专利名称：用于羊痘病毒属病毒鉴定的基因芯片及其检测方法
技术领域：
本发明属于生物芯片领域。具体而言，本发明涉及一种羊痘病毒属病毒(包括山羊痘病毒、绵羊痘病毒及牛疙瘩皮肤病病毒)的芯片检测装置。
背景技术：
羊痘病毒属病毒能引起山羊、绵羊和牛的皮肤、器官表面广泛性结节和水肿，病畜产乳量急剧减少，皮毛品质极大下降，造成巨大经济损失。山羊痘、绵羊痘病毒引起的羊痘又名羊“天花”，是羊的一种急性、热性、接触性传染病。绵羊痘和山羊痘，被我国列为一类传染病，对畜牧业养殖影响重大。据不同毒株的毒力差异，易感羊群的致死率可达10% 58% 或75% 100%不等。羔羊致死率可达100%，妊娠母羊极易流产。同时，因自由贸易受到限制造成了国家税收的下降，致使此病也成为了重要的经济疾病。该病呈世界性分布，我国近年来在如广西、贵州、黑龙江、甘肃等地也有发生。牛疙瘩皮肤病病毒引起牛的疙瘩皮肤病， 又称牛结节性皮炎或块状皮肤病，是以患牛发热、皮肤、黏膜、器官表面广泛性结节，淋巴结肿大，皮肤水肿为特征的传染病，能引起感染动物消瘦，产乳量大幅度降低，严重时导致死亡。被世界动物卫生组织(OIE)列为必须通报的动物疫病，感染率为5% 85%，病死率为 10%。此外，本病在公共卫生方面也有一定的意义，印度和斯堪的纳维亚都有人类感染羊痘病毒的报道。在印度，管理患病动物的人有的手和腿上发生红色丘疹，继而出现水疱并结痂，但未见有全身性的扩散。张瑞阳等(2003)首次报道了我国人感染羊痘的病例，病人手指、口唇、面颊等部位出现丘疹。山羊痘、绵羊痘和牛疙瘩皮肤病病毒很强的宿主特异性，自然条件下，不会发生交叉感染。本病毒对上皮细胞有特殊亲和力，因此无论通过哪种途径进入机体的病毒，最终都经血液达到皮肤和粘膜，在上皮细胞内增殖，引起一系列的炎症过程而发生特异性的痘疹。 山羊和绵羊均为易感动物。本病多有病羊和含有羊痘病毒的皮屑随风和灰尘吸入呼吸道而感染，也可以通过损伤的皮肤及消化道传染。丘疹中含大量病毒，黏膜上的丘疹破溃后可从鼻、口分泌物和泪液排泄病毒。病毒进入乳汁、尿液和精液也可成为病毒传播的重要来源。 被病羊污染的用具、饲料、垫草，病羊的粪便、分泌物、皮毛和体外寄生虫(如羊虱)都可以成为传播媒介。该病以春秋两季多发，主要在冬季春初流行，常呈地方性或广泛流行。气候严寒、雨雪、霜冻、枯草和饲养管理不良等因素都有助于本病的发生和加重病情。目前控制该病最有效的方法还是使用高效疫苗对易感动物进行免疫接种。综上所述该病毒的检测对动物饲养和人类健康有重要的意义。利用基因芯片检测羊痘病毒属病毒具有快速、敏感、特异、高通量和自动化的优点。在对食品安全和出入境的快速检测中起着重要作用，同时还可以减少该病毒的传播。牛疙瘩皮肤病病毒是引起牛疙瘩皮肤病的一种病毒。只要是病毒都可能存在变异的，牛疙瘩皮肤病病毒野毒株是指从自然发病的动物上分离的牛疙瘩皮肤病病毒，与标准毒株之间可能存在个别碱基的突变。牛疙瘩皮肤病病毒疫苗株是目前非洲地区以及其它地区，需要给牛注射疫苗，而选用的牛疙瘩皮肤病病毒经典毒株制备疫苗，通常称该毒株为疫苗株。本发明涉及的毒株均为已知，例如牛疙瘩性皮肤病疫苗株Neethling vaccine Lff 1959株购自南非(Bio Onderst印oort，批号8545)，牛疙瘩性皮肤病野毒株Neethling M90株基因组DNA已由法国某生物实验室公布，由病毒基因组0RF132基因的克隆测序结果可知，两者的同源性为97. 93%。
发明内容
本发明的目的是建立一种灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果的微阵列芯片检测羊痘病毒属三种病毒的基因芯片。为了实现上述目的本发明采用如下技术方案用于羊痘病毒属病毒鉴定的基因芯片检测装置，包括PCR反应混合液管、Taq聚合酶、PCR阳性对照、PCR阴性对照、ddH20、检测芯片、芯片探针的点样分布、山羊痘病毒两条检测探针的核苷酸序列、绵羊痘病毒两条检测探针的核苷酸序列、疙瘩皮肤病病毒疫苗株两条检测探针的核苷酸序列、疙瘩皮肤病病毒野毒株两条检测探针的核苷酸序列、芯片盖片、杂交液、杂交阳性对照、杂交盒。采用基因芯片微量点样技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的基片上，形成的微阵列。微阵列包括质控探针区和待测样品探针区，其中所述质控探针区内设置下述分区
点样位置质控分区P1，包含至少一个点样位置质控探针SEQ ID N09； 杂交阳性质控分区P2，包含至少一个杂交阳性质控探针SEQ ID NOlO ； 杂交阴性质控分区N，包含点样缓冲液；
所述待测样品探针区内设置下述包括至少一个待测样品探针的分区
山羊痘病毒1号探针分区1，
山羊痘病毒2号探针分区2，
绵羊痘病毒1号探针分区3，
绵羊痘病毒2号探针分区4，
牛疙瘩皮肤病病毒疫苗株1号探针分区5，
牛疙瘩皮肤病病毒疫苗株2号探针分区6，
牛疙瘩皮肤病病毒野毒株1号探针分区7，
牛疙瘩皮肤病病毒野毒株2号探针分区8。各个探针序列如下
山羊痘病毒1号探针SEQ ID NOl ； 山羊痘病毒2号探针SEQ ID N02 ； 绵羊痘病毒1号探针SEQ ID N03 ； 绵羊痘病毒2号探针，SEQ ID N04 ； 牛疙瘩皮肤病病毒疫苗株1号探针，SEQ ID N05 ； 牛疙瘩皮肤病病毒疫苗株2号探针，SEQ ID N06 ； 牛疙瘩皮肤病病毒野毒株1号探针，SEQ ID N07 ； 牛疙瘩皮肤病病毒野毒株2号探针SEQ ID N08o利用上述基因芯片检测山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛疙瘩皮肤病病毒疫苗株和牛疙瘩皮肤病病毒野毒株的检测方法，包括如下步骤
(1)待测样品制备按照商品化DNA提取试剂盒使用说明书提取患病动物的组织或病毒的细胞增殖液的全基因组DNA，制备待测样品DNA。(2)PCR 扩增25 μ L PCR 反应液包含PCR Mix 12. 5 μ L,5U/y L PCR Taq 酶 0.4 μ L、待测样品DNA 5 μ L、无核酸酶灭菌水7. 1 μ L ；
其中，所述 PCR Mix 含有 10XPCR Buffer 2.5 μ L, 2. 5 mmol/L dNTP Mix 2 μ L, 25 mmol/L 氯化镁 2 μ L，
10 μ mol/L山羊痘病毒上游引物SEQ ID NOll 0.5 μ L, 10μmol/L绵羊痘上游引物SEQIDN012 0.5 μ L， 10 μ mol/L PCR 通用下游引物 SEQ ID N013 5 yL；
按如下步骤进行扩增95°C 5 min ；95°C 30 sec,50°C 30 sec,72°C 1 min循环45次； 72°C 8 min。(3)杂交首先配制杂交液杂交缓冲液7. 5 μ L、PCR扩增产物5 μ L、杂交阳性对照2. 5 μ L，混勻后95°C变性5min，冰上放置5min，然后用15 μ L杂交液进行杂交。(4)结果判读用微阵列芯片扫描仪扫描分析，去除阴性对照背景，与芯片杂交说明对照，判定结果。本发明具有如下优点
(1)成功地构建了 GTPV&SPPV&LSDV检测基因芯片本发明所制备的基因芯片采用的各条筛选探针可与对应病毒目的基因进行特异性结合，杂交信号较强且稳定。(2)制备的检测基因芯片具有良好的方法学特征本发明建立了一种特异性好、灵敏度高、稳定性强和节时省力的基因芯片检测方法。(3)检测基因芯片的构建，为混合感染疾病的同步检测和鉴别诊断提供快速、高效的手段为今后出入境动物检疫和相应疫病控制提供了技术保障。对满足进出境动物检疫工作的需要，控制羊痘病毒属病毒的传播，并防止牛疙瘩皮肤病毒由境外向我国扩散，保障我国的畜牧业安全、健康发展具有十分重要的意义。
图1芯片探针分布示意图； 图2山羊痘病毒杂交结果示意图； 图3绵羊痘病毒杂交结果示意图4牛疙瘩皮肤病病毒疫苗株杂交结果示意图； 图5牛疙瘩皮肤病病毒野毒株杂交结果示意图中Ρ1-点样位置质控分区；Ρ2-杂交阳性质控分区；N-杂交阴性质控分区；1-山羊痘病毒1号探针分区；2-山羊痘病毒2号探针分区；3-绵羊痘病毒检1号探针分区；4-绵羊痘病毒2号探针分区；5-牛疙瘩皮肤病病毒疫苗株1号探针分区；6-牛疙瘩皮肤病病毒疫苗株2号探针分区；7-牛疙瘩皮肤病病毒野毒株1号探针分区；8-牛疙瘩皮肤病病毒野毒株2号探针分区；
杂交说明P1 探针固定阳性对照，监控芯片点样过程，芯片杂交前后都应阳性；P2 杂交阳性对照，监控芯片杂交过程，检测任何样品都应阳性； N 杂交阴性对照，检测任何样品都应阴性；
山羊痘病毒基因组DNA经PCR扩增产物的杂交结果除质控探针符合要求外，1、2号探针亮；
绵羊痘病毒基因组DNA经PCR扩增产物的杂交结果除质控探针符合要求外，3、4号探针亮；
牛疙瘩皮肤病疫苗株病毒基因组DNA经PCR扩增产物的杂交结果除质控探针符合要求外，1、5、6号探针亮；
牛疙瘩皮肤病野毒株病毒基因组DNA经PCR扩增产物的杂交结果除质控探针符合要求外，1、7、8号探针亮。
具体实施例方式面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于实施例。实施例1，本发明是基于对羊痘病毒属山羊痘病毒、绵羊痘病毒及牛疙瘩皮肤病病毒的细胞增殖，提取病毒基因组DNA。对山羊痘病毒、绵羊痘病毒及牛疙瘩皮肤病病毒的 0RF132基因进行克隆、测序分析，根据测序结果设计了 8条寡核苷酸探针，可与相应的病毒基因组DNA的PCR产物进行特异性结合，PCR进行基因组扩增时，下游引物5'端利用Cy3 荧光色素进行标记，探针可与此产物在56°C下进行杂交。根据荧光信号位置、强度判断杂交结果，以此来鉴定山羊痘病毒、绵羊痘病毒及牛疙瘩皮肤病病毒。根据Genbank网站上公布的山羊痘、绵羊痘及疙瘩皮肤病病毒0RF132基因序列利用I^rimer Premier 5. 0生物软件设计PCR引物SEQ ID NOlUSEQ ID N012和SEQ ID N013。同时，克隆基因序列，并进行测序、比对分析，选取差异性序列在利用fastPCR生物软件设计所述8条特异性寡核苷酸探针，SEQ ID NOl、SEQ ID N02、SEQ ID N03、SEQ ID N04、SEQ ID N05、SEQ ID N06、SEQ ID N07、SEQ ID N08o通过这3条PCR引物和8条特异性的探针，可以特异的、敏感的快速鉴定区别4种病毒。根据国家质量监督检验检疫总局文件(2009. 178号)《关于进一步加强进出境猪甲型Hmi流感检验检疫工作的通知——A型流感分型基因芯片检测方法》提供的质控序列合成本发明用质控序列SEQ ID N09、SEQ ID N010。每条探针的5'端均通过15个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基，具体核苷酸序列如下
SEQ ID NOl 为
5’ -nh2-t15-atgcaataataacgatagttattggtttgttaatattttagaa ；
SEQ ID N02 为
5’ -nh2-t15-atggaatatgtaataatgttcctatatgtattgatggataatt ；
SEQ ID N03 为
5’ -nh2-t15-agaatatgtaacaatgttcatcatgtattgatggagaagttaa ；
SEQ ID N04 为
5’ -nh2-t15-tttactctctctcaacaattcttataatggtctatttt ；
SEQ ID N05 为5’ -nh2-t15-tgattgtgtaagctttaactctacaacataatacaactgtt ；
SEQ ID N06 为
5’ -nh2-t15-acaatgatgatgttaaaactgaactcgttacattatgtgatgt ；
SEQ ID N07 为
5’ -nh2-t15-cagatgattgcgtaagctttaactctacatataatacaactgt ；
SEQ ID N08 为
5’ -nh2-t15-aaactgaacttgttacgttgtgtgatgtatctaaagaagtaca ；
SEQ ID N09 为5，-NH2-T15-GCTGCCTCGGCAAGGAGT_TAMRA ； SEQ ID NOlO 为5，-NH2-T15-ATCACTTGCTTCCGTTGAGG。实施例2，参见图1，用于羊痘病毒属病毒鉴定的基因芯片，采用基因芯片微量点样技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的基片上，形成8行X 6列的微阵列。微阵列上探针分布从上到下依次为点样位置质控分区Pl 1行X6点，杂交阳性质控分区P2 :1行X6点，杂交阴性质控分区N :1行X6点，山羊痘病毒检测探针分区1 :1 行X 3点，山羊痘病毒检测探针分区2 1行X 3点，绵羊痘病毒检测探针分区3 1行X 3点， 绵羊痘病毒检测探针区分4 :1行X3点，牛疙瘩皮肤病病毒疫苗株检测探针分区5 :1行X3 点，牛疙瘩皮肤病病毒疫苗株检测探针分区6 1行X 3点，牛疙瘩皮肤病病毒野毒株检测探针分区7 :1行X 3点，牛疙瘩皮肤病病毒野毒株检测探针分区8 :1行X 3点，点样位置质控分区Pl 1行X6点。每张芯片上有至少一个上述微阵列，每个微阵列可以检测一份样品。杂交阴性质控分区N，包含点样缓冲液，点样缓冲液为市售产品，例如博奥生有限公司生产的。其余各分区包括对应的检测探针和质控探针。图2 5为本发明的具体实施方式
，分别为山羊痘病毒基因组DNA经PCR扩增产物的杂交结果绵羊痘病毒基因组DNA经PCR扩增产物的杂交结果牛疙瘩皮肤病疫苗株病毒基因组DNA经PCR扩增产物的杂交结果牛疙瘩皮肤病野毒株病毒基因组DNA经PCR 扩增产物的杂交结果。实施例3、试剂准备 1)芯片洗液
根据需要及实际情况，按如下比例配制洗涤液I和洗涤液II。洗液I :SSC终浓度为2X，SDS终浓度为0. 2 %。如500 mL洗液I =440 mL蒸馏水+50mL 20XSSC+10mL 10%SDS，或根据需要按比例配制。洗液II =SSC 终浓度为 0. 2 X。如 500 mL 洗液 II =495 mL 蒸馏水 +5 mL 20 X SSC,
或根据需要按比例配制。若10% SDS产生白色絮状沉淀，请置于42°C水浴中溶解混勻后配制洗液。2)无水乙醇。3)冰水混合物。实施例4、病毒基因组DNA提取
按照相应商品化DNA提取试剂盒使用说明书提取患病动物的组织或病毒的细胞增殖液的全基因组DNA，制备样品。实施例5、PCR扩增病毒基因组DNA
1、PCR反应体系在PCR配液区内，在冰上融化PCR Mix及基因组DNA，按如下体系配制反应液。25 μ L PCR 反应液包含PCR Mix 12.5 μ L,5U/y L PCR Taq 酶 0.4 μ L、待测样品DNA 5 μ L、无核酸酶灭菌水7. 1 μ L ；
其中，所述 PCR Mix 含有 10XPCR Buffer 2.5 μ L, 2. 5 mmol/L dNTP Mix 2 μ L, 25 mmol/L 氯化镁 2 μ L，
10 μ mol/L山羊痘病毒上游引物SEQ ID NOll 0.5 μ L, 10μmol/L绵羊痘病毒上游引物SEQIDN012 0.5 μ L， 10 μ mol/L PCR 通用下游引物 SEQ ID N013 5 μ L ；
山羊痘病毒上游引物 SEQ ID NOll :5' -ACAAACACTTCCCTCCTTAAGCTACT-3‘； 绵羊痘上游引物 SEQ ID N012 :5' -GACGAACATTTTTCCCTCTAAGCTAC-3‘； PCR 通用下游引物 SEQ ID N013: 5' -Cy3-ATCTCCATGNGAAACTTTACAAA-3‘。2、扩增将配置好的反应液置于PCR扩增仪中，按照表1的PCR反应循环程序进行 PCR反应。表1 PCR反应程序
权利要求
1.用于羊痘病毒属病毒鉴定的基因芯片，包括PCR反应混合液管、Taq聚合酶、PCR阳性对照、PCR阴性对照、ddH20、检测芯片、芯片探针的点样分布、芯片盖片、杂交液、杂交阳性对照、杂交盒，采用基因芯片微量点样技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的基片上，形成的微阵列，其特征是所述微阵列包括质控探针区和待测样品探针区，其中所述质控探针区内设置下述分区点样位置质控分区(P1)，包含至少一个点样位置质控探针SEQ ID N09； 杂交阳性质控分区(P2)，包含至少一个杂交阳性质控探针SEQ ID NOlO ； 杂交阴性质控分区(N)，包含点样缓冲液；所述待测样品探针区内设置下述包括至少一个待测样品探针的分区山羊痘病毒1号探针分区(1)，山羊痘病毒2号探针分区(2)，绵羊痘病毒1号探针分区(3)，绵羊痘病毒2号探针分区(4)，疙瘩皮肤病病毒疫苗株1号探针分区(5)，疙瘩皮肤病病毒疫苗株2号探针分区(6)，疙瘩皮肤病病毒野毒株1号探针分区(7)，疙瘩皮肤病病毒野毒株2号探针分区(8)；各个探针序列如下山羊痘病毒1号探针SEQ ID NOl ；山羊痘病毒2号探针SEQ ID N02 ；绵羊痘病毒1号探针SEQ ID N03 ；绵羊痘病毒2号探针SEQ ID N04 ；牛疙瘩皮肤病病毒疫苗株1号探针SEQ ID N05 ；牛疙瘩皮肤病病毒疫苗株2号探针SEQ ID N06 ；牛疙瘩皮肤病病毒野毒株1号探针SEQ ID N07 ；牛疙瘩皮肤病病毒野毒株2号探针SEQ ID N08o
2.根据权利要求1所述用于羊痘病毒属病毒鉴定的基因芯片，其特征是每张所述检测芯片上包括至少一个权利要求1所述的微阵列，每个微阵列可以检测一份样品。
3.根据权利要求1所述用于羊痘病毒属病毒鉴定的基因芯片，其特征是所述每条质控探针和待测样品探针的5'端均通过15个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基。
4.利用权利要求1所述基因芯片检测山羊痘病毒、绵羊痘病毒、牛疙瘩皮肤病病毒疫苗株和牛疙瘩皮肤病病毒野毒株的检测方法，包括如下步骤(1)待测样品制备按照商品化DNA提取试剂盒使用说明书提取患病动物的组织或病毒的细胞增殖液的全基因组DNA，制备待测样品DNA ；(2)PCR 扩增25 μ L PCR 反应液包含PCR Mix 12.5 μ L,5U/y L PCR Taq 酶 0. 4 μ L、待测样品DNA 5 μ L、无核酸酶灭菌水7. 1 μ L ；其中，所述 PCR Mix 含有 10XPCR Buffer 2.5 μ L, 2. 5 mmol/L dNTP Mix 2 μ L, 25 mmol/L 氯化镁 2 μ L，、10 μ mol/L山羊痘病毒上游引物SEQ ID NOll 0.5 μ L, 10ymol/L 绵羊痘上游引物 SEQ ID N012 0.5 μ L， 10 μ mol/L PCR 通用下游引物 SEQ ID N013 5 μ L ；按如下步骤进行扩增95°C 5 min ；95°C 30 sec,50°C 30 sec,72°C 1 min循环45次； 72 0C 8 min ；(3)杂交首先配制杂交液杂交缓冲液7.5 μ L、PCR扩增产物5 μ L、杂交阳性对照 2. 5 μ L，混勻后95°C变性5min，冰上放置5min，然后采用、15 μ L杂交液进行杂交；(4)结果判读用微阵列芯片扫描仪扫描分析，去除阴性对照背景，与芯片杂交说明对照，判定结果。
5.根据权利要求4所述检测方法，其特征是所述杂交缓冲液每1020 μ L包括甲酰胺 500 μ L, 20 X SSC 500yL及 10% SDS 20 μ L。
全文摘要
本发明公开了一种羊痘病毒属病毒，包括山羊痘病毒、绵羊痘病毒及牛疙瘩皮肤病病毒的芯片检测装置。通过标准毒株基因组序列分析设计PCR引物，对目的基因克隆及测序分析，然后设计特异性探针，可对羊痘病毒属的山羊痘病毒、绵羊痘病毒及牛疙瘩皮肤病病毒进行同时鉴定。本发明旨在建立一种灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果的微阵列芯片检测羊痘病毒属山羊痘病毒、绵羊痘病毒及牛疙瘩皮肤病病毒的方法。
文档编号C12Q1/68GK102373303SQ20111038694
公开日2012年3月14日 申请日期2011年11月29日 优先权日2011年11月29日
发明者丁森, 李应国, 杨俊 , 王国民, 王昱, 聂福平, 肖进文 申请人:重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心