专利名称：含有可诱导型癌基因的细胞系及其建立方法、应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗肿瘤药物研发技术领域，尤其涉及一种可诱导Kiastn2v癌基因表达的细胞系及以此作为筛选模型建立特异性抗肿瘤药物高通量筛选平台。
背景技术：
肿瘤的发生与癌基因的突变关系密切。在大约30%左右的人类恶性肿瘤中，都可以发现RAS家族的基因突变。在某些肿瘤，如胰腺癌、结肠癌等，RAS家族基因突变的百分率更高达40%-90%。这些突变最常发生于K-ras基因。第12位氨基酸(G — V)突变(K-rasG12V)是K-ras常见的激活性基因突变，特别在是胰腺癌中尤其常见。现代K_ras基因突变的肿瘤病人对化疗和放疗有明显的耐受性，一旦发生K-ras突变，可供选择的治疗方案十分有限，病人的预后通常较差。多年来，研究人员致力于寻找一种对K-ras突变肿瘤 有较强细胞毒性的药物。虽然以K-Ras为靶标的抗肿瘤药物的研究取得了一定的进展，但目前临床上仍缺乏一种有效的针对K-ras突变肿瘤的选择性抗肿瘤药物。在技术领域，缺乏高效筛选和鉴定特异性针对K-ras癌基因的药物的方法是目前的主要技术缺陷之一。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术不足，建立一种特异性针对K-ras癌基因的选择性抗肿瘤药物高通量筛选平台，该平台可以筛选出对激活突变的K-ras基因有选择性杀伤作用的新型抗肿瘤药物。不断发展的高通量化合物筛选技术为寻找以K-ras为靶标的新型抗肿瘤药物提供了新的可行途径。本发明基于高通量筛选技术，以分子和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对大量样品检测。这种技术具有微量、精确、快速的特点，通过短时间内对大量化合物库的筛选，快速发现先导化合物并对其进行进一步的研究，为临床抗肿瘤药物的研发提供了一条高效、快捷的途径。以细胞为基础的高通量药物筛选平台的建立需要合适的细胞模型。四环素(Tet)操纵子调控系统是一种可诱导的基因表达系统。在没有四环素(或强力霉素)存在时，Tet阻遏因子(Tet R)与Tet操纵因子序列(Tet 0)结合而阻断四环素抗性基因的表达；在四环素(或强力霉素)存在时，Tet R对Tet 0的阻遏解除，下游基因转录启动。通过这个系统，不仅可以对靶基因的表达进行调控，同时也提供了良好的等基因细胞(isogenic)对照。因此，四环素操纵子调控的可诱导靶基因表达系统为高通量药物筛选提供了理想的细胞模型。本发明提供一种可被强力霉素(doxycycline)诱导的、含有Kiasei2v基因突变的基因表达系统，即TRex-K-rasG12V-293细胞系，其保藏号为CCTCC NO :C201192。四环素诱导表达的TRex-K-rasG12V-293细胞系，其保藏号为CCTCC NO :C201192，于2011年9月28日提交位于中国武汉的武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，并经鉴定存活。在该系统中强力霉素发挥控制基因表达的“开关”作用，细胞内没有强力霉素存在时Kiasw2v不表达，细胞内有强力霉素存在时K-ras高表达，且表达的程度与强力霉素作用的时间正相关。在激活性K-ras癌基因信号的作用下，细胞迅速出现代谢改变，其特征表现在线粒体呼吸功能的下调，糖酵解活跃，乳酸产生率增高等，与温博格效应(Warburger effect)相符合。在长期Tet/on诱导Kiasei2v表达的情况下，细胞呈现恶性转化，能在软琼脂中生长并形成克隆，在裸鼠体内形成肿瘤。因此，Kiasw2v癌基因可诱导性表达细胞系在Tet/on合Tet/off两种情况下呈现两种不同的生物学表型(癌型、非癌型)，可用于筛选和鉴定能特异性针对携带K-ras癌基因的肿瘤细胞的化合物。所述的细胞系中稳定转入了 pcDNA6/TR质粒和含有K_rasG12V癌基因的pcDNA4/T0-K-rasG12V 质粒。所述的pcDNA4/T0-K_rasG12V质粒上12位密码子含有K_rasG12V突变的基因序列。本发明还提供一种TReX-K-rasG12V-293细胞作为高通量药物筛选平台细胞模型的用途。把在Tet/on和Tet/off两种状态下的TRex-K-rasG12V-293细胞以相同细胞数各置于一块96孔板中，这一对96孔板的每一对对应孔接受同一的药物处理(96对孔接受96个不同药物的处理)。以Tet/off状态下细胞的结果做为对照，可以筛选出对K-rasG12V高表达的Tet/on状态的细胞具有选择性细胞毒性的药物。本发明进一步提供一种以TReX-K-rasG12V-293为细胞模型的高通量药物筛选平台硬件系统的组成方案和数据分析方法。该高通量筛选平台的主要组成部分包括(I)Kiastn2v癌基因可诱导性表达细胞系；(2)化合物药库；(3) 96孔板自动移液系；(4) 96孔板自动酶标仪；(5)数据分析系统；详见下述技术方案。本发明提供TRex-K-ras^v细胞系的建立方法，具体步骤如下(I)突变的K_rasG12V cDNA全编码序列经PCR扩增后插入pcDNA4/T0载体的限制性酶切位点(如
图1-A)，产生pcDNA4/T0-K-rasG12V ；(2)经DNA测序，证实pcDNA4/T0-K-rasG12V质粒确含编译G12V的密码子突变；(3)将 pcDNA4/T0-K-rasG12V 质粒转入已稳定转入 pcDNA6/TR 质粒的 TRex-293 细胞；(4)加入 10ug/ml 稻痕菌素(blasticidin)和 200ug/ml 博来霉素(zeocin)以筛选出稳定转入pcDNA6/TR和pcDNA4/T0-K-rasG12V两种质粒的细胞克隆；(5)存活下来的细胞不断增殖发展为TRex-K-rasG12V_293细胞系，培养于含有10%胎牛血清，10ug/ml稻瘟菌素和200ug/ml博来霉素的DMEM培养基中。该细胞系的K_rasG12V表达可被Tet或强力霉素所控制。TRex-K-rasG12V_293细胞建立后即可应用于高通量抗肿瘤药物筛选平台。Tet/on和Tet/off两种状态下的TRex-K-raSG12V-293细胞以相同的数目各置于一块九十六孔板中，这一对九十六孔板的相应孔接受相同的药物处理，以Tet/off状态下细胞的毒性结果为对照，可以筛选出对K-ra#12高表达(Tet/on)状态的细胞具有选择性毒性的药物。据此可设计以TRex-K-raSG12V-293细胞模型为基础的高通量药物筛选平台。如图2所示，以TRex-K-rasG12V-293为细胞模型的高通量药物筛选平台主要组成部分包括(I)Ktbsg12v癌基因可诱导性表达细胞系；在长期Tet/on诱导Kiastn2v表达的情况下，细胞呈现恶性转化并具有癌型代谢特征(线粒体呼吸功能的下调，糖酵解活跃，乳酸产生率增高等)，而Tet/offcells不表达K-ra#12'做为非癌细胞对照。因为两组细胞具同等基因型，两者并用能提供一套用于筛选和鉴定针对携带K-ras癌基因的肿瘤细胞的特异性化合物的筛选系统。(2)化合物药库；该药库可以是小分子化合物、大分子生物制剂，或中草药有效成分等。
(3)96孔板自动移液系；该工作站可以在筛选过程中实现液体的快速精确分配，以辅助药物稀释、细胞铺板、细胞加药等环节。(4)96孔板自动酶标仪；该酶标仪可以快速读出96孔板各孔的吸光值，提供细胞毒性的原始数据。(5)数据分析系统；该系统的数据处理下列计算模式
权利要求
1.一种含有可诱导型癌基因的细胞系，其特征在于，所述的细胞系的保藏号为CCTCCNO :C201192，所述的细胞系中K-raSG12V蛋白的表达可被强力霉素所调控，所述的细胞系为TRex-K-rasG12V-293 细胞系。
2.根据权利要求I所述的细胞系，其特征在于，所述的细胞系中稳定转入了PCDNA6/TR质粒和含有K-rasG12V癌基因的pcDNA4/T0-K-rasG12V质粒。
3.根据权利要求I所述的细胞系，其特征在于，所述的pcDNA4/T0-K-rasG12V质粒上12位密码子含有Kiasw2v突变的基因序列。
4.一种细胞系的建立方法，其特征在于，所述的细胞系为TRex-K-ras细胞系，所述的建立方法包括 (1)突变的K-rasG12VcDNA全编码序列经PCR扩增后插入pcDNA4/T0载体，产生pcDNA4/TO-K-rasG12V ； (2)经DNA测序证实pcDNA4/T0-K-ras质粒在12位密码子发生了点突变； (3)将pcDNA4/T0-K-rasG12V 质粒转入含 pcDNA6/TR 质粒的 TRex-293 细胞； (4)用稻瘟菌素和博来霉素筛选出转入TRex-K-ras^v质粒的稳定细胞克隆，并增殖扩展为 TRex-K-rasG12V-293 细胞系，其保藏号为 CCTCC NO :C201192。
5.一种如权利要求I所述的含有可诱导型癌基因的细胞系作为高通量药物筛选平台模型的用途。
6.一种以细胞为基础的高通量药物筛选平台，其特征在于，所述的细胞为TRex-K-rasG12V-293 细胞。
7.一种以如权利要求I所述的TReX-K-raSG12V-293细胞系为细胞模型的高通量药物筛选平台硬件系统的组成方案，其特征在于，所述的组成方案至少包含一台96通道高通量自动移液工作站和一台全自动酶标仪。
8.一对作为高通量药物筛选平台板间对照的对照板，其特征在于，所述的对照板分别使用 Tet/on 的 TRex-K-rasG12V-293 细胞和 Tet/off TRex-K_rasG12V-293 的细胞。
9.根据权利要求8所要求的对照板，其特征在于，所述的一对对照板分别同时接受八种常用标准抗癌药物的处理，所述的一对对照板内各自包含空白对照、标准对照和溶剂对照等三种对照。
10.一种以细胞为基础的高通量药物筛选数据的分析方法，其特征在于，所述的细胞为TRex-K-rasG12V-293细胞，所述的分析方法包括如下步骤 (1)酶标仪测得各孔吸光值后，应用相应的软件首先自动扣除背景值； (2)将所得各吸光值与DMSO对照组进行比较，得到某个化合物对on/off状态下TRex-K-rasG12V-293细胞的活性分数； (3)将某种化合物作用于Tet/off细胞所得活性分数与其作用于Tet/on细胞所得活性分数相除，即得到该种化合物的选择性指数；选择性指数越高，说明该种化合物对Kiasw2v突变的细胞的选择性杀伤作用越强。
全文摘要
本发明提供了一种含有可诱导型癌基因的细胞系，所述的细胞系的保藏号为CCTCC NOC201192，所述的细胞系中K-rasG12V蛋白的表达可被强力霉素所调控，所述的细胞系为TRex-K-rasG12V-293细胞系。本发明还提供以此作为筛选模型建立特异性抗肿瘤药物高通量筛选平台。
文档编号C12R1/91GK102766601SQ20111036507
公开日2012年11月7日 申请日期2011年11月17日 优先权日2011年11月17日
发明者宋鸣, 徐瑞华, 胡寓文, 黄蓬 申请人:中山大学肿瘤防治中心