵母膏 10%, Oxide酪蛋白氨基酸1%，CaCl2 0. 01M)(需配制5M的原液，分开灭菌后加到酵母膏酪蛋白氨基酸溶液中)预萌发2-池，离心收集孢子并重新悬浮于适量的LB中，在混合器上振荡打散孢子，按IO8 IO8与大肠杆菌细胞等量混合，26-30h后用Iml无菌水含适量抗生素和萘啶酮酸(用来抑制大肠杆菌的生长)来覆盖，置30°C培养数天后即可看到接合子。2. 3基因中断突变株的构建将步骤2. 1得到的用于构建突变株的载体通过接合转移的方式转至链霉菌北京变种(Streptomyces hygrospinosus var. bei jingensis)中，将生长出来的接合子在添力口阿泊拉霉素(apramycin)的SFM平板上抗性验证，验证正确后，在未添加阿泊拉霉素的SFM 平板上扩大松弛培养，待孢子生长丰满后(约7天)，收集孢子，然后在添加相应抗生素的 SFM平板上梯度稀释每平板约50-100个单菌落，挑选菌落分别在含阿泊拉抗生素的SFM平板和含硫链丝菌素的SFM平板上扩大培养，选择在硫链丝菌素平板上未长但在阿泊拉平板上生长良好的菌落，转接到种子培养基中提取总DNA，进行PCR验证正确后，获得突变株，突变株基因组中的四霉素生物合成基因簇已经被敲除，发酵该菌株，其产物中不会含有四霉素。下面对该突变株进行发酵验证。2. 4四霉素的发酵、分离纯化及LC-MS分析鉴定分别发酵步骤2. 3得到的突变株和野生型刺孢吸水链霉菌北京变种 (Streptomyces hygrospinosus var. bei jingensis),分析其发酵产物。发酵流程甘油管中取适量孢子(约50ul)接种至80ml TSBY (10. 3%蔗糖)种子培养基(500ml三角瓶)，30°C，220rpm培养2天。以5%的接种量将种子接种至80ml发酵培养基中(500ml三角瓶)(玉米粉10g，可溶性淀粉20g，黄豆饼粉10g，KH2PO4 0. 2g，NaCl 3g, NH4Cl 3g, CaCO3 4g,蒸馏水 lOOOmL，pH7. 0)，30°C，220rpm 培养 4 天。
分离纯化将80ml发酵液离心下来的菌丝体用丙酮浸泡，室温过夜。然后离心，弃菌体，取上清，45°C旋转蒸掉丙酮，用约Iml甲醇溶解，_70°C保存。LC-MS分离检测制备型高压液相色谱仪为岛津公司(SHIMADZU)的LC-8A，色谱柱为PRC-ODS柱，流速4mL · mirT1，检测流动相甲醇水=7 3，检测波长304nm。为用安捷伦公司的高压液相色谱-质谱联用Agilent IlOOseries LC/MS Trap system质谱仪进行化合物的检测和分析，色谱柱为Agilent Z0RBAX-TC-C18柱(5 μ m，4. 6mmX 250mm)，检测的流动相乙腈0. 005M醋酸铵缓冲液=4 6，流速为0. 6mL · mirT1，检测波长304nm。野生型刺孢吸水链霄菌北京变种(Streptomyces hygrospinosus var. beijingensis)的发酵液的提取物HPLC分析结果如图5所示，(A)为发酵液提取物的分析结果；(B)为四霉素标准品(sigma)的分析结果，由此可以看出，发酵液的提取物含有四霉素。步骤2. 3得到的突变株的发酵液的提取物HPLC分析结果如图2C所示，由图可以看出 (AtetrB mutant曲线)，突变株发酵液的提取物中没有四霉素，由此可以明确证明，本实施例提供的四霉素生物合成基因簇能够实现生物合成四霉素。显而易见地，本发明的保护范围也涵盖如下内容本发明的四霉素生物合成基因簇对应的蛋白系统由SEQ ID NO. 2-SEQ ID NO. 21所示的氨基酸组成的蛋白质必然能够生物合成四霉素。本领域技术人员也很容易理解，在SEQ ID NO. 2-SEQ ID NO. 21所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由(a)衍生的蛋白质也能够实现生物合成四霉素。同样，对于包含本发明中SEQ ID NO. 1所示序列的核苷酸分子也可以实现生物合成四霉素的功能，这也是本领域的公知常识。综上所述，本发明提供的用于四霉素生物合成的蛋白系统及编码其的基因簇，该蛋白系统及基因簇能够实现生物合成四霉素，可用于医药，工业，农业等诸多领域。
权利要求
1.一种用于四霉素生物合成的蛋白系统，其特征在于，包括(a)由SEQID NO. 2-SEQ ID NO. 21所示的氨基酸组成的蛋白质；或(b)在SEQID NO. 2-SEQ ID NO. 21所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由(a)衍生的蛋白质。
2.一种编码权利要求1所述蛋白质系统的四霉素生物合成基因簇。
3.如权利要求2所述的四霉素生物合成基因簇，其特征在于，所述基因簇包括如SEQ ID NO. 1所示的碱基序列。
4.如权利要求3所述的四霉素生物合成基因簇，其特征在于，所述基因簇的碱基序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
5.一种权利要求2、3或4所述的四霉素生物合成基因簇在生产四霉素中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种生物技术领域的用于四霉素生物合成的蛋白系统及编码其的基因簇，所述用于四霉素生物合成的蛋白系统括由SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.21所示的氨基酸组成的蛋白质；或在SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.21所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由(a)衍生的蛋白质；本发明还涉及编码所述蛋白质系统的四霉素生物合成基因簇以及该生物合成基因簇在生产四霉素中的用途。本发明提供的用于四霉素生物合成的蛋白系统及编码其的基因簇，能够实现生物合成四霉素，用于医药，工业，农业等诸多领域。
文档编号C12N15/31GK102516374SQ20111036512
公开日2012年6月27日 申请日期2011年11月17日 优先权日2011年11月17日
发明者姚芬, 曹博, 朱昌雄, 田云龙, 由德林, 邓子新 申请人:上海交通大学