专利名称：一种atc消旋酶和编码基因及其重组表达蛋白质的应用的制作方法
一种ATC消旋酶和编码基因及其重组表达蛋白质的应用
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及来源于假单胞菌的一种ATC消旋酶的编码基因， 以及重组蛋白质的表达与应用。
背景技术：
ATC消旋酶(ATC racemase)是一种催化拆分DL-ATC (DL-2-氨基Δ 2_噻唑啉-4-羧酸，DL-2-amino-A2-thiazoline-4-carboxylic acid)生成 L_ATC(L_2-氨基厶2-噻唑啉-4-羧酸，1^-2-&11^110-八2-让1&20111^-4-0&计0171化 acid)的酶。L-ATC 可作为底物，经过以S-氨甲酰-L-半胱氨酸(S-carbamyl-L-cysteine, L-SCC)或N-氨甲酰-L-半胱氨酸(N-carbamyl-L-cysteine，L-NCC)为中间产物的转化途径，生成终产物 L-半胱氨酸，所以ATC消旋酶也是参与酶法转化DL-ATC生产L-半胱氨酸的重要成员之一， 具体过程参见附图1。L-半胱氨酸(L-cysteine)是组成蛋白质的20种氨基酸之一，是一种α氨基酸， 它的存在可以保持蛋白质的稳定性，同一条或不同多肽链两个L-半胱氨酸残基间以二硫键(-S-S-)连接，使蛋白质具有稳定的空间立体结构。L-半胱氨酸在医药、食品、饲料、化妆品等行业具有广泛的用途，日益受到重视。目前L-半胱氨酸的生产方法主要有毛发水解后还原法、化学合成法、发酵法和酶法合成法等。微生物为酶源，采用酶法制备氨基酸的技术有了快速的发展。微生物酶法具有特异性强、生产工艺简单、副反应和副产物少等优点。特别是近年来，以酶法合成替代难于用发酵法生产的氨基酸，有了显著的进步。目前，有3种微生物酶法转化合成L-半胱氨酸的工艺路线(1)以3-氯L-丙氨酸为前体物的L-半胱氨酸酶法合成；(2)以0-乙酰丝氨酸为前体物的酶法合成L-半胱氨酸；(3)以DL-ATC为前体物的酶法生产L-半胱氨酸。DL-ATC是以丙烯酸甲酯为前体物合成的化工产品。对以DL-ATC为前体酶法合成 L-半胱氨酸转化途径的研究最早开始于1979年，日本学者Sano提出了完成该转化过程的两种假设一种是以L-SCC为中间产物的转化途径；另一种是以L-NCC为中间产物的转化途径。Sano在研究嗜硫氮杂环戊烯假单胞菌AJ38M菌株时，以不能利用D-ATC但可利用L-ATC合成L-半胱氨酸的菌株I^seudomonas desmolytica AJ3872为对照菌株，二者细胞悬液中均加入DL-ATC为底物进行酶促反应，结果发现AJ3872细胞对DL-ATC利用率不超过50%，而AJ38M细胞对DL-ATC的转化率却达到90%以上，由此证明了 AJ38M细胞中有 ATC消旋酶的存在，可催化从D-ATC到L-ATC的消旋化反应。目前，有关酶法合成L-半胱氨酸相关酶系的报道不多。
发明内容本发明的目的是提供一种新的ATC消旋酶及其编码基因，获得活力较高的重组蛋白质，并且这种ATC消旋酶可应用于酶法拆分DL-ATC进一步酶法生产L-半胱氨酸。
3
本发明申请人从污泥中分离得到了一株新的假单胞菌I^seudomonas sp. QR-101， 于2011年10月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号CGMCC No. 5315，经验证它进行以L-NCC为中间产物的L-半胱氨酸合成代谢途径，涉及ATC-消旋酶、L-ATC水解酶和L-NCC酰胺水解酶3个酶的协同催化作用。本发明提供的ATC消旋酶，来源于假单胞菌I^seudomonas sp. QR-101，是序列表中 SEQ ID No. 1的氨基酸残基序列或将SEQ ID No. 1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的缺失、替代或添加且具有与SEQ ID No. 1相同活性的由SEQ ID No. 1衍生的蛋白质。序列表中SEQ ID No. 1的氨基酸残基序列是由248个氨基酸残基组成的蛋白质。本发明所提供的ATC消旋酶的编码基因，是下列核苷酸序列之一序列表中SEQ ID No. 2的DNA序列，由744个碱基组成；编码序列表中SEQ ID No. 1蛋白质序列的多核苷酸序列。含本发明基因的表达载体及细胞体系均属于本发明的保护范围。所述的细胞体系为原核细胞体系。本发明重组ATC消旋酶蛋白可以通过以下方法获得培养含有ATC消旋酶表达载体的宿主菌E. coli BL21/pET-21a(+)-atcA，该细胞体系为原核细胞体系，在所规定的蛋白质表达条件下，获得表达产物ATC消旋酶。本发明的ATC消旋酶及其编码基因可在酶法拆分DL-ATC及进一步微生物酶法生产L-半胱氨酸中应用。本发明的有益效果本发明从一株假单胞菌中成功地克隆到一个新的ATC消旋酶基因并进行了表达/ 重组酶的制备和转化等研究，本发明涉及的ATC消旋酶的氨基酸序列通过GenBank Blast 发现，与来自 Pseudomonas sp. StrainBS 的 atcA (GenBank :BAD15357. 1)的同源性为 85%， 它们的核苷酸序列同源性为83%。利用高效表达ATC消旋酶的大肠杆菌E. coli BL21/ pET-21a (+) -atcA,催化拆分DL-ATC生成L-ATC，催化效率高，发酵成本低，且反应液中成分单一，后续分离纯化方便，生成的L-TAC可作为酶法生产L-半胱氨酸的底物，因此本发明在 L-半胱氨酸和L-胱氨酸的工业化生产领域具有良好的产业化价值。
图1 是酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的代谢途径示意图；图2 是I^seudomonas sp. QR-IOl的ATC消旋酶与数据库中已知序列ATC消旋酶 (GenBank :BAD15357. 1)的核苷酸序列比对。图3 是重组质粒pET-21a(+)/atCA的图谱。图4 是基因工程菌E. coliBL21/pET-21a(+)-atcA的酶切鉴定图。其中泳 it M =DNAMarker 15000 ；泳道 1 =EcoR I 单酶切质粒 pET_21a (+)-atcA (+)；泳道 2 =EcoR I 和Hind III双酶切质粒pET-21a(+)-atcA(+)；泳道3:EcoR I和HindIII双酶切质粒 pET-21a(+)；泳道4 以I^seudomonas sp. QR-IOl的基因组DNA为模板的PCR产物；以质粒 pET-21a(+) -atcA 为模板的 PCR 产物。
图 5:是基因工程菌 E. coli BL21/pET-21a(+)_atcA 表达蛋白的 SDS-PAGE 电泳图。其中，泳道1 :Pseudomonas sp. QR-IOl ；泳道2 基因工程菌Ε. coli BL21/ pET-21a(+)-atcA ；泳道 3 :Ε· coli BL21/pET_21a(+)。图6 重组ATC消旋酶活性的验证，其中A为不添加任何酶的D，L-ATC对照组，B为添加L-ATC水解酶和L-NCC酰胺水解酶组，C为添加重组ATC消旋酶、L-ATC水解酶和L-NCC 酰胺水解酶组，D为只添加重组ATC消旋酶组。
具体实施方式实施例1ATC消旋酶的克隆及一级结构特征本发明人从假单胞菌I^seudomonas sp. QR-101中提取基因组DNA，然后用Hind III酶切基因组DNA，用胶回收试剂盒从1. 2%的琼脂糖凝胶上分别回收2-91Λ的HindIII 酶切片段，将回收的酶切片段连接在经相同酶切处理的PUC18载体上，转入E. coli JM109 中，在涂有X-gal和IPTG的平板上进行蓝白初筛。将含有插入片段的重组白色单菌落，分别挑入每孔含50 μ L LB培养基，37°C过夜培养后，加入100 μ L0. 6% D，L-ATC作为底物，同时加入L-ATC水解酶(其基因序列见序列表SEQ ID No. 3)和L-NCC酰胺水解酶(其基因序列见序列表SEQ ID No. 4)各0. 5U，于 35°C振荡30min，分别加入150 μ L酸性茚三酮试剂(称取250mg茚三酮，溶于6mL乙酸和 4mL浓盐酸的混合液中)进行显色反应，以不加培养液的空白作为对照。通过微孔板复筛较高活性的重组子，并抽提质粒，然后进行DNA序列测定，结果显示阳性重组子PU025中含有插入片段为4539bp，在其中位于335-1078bp间有一个完整的读码框，为744bp(SEQ ID No. 2)，G+C含量为60. 48 %，编码M8aa，其计算分子量为 26. 22kD。将该 DNA 序列通过 GenBankBlast 发现，与来自 Pseudomonas sp. StrainBS 的 atcA(GenBank :BAD15357. 1)的同源性为85%，它们的核苷酸序列同源性为83%。因此，本发明的ATC消旋酶基因序列不同于现有文献报道的类似酶的序列，它是一个新基因。实施例2大肠杆菌基因工程菌的构建及重组ATC消旋酶的表达根据测序结果，按照该蛋白质编码基因的两末端序列设计引物Pl和P2，其中上游 Pl :5，-CCGGAA TTC ATG AAG CAT CAT CAG ACG GGC AT-3，含有 EcoR I 酶切位点；下游引物 P2 :5，-CCC AAGCTT CTA GCC CAA CAG TTT TCC CAGGC-3，含有 HindIII 酶切位点。以菌株I^seudomonas sp. QR-IOl的基因组为模板，按如下PCR程序进行DNA扩增94°C变性lmin，66°C复性lmin，72°C延伸Imin，扩增反应进行30个循环。PCR扩增产物经EcoR I和Hind III双酶切后，连接到经相同酶切后的载体 pET-21a(+)，构建重组子 pET21-a(+) /atcA。获得的重组子pET-21a(+)/atCA采用&(12法转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)，经鉴定后获得BL21 (pET-21a(+)/atcA)工程菌。将BL21(pET_21a(+)/atcA)工程菌于37°C活化过夜，按1 100转接到IOOmL含 100μ g/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37°C培养至对数生长期；加入终浓度为ImM的IPTG， 37°C继续培养池；4°C，6，000r/min离心lOmin，收集菌体，加入0. lmol/L磷酸钾缓冲液(pH8.0)悬浮洗涤后，6，000r/min离心lOmin，收集菌体，重复洗涤一次，加入磷酸钾缓冲液制成酶源细胞悬液。实施例3重组ATC消旋酶活性的验证取实施例2中的酶源细胞悬液，调整终浓度至20g/L，于5mL反应管中，依次加入 3mL 0. 5%的底物DL-ATC和1. 5mL的混合酶液，其中，各组中混合酶液的成分如表1示。表一混合酶液的成分
组号重组ATC消 Si源颜胞 (20级)LATC水編 (100U/mL)I^NCC EIM^SI (100U/mL)0.1mol/L 缓赚 (pH8.0)A(对照)0001.5 mlB00.5 mL0.5 mL0.5 mLC0.SmL0.5 mL05 mL0D0.5 mL001.0 mL35°C水浴池，各个反应液冷冻干燥，然后溶解于300 μ L异丙醇中，采用高效液相色谱方法测定其中D-ATC和L-ATC的含量。高效液相色谱采用CHIRALPAK IC 柱(0. 46cm I. D. X 25cm L) (Daicel chiral technologies CO.，LTD.，Sianghai，CHINA)，该液相条件为紫外检测器 SPD-10A，检测波长是220nm，流动相为正己烷-异丙醇(85 15)，含0. 2 %三氟乙酸和0. 1 %二乙胺，室温条件下分析，进样量为10 μ L。结果如图6所示，D-ATC和L-ATC的保留时间分别为11. Omin和18. 5min。在不添加任何酶的对照组中，D-ATC和L-ATC的含量各占约50%，且随着反应时间延长，浓度不变 (图6A).当反应液中同时加入L-ATC水解酶和L-NCC酰胺水解酶时，因为L-ATC作为底物能被L-ATC水解酶作用，生成的中间产物L-NCC又在L-NCC酰胺水解酶的作用下生成L-半胱氨酸，所以，最终反应液中L-ATC的浓度下降至12%，但由于没有ATC消旋酶的作用，因此 D-ATC的浓度不变(图6B)。当反应液中同时加入重组ATC消旋酶、L-ATC水解酶和L-NCC 酰胺水解酶酶源细胞时(C组)，在L-ATC水解酶和L-NCC酰胺水解酶的作用下，L-ATC被转化生成L-半胱氨酸，随着L-ATC的浓度下降，打破了 L-ATC与D-ATC各占50%的比例，因此在ATC消旋酶的作用下，随着L-ATC的消耗，D-ATC也被消旋生成L-ATC，最终反应液中 L-ATC和D-ATC的浓度都下降，二者比例仍为1 1(图6C)。但是，在只加入ATC消旋酶的 D组中，二者的消旋反应处于动态平衡，且L-ATC没有被转化消耗，因此D-ATC不被催化生成L-ATC，L-ATC和D-ATC的浓度均未发生变化(图6D)。综上可以说明，当L-ATC水解酶和L-NCC酰胺水解酶作用于L-ATC生成L-半胱氨酸时，由于L-ATC被消耗，重组的ATC消旋酶发挥活性，可催化消旋D-ATC生成L-ATC，生成的L-ATC继而被继续催化最终生成L-半胱氨酸。因此，重组表达的ATC消旋酶可用于微生物酶法转化生产L-半胱氨酸，有效提高 DL-ATC的利用率。实施例4以重组大肠杆菌的发酵菌体为ATC消旋酶酶源，转化DL-ATC生产L-半胱氨酸①反应体系组成底物10g/L的 DL-ATC
反应温度;35°CPH 8. 0ATC消旋酶酶源4g/L
L-ATC 水解酶1000U/LL-NCC 酰胺水解酶1000U/L②转化率在上述条件下，反应体积为3L，35°C反应池后，底物转化率约为81%。
权利要求
1.一种ATC消旋酶，其特征在于，是序列表中SEQ ID No. 1氨基酸残基序列或将SEQ ID No. 1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的缺失、替代或添加且具有与SEQ ID No. 1相同活性的由SEQ ID No. 1衍生的蛋白质。
2.—种权利要求1所述的ATC消旋酶的编码基因，它是下列核苷酸序列之一1)是序列表SEQID No. 2的核苷酸序列；2)编码序列表中的SEQID No. 1蛋白质序列的多核苷酸序列。
3.一种含有权利要求2所述基因的表达载体。
4.一种含有权利要求2所述基因的细胞体系。
5.根据权利要求4所述的基因的细胞体系，其特征在于，所述的细胞体系为原核细胞系统。
6.权利要求1所述的ATC消旋酶在微生物酶法生产L-半胱氨酸中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种ATC消旋酶和编码基因序列及其重组表达蛋白质的制备及应用。本发明所提供的来源于假单胞菌(保藏号CGMCC No.5315)的ATC消旋酶是序列表中SEQIDNo.1的氨基酸残基序列或将SEQ ID No.1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的替代、缺失或添加具有与SEQ ID No.1相同活性的由SEQ ID No.1衍生的蛋白质。编码基因序列是序列表中SEQ ID No.2的核苷酸序列。本发明将来源于假单胞菌ATC消旋酶基因克隆并表达制备重组酶，可用于生物法将DL-ATC催化拆分成L-ATC，生成的L-ATC作为底物，可用于酶法生产L-半胱氨酸。
文档编号C12N15/63GK102417900SQ20111036509
公开日2012年4月18日 申请日期2011年11月17日 优先权日2011年11月17日
发明者刘磊, 姚瑞娟, 张奇, 段静静, 王文芳, 高智慧 申请人:南开大学, 天津启仁医药科技有限公司