专利名称：猪传染性胃肠炎病毒等温扩增技术快速检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及的猪传染性胃肠炎病毒检测试剂盒，属于动物疫病分子生物学检测方法及检测试剂领域，具体是一种用于猪传染性胃肠炎病毒的等温扩增技术检测试剂盒。本发明还应用该试剂盒对猪传染性胃肠炎病毒进行等温扩增检测的生物学检测方法。
背景技术：
猪传染性肠胃炎病毒(Transmissible gastroenteritis of swine virus, TGEV)属冠状病毒科冠状病毒属，是引起仔猪病毒性腹泻的重要病原，引起猪传染性胃肠炎 (Transmissible gastroenteritis of swine，TGE)。TGE 是一种急性、高度接触性传染病，以呕吐、严重腹泻、脱水和对2周龄以内仔猪的高度致死为特征。最早报道于1933年在美国依利诺斯州发现。目前该病已成世界流行，中国、美国、日本、英国、加拿大等均有报道。 不同年龄和不同品种的猪对本病都易感，2周龄的仔猪死亡率达90% 100%，给养猪业造成了巨大的经济损失。除猪外，其他动物对该病毒无易感性，但猫、犬、狐狸、燕、八哥等也可以携带病毒，间接引起本病的发生。该病是OIE规定猪的重要疫病，我国也将其列为进境动物必检的疫病。目前，针对猪传染性胃肠炎病毒现有的检测方法包括ELISA检测方法，核酸探针杂交技术检测，RT-PCR方法等。传统的病毒抗原的ELISA检测方法不能鉴别检测传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病毒(PRCV)，而阻断ELISA从血清学上鉴定TGEV/PRCV感染猪， 也只是发病后对恢复期血清的回顾性检测。核酸探针杂交技术检测包括放射性探针杂交和非放射性探针检测。用放射性同位素标记的探针杂交检测试验的灵敏和特异性都很好，但放射性同位素对人体有害，处理方法复杂，一般实验室无法进行。非放射性探针检测方法的灵敏性和特异性不如放射性同位素标记的探针。与传统的血清学和免疫学检测方法相比 PCR方法有许多优点。目前，用于TGEV检测的RT-PCR主要有多重RT-PCR，巢式RT-PCR，荧光定量RT-PCR。虽在特异性和灵敏度方面有所突破，但都需要特特殊的仪器，成本较贵，应用范围有限。因此，发明一种可快速鉴别检测猪传染性胃肠炎病毒的检测方法对进境动物口岸检验，防止该病毒的传播以及研究我国猪群中TGEV的感染情况具有重要意义。国内外在病原体的检测方法方面，利用NASBA方法对多种动物疫病和微生物检测已有很多报告，但在兽医临床检测方法，尚未见有猪传染性胃肠炎病毒的NASBA检测方法。NASBA技术即依赖核酸序列的扩增技术(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA),又称自主序列复制系统(Self-sustained sequence r印licati0n，3SR)，或再生长序列复制技术，是以cDNA为中介体在等温条件下直接扩增单链RNA特异序列的核酸扩增技术(Compton J. 1991 )，是在PCR基础上发展起来的一种新的扩增技术。NASBA灵敏、特异、准确、快速，可以替代PCR (Vannier P等，2006)。NASBA法是一个简单、快速扩增核酸的方法，约2小时可将RNA扩增101°倍，是一个持续的恒温过程，不需要特殊的仪器。只需要三种酶T7RNA聚合酶、核糖核酸酶、鸟类成髓细胞性白血病病毒逆转录酶，且反应处于一个恒定的温度。这三个酶产生逆转录和转录过程，导致靶序列自身复制。NASBA依靠一个逆转录和转录反应持续反复循环，由互补DNA中介复制RNA模板，寡核苷酸链引导DNA合成，并为T7RNA聚合酶编码启动子序列。反应中首先合成双链cDNA， 该cDNA作为T7RNA聚合酶的转录模板。而完成cDNA合成有赖于核糖核酸酶消化分解作为中介物的RNA-DNA杂交物中的RNA。足够转录的cDNA产生原始模板的反义RNA，转录产物转化成为含有双链启动分子的cDNA。这些cDNA能产生有义RNA和反义RNA，二者都能重新进入循环。NASBA扩增的效率仅轻微受初始RNA浓度影响，扩增产物的积累量与时间呈指数相关，反应在恒温42°C下进行，迅速，1 2小时孵育后，反应产物可扩增IO7倍。扩增产物达到IO5倍仅需15分钟而PCR需85分钟(Guatelli，JC, 1990)。NASBA技术用于检测临床样品中假丝酵母(Widjojoatmodjo M K等，1999)、沙门氏菌属(Simpkins S A等， 2000)，人免疫缺乏症病毒(Sh印ard R N.，2000)、巨细胞病毒(Blok M J等，1998)、丙型肝炎病毒RNA (Damen M等，1999)和曲霉菌(Juergen L, 2001)，也用于检测禽流感(AIV)、 口蹄疫(FMDV)、新城疫(NDV)、古典猪瘟(CSFV)、猪呼吸与繁殖综合症(PRRSV)等动物病毒 (Vannier P等，2006，猪传染性胃肠炎病毒(李小兰等，2010)。NASBA在检测尿标本CT感染和宫颈标本有同样的敏感性，且对16S rNA最敏感，只需10_5包涵体形成单位(IFU)即可检出，比PCR敏感10倍(Morr6 SA 1996)。在我国发布的8项禽流感标准中，就有两项应用了 NASBA检测方法。由于该技术操作简便、灵敏度高、特异性好、不需使用扩增仪，且在低拷贝RNA病毒的检测方面具有良好的应用前景，因此，自1990年，Guatelli首先介绍该技术以来，已引起人们的关注，得到世界范围的广泛应用。查询中国发明专利，公开了采用等温扩增基因技术检测病菌和动物疫病的方法较多。但目前尚无利用等温扩增基因技术(NASBA)检测猪传染性胃肠炎病毒的试剂盒及检测方法的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用于进行猪传染性胃肠炎病毒的检测和鉴别的NASBA 检测试剂盒及检测方法。为了实现上述目的发明采用如下技术方案猪传染性胃肠炎病毒等温扩增技术快速检测试剂盒包括NASBA- I和NASBA- II，可特异性的扩增猪传染性胃肠炎病毒。其中
所述NASBA- I包括NASBA扩增反应液管、NASBA反应酶Mix管、阳性对照管、阴性对照管和DEPC水管。NASBA扩增反应液管由以下反应液组成
序列为SEQ ID NOl的上游引物10 mmol/L的上游引物0. 5 μ L，
序列为SEQ ID Ν02的下游引物10 mmol/L的上游引物0. 5 μ L，
NASBA buffer 缓冲液 7.0 μ L,
lmmol/L的氯化钾溶液1.2yL，
DEPC 水 0. 8 μ L,
合计10 μ L，为单次反应的用量。NASBA反应酶Mix管由以下反应液组成 T7 RNA聚合酶10 μ L，终浓度为40U ；AMV 16口1^，终浓度为8仏 RNase H 0. 1 μ L,终浓度为 0. 2U; RNasin 5 μ L,终浓度为 12. 5U BSA 1. 3 μ L，终浓度为 2. 6ug/ μ L， NASBA buffer 缓冲液 17. 6 μ L, 合计50 μ L，为10次反应的用量。阳性对照管为猪传染性胃肠炎病毒标准毒株的阳性重组质粒，体积约20 μ L/ 管。阴性对照管内为猪传染性胃肠炎病毒阴性的猪血清，体积约50 μ L/管。DEPC 水管ImL 2mL。所述NASBA- II包括杂交缓冲液、探针混合液、检测浓缩液、显色液、终止液、 10 X TBST缓冲液和酶标板。探针混合液包含100nmol/L通用探针SEQ ID N03，100nmol/L检测探针SEQ ID N04，体积比1:1。上述试剂盒用于猪传染性胃肠炎病毒等温扩增技术快速检测方法，包括以下步骤
1)待测样品中核酸模板的提取取200yL 300yL或200 mg 300 mg待检样品 (血液、组织、粪便等)，可选用相应的市售商品化核酸提取试剂盒或实验室常规使用的提取病毒核酸的方法提取样待测品中的病毒基因组RNA，即为核酸模板。2) NASBA反应体系取5 μ L步骤1)中核酸模板或阳性对照DNA或阴性对照DNA， 分别加入NASBA扩增反应液10 μ L，NASBA反应酶Mix 5 μ L，反应体系的总体积为20 μ L。3)NASBA扩增条件将步骤2)配制好反应体系的PCR管于42 °C恒温反应 90min, -20°C终止反应。4)结果检测取扩增产物5 μ L，杂交缓冲液43 μ L，探针混合液2 μ L，加入酶标板中，微微震动混勻后，42°C杂交lh，IXTBST缓冲液洗涤3 4次，280μ L/孔；加入检测浓缩液，100 μ L/孔，37°C反应30min,lXTBST缓冲液洗涤3 4次，280 μ L/孔；加入显色溶液，100 μ L/孔，室温避光IOmin 15min后，加入终止液，100 μ L/孔，终止反应。酶标仪OD4tl5nm读取吸光度值，OD4tl5nm值大于0. 45判为阳性，反之，小于0. 45判为阴性；或者，扩增反应产物直接进行核酸电泳，约在195bp处出现明显扩增，判为阳性；反之， 判为阴性。本实用新型的优点是，本发明可以快速地对待检样品(血液、组织、粪便等)是否感染TGEV进行鉴定，具有较高的灵敏度。在引物设计上，根据NCBI已公布的核酸序列，进行多重对比等方法对收集到的核酸序列进行了筛选，针对S基因设计引物和探针。通过反复试验，排除了有非特异性扩增的引物，最后选定SEQ ID NOUSEQ ID N02引物，SEQ ID N03 为通用探针，SEQ ID N04为检测探针为猪传染性胃肠炎病毒的检测及鉴定引物和探针。并通过优化NASBA反应条件等，可高灵敏度地对TGEV进行鉴定。本发明可组装成检测猪传染性胃肠炎病毒的NASBA检测试剂盒，适用于动物血液、组织、粪便等的TGEV快速鉴别检测。本发明提供的扩增试剂均经试验反复验证和优化，具有市场上同类NASBA等温扩增检测试剂盒相应优点(1)不需要特殊试剂与设备；(2)高特异性应用两条探针、根据产物与探针的特异性结合，假阳性率大大降低，检测准确率可达于99% ； (3)快速、高效扩增且无污染检测时间4小时左右；(4)灵敏度高扩增模板仅需100. Opg/mL或更少，血清样本中RNA最低检测极限达到50. Opg/mL ；标本的检出率达到99% ； (5)用途广可广泛用于TGEV 的安全快速检测。
图1猪TGEV NASBA扩增特异性试验；
图中1-猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP) ;2_猪圆环病毒II型(PCV-II) ；3-猪繁殖与呼吸综合症病毒VR-2332株；4-猪瘟病毒疫苗株；5-猪传染性胃肠炎病毒；6-猪呼吸道冠状病毒(PRCV) ；7-猪细小病毒(CPV) ；8-ST细胞对照；M-DL2000。
具体实施例方式下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于实施例。实施例1、本发明引物的设计及筛选
根据已知的猪传染性胃肠炎病毒核酸序列的基因组全长序列，利用应用ClustW软件进行多重比对，选择TGEV的S基因的保守区域利用引物设计软件ft~imer5. 0软件设计特异性引物和探针，分别标记为=SEQ ID NOl……SEQ ID N04，其中通用探针5’端标记生物素， 检测探针5’端标记地高辛。所有引物均由宝生物工程(大连)有限公司合成。用市售病毒核酸提取试剂盒提取猪传染性胃肠炎病毒RNA，采用SEQ ID NOl、SEQ ID N02、SEQ ID N03、SEQ ID N04分别扩增该RNA，排除有非特异性扩增的引物和探针。获得引物及探针如下
SEQ ID NOl :GACGTTAGCAGGTAGATGCGAYACCCATAYTCCATCACAG ； SEQ ID N02
AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGACGTTTAACCTGCACTCACTACC ； SEQ ID N03 =Biotin-GACGTTAGCAGGTAGATGCG ； SEQ ID N04 :DIG-ACAGTTACAACAACCCGCSATTT。实施例2、阳性对照品的制备
采用市售商品化核酸提取试剂盒提取猪传染性胃肠炎病毒标准毒株的病毒RNA，进行 PCR扩增，扩增长度约为l%bp。回收扩增的目的条带，将其与PMD19-T载体进行连接反应， 4°C连接过夜，将连接产物转化至JM109感受态细胞，抗性筛选、摇菌、PCR鉴定阳性者，提取重组质粒，测序验证，获得含目的片段的克隆，提取病毒阳性质粒，分装每支50 μ L,浓度控制在 80 IOOng/μ L0实施例3、阴性对照品的制备
采用市售商品化核酸提取试剂盒分别提取猪传染性胃肠炎病毒阴性血清的RNA。用灭菌去离子水稀释，将浓度控制在80 IOOng/ μ L，分装为每支50 μ L。实施例4、制备待检样品的核酸模板
取200μ 300μ 或200 mg 300 mg待检样品(血液、组织、粪便等)，采用市售商品化核酸提取试剂盒提取样品中的基因组RNA，即为核酸模板。
实施例5、扩增体系的建立和优化
以标准阳性毒株RNA为模板，在非严谨的条件下进行扩增，优化扩增反应的温度，在优化后的温度条件下，优化反应体系中的引物浓度、NASBA buffer缓冲液、NASBA反应酶Mix 和氯化钾溶液等。优化的NASBA扩增反应液中包含NASBA buffer缓冲液7.0 μ L, lmmol/ L的氯化钾溶液1.2yL，10謹ol/L的上游引物SEQ ID N01、下游引物SEQ ID N02各0. 5 μ L，DEPC水 0. 8 μ L ；NASBA 反应酶Mix 中包含NASBA buffer 缓冲液 17. 6 μ L ；Τ7 RNA 酶 IOyL; AMV 16 μ L, RNase H 0. 1 μ L, RNasin 5 μ L, BSA 2. 6 μ L ；优化后的 NASBA 反应体系为NASBA扩增反应液10 μ L，NASBA反应酶Mix 5 μ L，核酸模板5 μ L，总体积为20 μ L。在优化的等温条件下，可实现对猪传染性胃肠炎病毒的检测和鉴定。优化的NASBA扩增条件是42°C恒温反应90min，_20°C终止反应。实施例6、检测体系的建立和优化
以标准阳性毒株RNA为模板，按照优化后的NASBA扩增体系进行扩增，在非严谨的条件下进行检测体系和条件的优化，分别优化探针浓度、检测液浓度(即抗体稀释倍数)、杂交时间、显色时间等，确定阴阳性判定值。优化后的检测体系为(1)、扩增产物5yL，杂交缓冲液43μ L，探针混合液2μ L，加入酶标板中，微微震动混勻后，42°C杂交lh，IXTBST缓冲液洗涤3 4次，280 μ L/孔；(2)、加入检测溶液，100 μ L/孔，37°C反应30min, 1 XTBST缓冲液洗涤3 4次，280 μ L/孔；(3)、加入显色溶液，100 μ L/孔，室温避光IOmin 15min后， 加入终止液，100 μ L/孔，终止反应。(4)、酶标仪OD4tl5nm读取吸光度值。OD4tl5nm值大于0. 45 判为阳性，反之，小于0. 45判为阴性。优化后的检测体系可实现对猪传染性胃肠炎病毒的特异性检测，灵敏度高。实施例7、特异性和灵敏度
采用上述优化的体系和扩增条件，对猪传染性胃肠炎病毒标准毒株、猪细小病毒 (CPV)、猪圆环病毒II型(PCV-II)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(ΑΡΡ)，猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)，猪繁殖与呼吸综合征病毒VR-2332株，猪抗体阴性血清等核酸提取物进行扩增， 仅目的病毒核酸有特异性扩增，其它非目的核酸均无非特异性扩增条带。用DEPC水梯度稀释细胞培养的TGEV标准病毒，再提取稀释后样本的病毒RNA，利用上述优化的体系和扩增条件扩增，本发明的最低检测限分别约为10.5 pg/yL。实施例8、NASBA- I的制备
NASBA扩增反应液中包含NASBA buffer缓冲液7.0 μ L，lmmol/L的氯化钾溶液 1.2yL, 10 mmol/L 的上游引物 SEQ ID N01、下游引物 SEQ ID N02 各 0. 5 μ L，DEPC 水 0. 8 μ L，共10 μ L。每个试剂盒提供足做96个反应的量共10 X 96=960 μ L。NASBA反应酶Mix中包含T7 RNA聚合酶10 μ L,终浓度为40U ；AMV 16 μ L,终浓度为 8U; RNase H 0. 1 μ L，终浓度为 0. 2U; RNasin 5 μ L，终浓度为 12. 5U ;BSA 1.3yL,终浓度为2. 6ug/ μ L ；NASBA buffer缓冲液17. 6 μ L，共50 μ L，为10次反应量。每个试剂盒提供足做96个反应的量共5 X 96=480 μ L。实施例9、NASBA- II的制备 1、20 X SSPE溶液的配制
氯化钠(NaCl)175g
一水磷酸二氢化钠(NaH2P04. H20)27. 6g乙二胺四乙酸二钠(EDTA)
加水800mL，溶解后，用10ml/L氢氧化钠(NaOH)溶液调节pH值至7. 4 (约需6. 5ml)， 最后加水定容至1L，分装后高压灭菌。 2、杂交缓冲液的配制3、探针混合液 IOOnmol/L 的 SEQ ID N03 IOOnmol/L 的 SEQ ID N04
DEPC 水，SEQ ID N03 禾口 SEQ ID N04 体积比为 1:1。 4、10X TBST缓冲液的配制 氯化钠(NaCl)80g
氯化钾(KCl)2g
三羟甲基氨基甲烷-碱(Tris base)30g
加DEPC水800mL溶解后，定容到lOOOmL。5、检测浓缩液的配制
碱性磷酸酶标记的抗地高辛单克隆联合抗体加入IXTBST缓冲液中，1:20倍稀释，混勻即为检测液。
6、显色液的配制
对硝基磷酸苯(PNPP)30mg
底物缓冲液30mL。7、终止液的配制
氢氧化钠(NaOH)6g
DEPC 水50mL。8、链亲酶素包被的酶标板
用25 μ g/mL链青霉素的0. 05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9. 6)包被酶标板，100 μ L/孔， 4°C过夜；含 10g/LBSA 的 0. 05mol/L 的碳酸盐缓冲液(Ph9. 6)，100 μ L/ 孔，37°C封闭 2h ； 1 XPBST缓冲液洗板3次，280 μ L/孔，37°C烘干30min，密封室温保存。实施例10、试剂盒的组装
试剂盒由两部分组成，即NASBA-I和NASBA-II，NASBA-I由如上所配制的阳性对照、阴性对照各1支，NASBA扩增反应液和NASBA反应酶Mix各1支，DEPC水2支组成；NASBA- II 由杂交缓冲液1瓶、探针混合液1支、检测浓缩液1支、检测缓冲液1瓶、显色液1瓶、终止液1瓶、10XTBST缓冲液1瓶和酶标板1块组成。以上试剂均贴上生产日期及产品标签。 低温保存及运输。
三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl) 牛血清白蛋白(BSA) 20X SSPE 溶液
50mmol/L 0. 5g 5 OmL ο
权利要求
1.猪传染性胃肠炎病毒等温扩增技术快速检测试剂盒，其特征在于它包括NASBA-I 和NASBA- II，可特异性的扩增猪传染性胃肠炎病毒，其中所述NASBA- I包括NASBA扩增反应液管、NASBA反应酶Mix管、阳性对照管、阴性对照管和DEPC水管；NASBA扩增反应液管由以下反应液组成序列为SEQ ID NOl的上游引物10 mmol/L的上游引物0. 5 μ L，序列为SEQ ID Ν02的下游引物10 mmol/L的上游引物0. 5 μ L，NASBA buffer 缓冲液 7.0 μ L,lmmol/L的氯化钾溶液1.2yL，DEPC 水 0. 8 μ L,合计10 μ L，为单次反应的用量；NASBA反应酶Mix管由以下反应液组成T7 RNA聚合酶10 μ L，终浓度为40U ；AMV 16口1^，终浓度为8仏RNase H 0. 1 μ L,终浓度为 0. 2U;RNasin 5 μ L,终浓度为 12. 5UBSA 1. 3 μ L，终浓度为 2. 6ug/ μ L，NASBA buffer 缓冲液 17. 6 μ L,合计50 μ L，为10次反应的用量；阳性对照管为猪传染性胃肠炎病毒标准毒株的阳性重组质粒，体积20 μ L/管； 阴性对照管内为猪传染性胃肠炎病毒阴性的猪血清，体积50 μ L/管； DEPC 7jC管ImL 2mL ；所述NASBA- II包括杂交缓冲液、探针混合液、检测浓缩液、显色液、终止液、10XTBST 缓冲液和酶标板；探针混合液包含100nmol/L通用探针SEQ ID N03，100nmol/L检测探针SEQ ID N04， 体积比1:1。
2.根据权利要求1所述猪传染性胃肠炎病毒等温扩增技术快速检测试剂盒，其特征在于所述NASBA buffer缓冲液由以下成分组成lmmol/L 的 Tris-HCl 20 μ L, lmmol/L的氯化镁6 μ L， 10mmol/L WdNTP 50 μ L,1 OOmmo 1/L 的 NTP，包括 cNTP、gNTP、aNTP、tNTP 各 10 μ L， 50mmol/L 的 DTT 100 μ L， DMSO 75 μ L0
3.权利要求1所述试剂盒用于猪传染性胃肠炎病毒等温扩增技术快速检测方法，包括以下步骤1)待测样品中核酸模板的提取取200 μ L 300 μ L或200 mg 300 mg待检样品， 可选用相应的市售商品化核酸提取试剂盒或实验室常规使用的提取病毒核酸的方法提取样待测品中的病毒基因组RNA，即为核酸模板；2)NASBA反应体系取5 μ L步骤1)中核酸模板或阳性对照DNA或阴性对照DNA，分别加入NASBA扩增反应液10 μ L，NASBA反应酶Mix 5 μ L，反应体系的总体积为20 μ L;3)NASBA扩增条件将步骤2)配制好反应体系的PCR管于42°C恒温反应90min，-20°C 终止反应；4)结果检测取扩增产物5μ L，杂交缓冲液43 μ L，探针混合液2 μ L，加入酶标板中， 微微震动混勻后，42°C杂交lh，IXTBST缓冲液洗涤3 4次，280μ L /孔；加入检测浓缩液，100 μ L/孔，37°C反应30min, 1 X TBST缓冲液洗涤3 4次，280 μ L/孔；加入显色溶液， 100 μ L/孔，室温避光IOmin 15min后，加入终止液，100 μ L/孔，终止反应；酶标仪OD4tl5nm读取吸光度值，OD405nm值大于0. 45判为阳性，反之，小于0. 45判为阴性； 或者，扩增反应产物直接进行核酸电泳，约在195bp处出现明显扩增，判为阳性；反之，判为阴性。
全文摘要
本发明设涉及动物疫病分子生物学检测方法及检测试剂领域，具体涉及一种猪传染性胃肠炎病毒等温扩增技术(NASBA)快速检测用引物、试剂盒及其检测方法。本发明根据猪传染性胃肠炎病毒的基因序列，用ClustalW进行多重比对，分析序列的保守区，采用Primer5.0引物设计软件，分别设计引物和探针，可特异性的实现快速对猪传染性胃肠炎病毒的检测与鉴别。配制各种反应溶液组成相应的检测试剂盒。利用本发明的试剂盒具有作简便，特异性强、灵敏度高、可重复性高，且没有复杂的后处理，适用性广等优点。
文档编号C12Q1/70GK102373301SQ20111038692
公开日2012年3月14日 申请日期2011年11月29日 优先权日2011年11月29日
发明者徐自忠, 李应国, 李贤良, 杨俊 , 王国民, 王昱, 聂福平, 肖进文, 陈瑞 申请人:聂福平, 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心