专利名称：油田污水管道内壁生物膜测取及生物膜分析方法
技术领域：
本发明涉及一种生物污损原位监测技术，具体地说是一种油田污水管道内壁生物膜测取及生物膜分析方法，通过对生物膜的测取分析获得生物膜中腐蚀性微生物的含量、 菌群分布，总生物量、生物膜特性及组成，在此基础上筛选适应的高效的生物杀菌剂及其用量，达到杀菌剂用量少、防腐效果好、经济效益好的防腐的目的。
背景技术：
在油田污水处理系统中，微生物腐蚀对金属管道、设备造成了严重的影响，受到越来越多的重视。研究表明，微生物腐蚀与设备管线表面的生物膜具有密切的关系。在生物膜中，微生物生活在一个与自由悬浮状态完全不同的微生态环境中，微生物大体上是不动的， 被包藏于水化的有机质中。生物膜中的细胞密度比悬浮状态要高，有时甚至高出5 6个数量级，相邻位置细胞之间通过长时间接触可能产生生理相互作用，导致协同微生物作用。 微生物不仅能将水中组分转化成不溶性的生物质，使之沉积在表面，而且还将水中其他杂质带到表面形成污垢，内部成为适合厌氧菌生存的环境。在生物膜中，常见的参与腐蚀的细菌种类不是很多，一般可分为好氧细菌和厌氧细菌两大类。其中好氧细菌指环境中在游离氧的条件下才能生存的一类细菌，主要有铁细菌和硫细菌等，和腐蚀过程有关的铁细菌主要是氧化铁杆菌，在中性含有机物和可溶性铁盐的水、土壤、锈层中都可以存在，最适宜生长温度为25°C 30°C，pH值在7. 1 7. 4之间。 和腐蚀有关的硫细菌主要是硫杆菌属的细菌，如氧化硫杆菌、排硫杆菌和水泥崩解硫杆菌等，其中氧化硫杆菌最常见。它的最适宜生长温度是28°C 30°C，pH值在2. 5 3. 3之间。 厌氧细菌指在缺乏游离氧或者几乎无游离氧的条件下才能生存，有氧反而不能生存的一类细菌。典型的与腐蚀过程相关的厌氧细菌主要是硫酸盐还原菌。生物膜的首要危害就是参与和加速了管道及相关设备的腐蚀。由于生物膜在自然状态下是各种各样的微生物混杂在一起形成的混合群体，并且存在复杂的生态关系，因此生物膜下的微生物腐蚀实际上并非一种微生物单独作用的结果，往往存在多种微生物联合的作用，仅仅对单种微生物在纯培养的基础上分别在有菌和无菌条件下作暴露试验很难表达实际过程中微生物腐蚀的历程。此外，生物膜会因为老化、水流速度改变等原因造成脱落而恶化水质，使水的色度和浊度上升，细菌数量增加。管壁生物膜的影响因素很多，包括水中的营养基质浓度、水流速度等水力因素、消毒剂的浓度、水中游离菌的数量、水温、管段材质和使用年限等。但到目前为止，有关研究尚处于初级阶段，因为实际给水管网中生物膜的采样研究比较困难，而且在一个运行正常的给水管网中生物膜往往是一个小型的稳定生态系统，很难对实际生物膜的发生、发展和变化情况进行完整有效的监测。生物膜的研究近年来引起了国内外的高度重视，许多实验室和学者针对生物膜的形成、危害、预防等领域展开研究，目前已经取得许多成果。生物膜内细菌计数手段主要有显微镜直接计数、最大可能细菌计数以及琼脂平板计数等与腐蚀有关的实验室细菌研究常用手段。由于人工培养基不同于微生物的自然生活环境，在培养过程中已经具有一定的选择性，不适合培养基的微生物在与优势菌种的竞争中会逐渐处于劣势甚至被淘汰；加之生物膜的预处理较困难，将菌胶团破碎成单细胞悬浊液几乎是不可能的。因此，培养法得出的生物量实际上远远小于自然环境中的真实值， 只具有相对意义。而先进的分子生物学技术如DGGE、PCR、FISH等，已经实现环境微生物多样性的检测、特定功能菌或功能基因的检测、量化环境中的微生物种群等，但操作繁琐费用高昂，也不适合复杂环境下操作。原位测定不涉及生物膜与载体的分离及菌胶团的破碎， 所用方法多为生物化学和物理(如称重和显微镜直接计数)方法等，可以避免培养法中细胞分离和培养基的选择性等缺陷，国内外常用的指标有MLSS、MLVSS, T0C, COD、胞外多聚物 (EPS)、总蛋白质、肽聚糖、脂多糖等，这些指标又可以分为三类，如前四个指标表征的是生物膜总组分，包括细胞和非细胞成分。EPS代表的是膜中的非细胞成分，后三者代表细胞内的组分或代谢物质，后者对于微生物生长动力学和工程设计等问题所要求的活细菌数更有意义。目前90 98%的生物膜脂类是以磷脂的磷含量表征，易用比色法测定，以它表示生物量已经在许多饮用水生物处理的研究中得到应用，并被证明是行之有效的。目前浮游的微生物通常采用化学杀菌的手段加以控制，且对液体介质中的细菌数量检测手段比较成熟。而生物膜中的微生物由于取样困难，且由于生物膜中的胞外聚合物阻碍了化学杀菌剂对膜内细菌的作用，化学杀菌剂很难达到杀灭膜内细菌的目的，而老化的生物膜脱落后，将细菌带回流动介质，造成水环境中微生物二次污染。为了能真实反映油田水系统中微生物生物膜的生长状况，实际水体中微生物生物膜监测具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种油田污水管道内壁生物膜测取及生物膜分析方法，克服上述已有技术只能培养生物膜或培养单一菌种进行分析而不能在线测取生物膜缺陷。一种油田污水管道内壁生物膜测取方法通过由安装在油田污水管道壁上的球阀控制，由与球阀螺纹连接的护套，护套上端内周的密封圈、压在密封上且与护套螺纹连接压帽，设在压帽上的定位螺丝，穿过压帽、护套和球阀中心穿入污水管道内壁处的取样杆及安装在取样杆下端的试片携带器组成的取样器，将与污水管道同材料的试片挂在污水管道内壁处，通过试片测取污水管道的生物模；测取生物膜的周期在14天以上，可根据对生物膜厚薄的要求延长测取生物膜的周期。为测取油田污水管道内壁同一个截面的环周腐蚀情况可在油田污水道内壁同一截面的环周均勻安装4-6个取样器，测取同一截面不同方位的试片进行分析。一种油田污水管道内壁生物模分析方法其特征在于依据权利要求1所述的油田污水管道内壁生物膜测取方法测取的生物模分别进行菌量检测、菌种鉴别、总生物量检测及杀菌剂对膜中细菌活性抑制能力的检测，其检测分析方法为(1)生物膜中游离菌量检测将试片表面的生物膜小心的刷下，溶解于一定体积的生理盐水溶液中，分别用SRB、TGB、IB细菌测试瓶，利用绝迹稀释法测试刷下的生物膜中可悬浮于水溶液中的菌量。此结果可用来衡量输水管道内壁生物膜中可游离进入管道污水中的生物量。(2)菌种鉴别采用平板表面涂布法吸取(1)中含细菌的生理盐水稀释液进行涂布分离，并在恒温恒湿条件下培养后，在平板培养基表面形成若干分散的单菌落，分别挑取典型的单菌落再次进行涂布培养，最后获得纯化菌落，进行进一步的鉴定。(3)总生物量检测另取一只平行生物膜取样器上试片，采用比色法测定试片表面生物膜中磷含量，获得生物膜中总生物量的数据。此指标对于微生物生长动力学和工程设计等所要求的活细菌数有重要意义。(4)杀菌剂对膜中细菌活性抑制能力检测选取几种杀菌剂评价杀菌剂对生物膜中细菌的杀死能力。将带生物膜的试片悬于加有不同浓度杀菌剂的灭菌油田污水中，定期检测污水中腐蚀性微生物的细菌含量，跟踪一段时间，对杀菌剂对生物膜内细菌杀灭能力进行比较，最终得到杀菌剂最低抑菌浓度。由于生物膜中细菌有胞外高聚物的保护，一般按照实验室菌悬液获得的杀菌剂加入量很难达到杀灭管壁生物膜中腐蚀性微生物的目的，在不破坏管道，不改变管壁生物膜状态的情况下，采用此法针对管壁上的生物膜原位评价筛选杀菌剂可获得更加贴近实际情况的效果。本发明与已有技术相比具有以下优点1、利用在经取样器能测取到油田污水管道运行中的内壁生物膜，对比生物进行分析所测取的数据误差小，对选择适宜的高效益杀菌剂、杀菌效果好、节约成本；2、对在线测取的生物膜分析方法，能全方位的检测出生物膜中的菌种菌量、生物总量及杀菌剂对生物膜中细菌活性抑制能力，能优选出对应的杀菌效果好的杀菌剂；3、在线取样器结构简单，取样安全。
附图-取样器的安装结构示意图1-取样杆；2-压冒；3-定位螺丝；4-密封圈；5-护套；6_球阀；7_试片携带器； 8-试片固定螺丝；9-试片；10-污水管道；11-球阀开关手柄。
具体实施例方式为进一步公开本发明的技术方案，下面结合说明书附图通过实施例作详细说明测取油田污水管道内壁生物膜是通过把取样器安装在油田污水管道10上，把测取生物膜的试片9通过取样杆1挂在油田污水管道内壁处，经14天以上的测取周期，把试片取出获得在线的生物膜的。具体取油田污水管道内壁生物膜的具体做法是，先卸松压帽2上的定位螺丝3，用手轻提取样杆1，由于密封圈4的作用，污水不会泄漏，把试片提到护套5内。用球阀开关手柄11把球阀6关闭，卸下护套5，把试片固定螺丝8从试片携带器7上卸下即取到附着在试片上的生物膜；通过对生物膜的分析方法步骤，分别进行菌量检测、菌种鉴别，总生物量检测及杀菌剂对生物膜中细菌活性抑制能力的检测；其检测分析方法为(1)生物膜中游离菌量检测。将试片表面的生物膜小心的刷下，溶解于一定体积的生理盐水溶液中，分别用SRB、TGB、IB细菌测试瓶，利用绝迹稀释法测试刷下的生物膜中可悬浮于水溶液中的菌量。此结果可用来衡量输水管道内壁生物膜中可游离进入管道污水中的生物量。(2)采用平板表面涂布法吸取(1)中含细菌的生理盐水稀释液进行涂布分离，并在恒温恒湿条件下培养后，在平板培养基表面形成若干分散的单菌落，分别挑取典型的单菌落再次进行涂布培养，最后获得纯化菌落，进行进一步的鉴定。(3)另取一只平行生物膜取样器上试片，采用比色法测定试片表面生物膜中磷含量，获得生物膜中总生物量的数据。此指标对于微生物生长动力学和工程设计等所要求的活细菌数有重要意义。(4)选取几种杀菌剂评价杀菌剂对生物膜中细菌的杀死能力。将带生物膜的试片悬于加有不同浓度杀菌剂的灭菌油田污水中，定期检测污水中腐蚀性微生物的细菌含量， 跟踪一段时间，对杀菌剂对生物膜内细菌杀灭能力进行比较，最终得到杀菌剂最低抑菌浓度。由于生物膜中细菌有胞外高聚物的保护，一般按照实验室菌悬液获得的杀菌剂加入量很难达到杀灭管壁生物膜中腐蚀性微生物的目的，在不破坏管道，不改变管壁生物膜状态的情况下，采用此法针对管壁上的生物膜原位评价筛选杀菌剂可获得更加贴近实际情况的效果。
权利要求
1.一种油田污水管道内壁生物膜测取方法其特征在于通过由安装在油田污水管道壁上的球阀控制，由与球阀螺纹连接的护套，护套上端内周的密封圈、压在密封上且与护套螺纹连接压帽，设在压帽上的定位螺丝，穿过压帽、护套和球阀中心穿入污水管道内壁处的取样杆及安装在取样杆下端的试片携带器组成的取样器，将与污水管道同材料的试片挂在污水管道内壁处，通过试片测取污水管道的生物膜；测取生物膜的周期在14天以上，可根据对生物膜厚薄的要求延长测取生物膜的周期。
2.根据权利要求1所述的油田污水管道内壁生物膜测取方法其特征在于为测取油田污水管道内壁同一个截面的环周腐蚀情况可在油田污水道内壁同一截面的环周均勻安装 4-6个取样器，测取同一截面不同方位的试片进行分析。
3.—种油田污水管道内壁生物模分析方法，其特征在于依据权利要求1所述的油田污水管道内壁生物膜测取方法测取的生物膜分别进行菌量检测，菌种鉴别、总生物量检测及杀菌剂对膜中细菌活性抑制能力的检测；其检测分析方法为(1)生物膜中游离菌量检测将试片表面的生物膜小心的刷下，溶解于一定体积的生理盐水溶液中，分别用SRB、TGB、IB细菌测试瓶，利用绝迹稀释法测试刷下的生物膜中可悬浮于水溶液中的菌量，此结果可用来衡量输水管道内壁生物膜中可游离进入管道污水中的生物量；(2)菌种鉴别采用平板表面涂布法吸取(1)中含细菌的生理盐水稀释液进行涂布分离，并在恒温恒湿条件下培养后，在平板培养基表面形成若干分散的单菌落，分别挑取典型的单菌落再次进行涂布培养，最后获得纯化菌落，进行进一步的鉴定；(3)总生物量检测另取一只平行生物膜取样器上试片，采用比色法测定试片表面生物膜中磷含量，获得生物膜中总生物量的数据，此指标对于微生物生长动力学和工程设计等所要求的活细菌数有重要意义；(4)杀菌剂对膜中细菌活性抑制能力检测选取几种杀菌剂评价杀菌剂对生物膜中细菌的杀死能力。将带生物膜的试片悬于加有不同浓度杀菌剂的灭菌油田污水中，定期检测污水中腐蚀性微生物的细菌含量，跟踪一段时间，对杀菌剂对生物膜内细菌杀灭能力进行比较，最终得到杀菌剂最低抑菌浓度，由于生物膜中细菌有胞外高聚物的保护，一般按照实验室菌悬液获得的杀菌剂加入量很难达到杀灭管壁生物膜中腐蚀性微生物的目的，在不破坏管道，不改变管壁生物膜状态的情况下，采用此法针对管壁上的生物膜原位评价筛选杀菌剂可获得更加贴近实际情况的效果。
全文摘要
油田污水管道内壁生物膜测取及生物膜分析方法，通过由安装在油田污水管道内壁的内球阀控制，由与球阀螺纹连接的护套，护套上端内周的密封圈压在密封上且与护套螺纹连接压帽，设在压帽上的定位螺丝，穿过压帽、护套和球阀中心插入污水管道内壁处的取样杆及安装在取样杆下端的试片携带器组成的取样器，将与污水管道相同材质的试片挂在污水管道内壁处，通过试片测取污水管道的生物膜；测取生物膜的周期在14天以上，可根据对生物膜厚薄的要求延长测取生物膜的周期，而后对所测取的生物膜进生分析检测，分别进行菌量检测、菌种鉴别总生物量检测及杀菌剂对膜中细菌活性抑制能力的检测，从中筛选出适应的杀菌剂，从而达到杀菌效果好，用药量少和节约污水处理成本的目的。
文档编号C12Q1/18GK102517377SQ20111038759
公开日2012年6月27日 申请日期2011年11月19日 优先权日2011年11月19日
发明者刘宏芳, 叶琴, 李清方, 王田丽, 秦双, 管善峰, 韩霞 申请人:华中科技大学, 胜利油田胜利勘察设计研究院有限公司