一种用于血清/血浆miRNA检测的内参及其应用的制作方法
专利名称：一种用于血清/血浆miRNA检测的内参及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程和肿瘤学领域，涉及一种用于血清/血浆miRNA检测的内参及其应用。
背景技术：
MicroRNAs (即miRNAs)是近年来肿瘤分子生物学研究领域的一个热点。成熟 miRNA是一类长约21- 个核苷酸的小分子非编码RNA，在胞核中，miRNA首先表达为数百核苷酸长的原始(primary miRNA，pri_miRNA)，而后由Drosha核酸酶处理成约100核苷酸长的前体(precursor miRNA, pre-miRNA)，并通过Exportin-5依赖的机制转运至胞浆；在胞浆中，进一步由Dicer核酸酶处理成成熟miRNA。成熟miRNA主要通过与靶mRNA 3’-非翻译区(UTR)的碱基互补配对来调控基因的表达，可以导致靶mRNA的降解或者翻译的抑制。生物信息学研究表明，单个miRNA分子能够与数百个功能各异的靶mRNA相结合而发挥调节作用，参与包括发育、代谢、细胞增长、凋亡、干细胞分化等几乎全部的病理生理学过程，与许多疾病的发生、发展存在着紧密的联系。研究还表明miRNA的表达谱可以区分瘤组织和非瘤组织，并且具有肿瘤特异性；而miRNA整体的成熟受限可以导致细胞的恶性转化。 目前被发现的人类miRNA的数目仍在逐渐增加，而其在转录后调控方面的重要作用也正被揭示，miRNA已经成为包括肿瘤在内的多种疾病发病、治疗和预后的重要候选标志物。既往对miRNAs的研究主要集中在它们在细胞内的活动。2008年，中美科学家同步发现血清/血浆中稳定存在miRNA。这些miRNA对RNase、酸碱环境、长时间(>M 小时)室温放置及反复冻融均不敏感，血浆和血清中无明显差异。目前有关血清/血浆 miRNA的来源还没有定论，多数研究者认为肿瘤患者血清/血浆中的miRNA来源于靶组织， 但其表达变化与靶组织的一致性还有待探讨；也有研究者认为miRNA可以被选择性富集到 "microparticles(MPs) ”或‘‘exosomes” 中，由细胞以‘‘microvesicles 微泡”脱落的方式主动向外分泌。无论如何，血清/血浆miRNA具备成为优质生物标志物的潜质，即含量丰富且性质稳定，拥有以蛋白质为代表的传统生物标志物所不具备的特质，即无需抗体制备且易于精确定量，而且具有疾病特异性，为生物标志物开拓了新境界。现有的血清/血浆miRNA检测技术已经较为成熟，如基因芯片技术、高通量测序技术以及最常用而有效的实时荧光定量PCR法，使得血清/血浆miRNA表达谱的获得成为可能。然而，目前尚缺乏可用于血清/血浆miRNA检测的稳定内参。与组织/细胞miRNA 不同，TO在血清/血浆中表达很低，无法作为血清/血浆miRNA表达的内参。目前研究者常用两种方法控制实验差异一是在实验的每一步都处理等体积的“适量”血清/血浆，二是在miRNA提取时，在加入Trizol使蛋白变性后即刻加入人工合成的非人类miRNA (如线虫-39，cel-miR-39)。尽管用上述两种方法，可以有效控制实验差异，但无法控制个体本身的生物学差异，特异而稳定的血清/血浆miRNA内参的缺乏仍制约着血清/血浆miRNA研究成果临床转化及不同实验室间研究成果的比较。因此，若能筛选出可用于血清/血浆miRNAs检测的内参，并研制相应的检测试剂盒，对血清/血浆miRNA相关研究成果的临床转化及提高肿瘤等疾病的临床诊疗水平必将是一次有力的推动。
发明内容
本发明的首要目的是针对上述技术问题，提出一种用于血清/血浆miRNA检测的内参。本发明的第二个目的是提供上述血清/血浆miRNA检测内参的引物。本发明的第三个目的是提供上述血清/血浆miRNA检测内参及其引物在制备血清 /血浆miRNA内参检测试剂盒中的应用。本发明第四个目的是提供血清/血浆miRNA内参检测的试剂盒。发明人通过分离和研究不同肿瘤病人及健康对照血清/血浆中的miRNAs，寻找一组在不同疾病性状及健康者间稳定表达的内参，并研制出可便于临床应用的内参检测试剂盒，为血清/血浆miRNA研究成果的临床转化及不同实验室间研究成果的比较提供数据支持。本发明的目的是通过下列技术方案实现的一种用于血清/血浆miRNA检测的内参，该内参为单独的miR-484或者miR-191 与miR-484构成的组合。所述的血清/血浆miRNA内参的引物，这些引物为miR-191 的引物为 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ；miR-484 的引物为 SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6。所述的血清/血浆miRNA内参在制备血清/血浆miRNA内参检测试剂盒中的应用。所述血清/血浆miRNA内参的引物在制备血清/血浆miRNA内参检测试剂盒中的应用。一种血清/血浆miRNA内参检测试剂盒，该试剂盒用于检测血清/血浆中miR-484 或者miR-191和miR-484构成的组合。所述的检测试剂盒，该试剂盒含有血清/血浆miRNA中miR-191和miR-484的引物或者单独含有miR-484的引物；其中miR-191 的引物为 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ；miR-484 的引物为 SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6。所述检测试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如逆转录酶，缓冲液， dNTPs, MgCl2, DEPC水和Taq酶等；还可以含有标准品和/或对照品。具体地说，本发明解决问题的技术方案包括(1)以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本。( 血清/血浆miRNA表达谱分析选择肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、宫颈癌病人、男性健康对照和女性健康对照，检测其血清/血浆miRNA表达谱及含量，分析不同肿瘤病例和对照间血清/血浆miRNA表达的稳定性，筛选稳定表达miRNAs，即候选内参 miRNA,进行进一步验证。( 对筛选出的稳定表达的血清/血浆候选内参miRNAs在食管癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、口腔癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、肝癌和健康对照中进行定量分析， 确定可用于血清/血浆miRNAs检测的内参。(4)血清/血浆miRNA内参检测试剂盒的研制根据不同肿瘤病例和健康对照的稳定表达的血清/血浆miRNA，开发血清/血浆miRNAs 内参检测试剂盒，用于比较不同实验室间的相关研究结果并实现其临床转化。本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，并采用了 RT-PCR、 Real-timePCR 方法、SoIexa 测序技术、TaqMan Low Density Array (TLDA)芯片检测等。具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分1.研究样本的选择(1)经病理学明确诊断的肿瘤病人，包括内参筛选阶段的肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌和宫颈癌病例，和内参验证阶段的食管癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、口腔癌、胃癌、肺癌、乳腺癌和肝癌病例(2)采血前未经过手术和放化疗，无手术前放化疗(3)健康男性、女性对照本研究共采用3M例符合标准的样本进行研究。2. Trizol 试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA)和 miRNeasy Mini Kit (QIAGEN 公司) 提取血清/血浆总RNA，按常规方法操作。通常能得到 5yg RNA/50ml血清或血浆。3. Solexa 测序(1)总RNA进行PAGE电泳回收17_27nt RNA分子(2)将链接引物(adaptor prime，Solexa测序通用引物)酶联在小RNA分子的3' 与5'端(3)进行RT-PCR反应后进行测序(4)数据分析与处理4. TLDA(Applied Biosystems 公司)芯片检测(1)总RNA通过逆转录反应得到cDNA样品(2)cDNA样品进行预扩增反应(3)预扩增产物进行TLDA芯片检测，得到miRNA的表达谱(4)数据分析与处理5. Real-time RT-PCR(qRT-PCR)方法(1)取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；(2)设计引物；(3)加入荧光探针或染料进行PCR反应；(4)检测并比较不同肿瘤病人和健康对照血清/血浆样本中miRNA的量的稳定性。6.内参检测试剂盒制备方法不同肿瘤病人和健康对照中拷贝数和表达水平均稳定的miRNA，通过qRT_PCR技术筛选在不同肿瘤病人和健康对照中表达稳定的一组血清/血浆miRNA，作为血清/血浆 miRNA检测的内参。最后筛选出的血清/血浆miRNA内参组成检测试剂盒(单独的miR-484 或者miR-191与miR-484构成的组合)。检测试剂盒可以包括这些血清/血浆微小核糖核酸组合的引物，探针，以及Taq酶、dNTP等试剂。7.统计分析方法运用变异系数CV分析每个miRNA在不同样本之间的变异程度。运用Normfinder 禾口定量表达数据内参基因在线分析工具(http//www. leonxie. com/referencegene. php)分析各个miRNA在不同样本中的稳定性。miRNA稳定值越低，其稳定性越高。我们在筛选阶段样本人群，包括60例肺癌(30例长生存期和30例短生存期)、48 例乳腺癌(24例一组)、40例胃癌(20例一组)、30例肝癌、30例宫颈癌病例和48例健康男性对照，48例健康女性对照，综合运用Solexa测序和TLDA芯片的研究结果发现有3种 miRNAs在各样本间可稳定表达。对稳定表达的miRNAs在另外5例食管癌、5例结肠癌、5例直肠癌、5例胰腺癌、5例口腔癌、5例胃癌、5例肺癌、5例乳腺癌、5例肝癌病例和5例健康对照中进行进一步验证，进而观察本研究结果的稳定程度。以下是本发明进一步的说明在上述筛选阶段样本中，我们将这10组合并样本经Solexa测序试验及TLDA芯片检测获得相关结果。根据Solexa测序方法，本发明人检测到在不同肿瘤和健康对照组中的血清/血浆中稳定表达(平均拷贝数> 50，变异系数< 100% )的微小核糖核酸包括hsa-miR-191、 hsa—miR-320、hsa—miR-484、hsa—miR-222、hsa-let_7a、hsa-let_7b、hsa-let_7c、 hsa-let_7d、hsa-let_7e、hsa-let_7f、hsa—miR-103、hsa—miR-107、hsa—miR-122、 hsa-miR-125a_5p、hsa-miR-139_3p、hsa-miR-140_3p、hsa-miR-192、hsa-miR-197、 hsa-miR-221、hsa-miR-23a、hsa-miR-25、hsa-miR-30d、hsa-miR-339-5p、hsa-miR-423-3p、 hsa-miR-423_5p、hsa-miR-451、hsa-miR-486_3p、hsa-miR-486_5p、hsa-miR-532_3p、 hsa—miR-584、hsa-miR-744、hsa-miR-99a。根据TLDA芯片检测，本发明人检测到在不同肿瘤和健康对照组中的血清/血浆中稳定表达(平均Ct值< 25，变异系数< 5% )的微小核糖核酸包括hsa-miR-191、 hsa—miR-320、hsa—miR-484、hsa—miR-126、hsa—miR-150、hsa—miR-24、hsa_miR-20a、 hsa—miR-17、hsa_miR-106a、hsa_miR-92a、hsa_miR-19b、hsa_miR-146a0根据上述两种方法检测的结果，选择在Solexa测序和TLDA芯片中均稳定表达的 miRNAs用qRT-PCR方法进一步的验证满足上述条件的miRNAs 包括miR_191、miR-320 和 miR-484。根据上述结果，将这3个候选内参miRNAs在另外5例食管癌、5例结肠癌、5例直肠癌、5例胰腺癌、5例口腔癌、5例胃癌、5例肺癌、5例乳腺癌、5例肝癌病例和5例健康对照分别用探针法和染料法qRT-PCR进一步的验证。Normfinder和内参在线分析软件均表明， 就血清/血浆中单个miRNA而言，miR-484的表达最为稳定，而miR-191和miR-484的组合其稳定性超过了单个miR-484。探针法和染料法结果一致。根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于血清/血浆miRNA内参检测的试剂盒，包含测定受试者血清/血浆中稳定存在且可检测的成熟miR-191和miR-484的引物和其他检测试剂。具体而言，miR-484单独及miR-191和miR-484构成的组合，或者miR-484单独的引物及miR-191和miR-484组合的引物构成的内参检测试剂盒，促进了血清/血浆miRNA 相关研究结果的临床转化和不同实验室研究结果的比较，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。本申请中“血清/血浆”中的“/”表示“和”及“或”的关系。本发明的有益效果
本发明提供的血清/血浆微小核糖核酸(microRNAs/miRNAs)检测内参的优点在于(1)血清/血浆miRNAs是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类小分子RNA 内参的成功研究有助于血清/血浆miRNAs在疾病早期诊断及预后判断等方面价值的临床转化，以及不同实验室之间研究结果的比较。(2)血清/血浆miRNAs内参检测试剂盒可用于检测不同受试者血清/血浆中的内参miRNAs，有助于反映不同受试者内参miRNA的基线表达水平，用于控制个体生物学差异导致的miRNA表达水平差异，以凸显真正与疾病相关的差异表达miRNA。(3)采用严密的设计和评价体系，本发明人初期采用Solexa全基因组测序技术对血清/血浆miRNAs进行直接测序，同时采用TLDA芯片检测以获取稳定表达的血清/血浆 miRNAs，并应用qRT-PCR的方法进行了单个样本验证；以上方法和策略的应用加速和保证了血清/血浆miRNAs内参检测试剂盒的应用。本发明通过研究血清/血浆中稳定表达的miRNA，寻求可用于血清/血浆miRNA检测的内参。因此，本发明获得了血清/血浆miRNAs表达数据库和稳定表达的内参miRNA; 通过血清/血浆miRNAs内参试剂盒的研制和应用，促进血清/血浆miRNAs相关研究结果的临床转化和不同实验室间研究结果的比较，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
图1.显示不同肿瘤病人和对照的3种候选内参miRNA及cel-miR-39的的表达折线图。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。实施例1样品的收集和样品资料的整理发明人自2003年7月起从江苏省内多个三级甲等医院收集了大量的各肿瘤病人及健康对照血清/血浆样品，用于研究的病例和对照样本均为同期收取，采样、分装、保存条件均一，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了 3M例符合下列标准的样本作为 Solexa测序、TLDA芯片检测和后续一系列qRT_PCR验证的实验样品1、经病理学明确诊断的肿瘤病人，包括内参筛选阶段的肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌和宫颈癌病例，和内参验证阶段的食管癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、口腔癌、胃癌、肺癌、乳腺癌和肝癌病例。2、采血前未经过手术和放化疗，无手术前放化疗。3、健康男性、女性对照。并系统采集了这些样本的人口学资料、临床资料等情况。实施例2血清/血浆中miRNA的Solexa测序实验上述符合条件的样本包括60例肺癌(30例长生存期组和30例短生存期组)、48 例乳腺癌(24例/组)、40例胃癌(20例/组)、30例肝癌、30例宫颈癌病例和48例健康男性对照，48例健康女性对照。将这10组人群经Solexa测序试验(试剂盒购自ABI公司) 获得相关结果。具体步骤为1、每组样本取血清/血浆50ml，加入等体积的Trizol试剂；2、相分离室温放置15min，然后按0. 2ml氯仿/lml Trizol试剂的体积比加入氯仿，震荡 15s,室温 15min, 12，OOOg, 4°C，离心 15min ；3、将水相转移到新的50ml的离心管，3步苯酚/氯仿除去蛋白相；4,RNA沉淀将水相转移到新的离心管中，按0. 5ml异丙醇/lml Trizol试剂体积加入异丙醇，_20°C保存 60min, 12，OOOg, 4°C，离心 60min ；5、用lml Trizol试剂重悬沉淀，将悬液转移到新的1. 5ml的离心管中；6、重复2，4步(第四步离心改为15min)；7、RNA洗涤去掉上清，加入75%乙醇，12，OOOg，4°C离心5min ；8、测量浓度通常能得到 5 μ g RNA/50ml血清/血浆；9、总RNA进行PAGE电泳回收17_27nt RNA分子；10、将链接引物(adaptor prime，Solexa测序通用引物)酶联在小RNA分子的3' 与5'端；11、进行RT-PCR反应后并进行测序；12、数据分析与处理在每组中运用Solexa测序方法发现的血清/血浆稳定表达的微小核糖核酸在上文中已经罗列出。实施例3血清/血浆中miRNA的TLDA芯片检测将上述进行Solexa测序的10组样本经TLDA芯片检测(试剂盒购自ABI公司) 获得相关结果。具体步骤为1、每组取血清/血浆600 μ 1，加入3倍体积的Trizol试剂；2、相分离室温放置 15min，加入终浓度为 10_4pmol/ μ 1 的 cel-miR-39 (TAKARA) 作为内参，然后加入与血清/血浆等体积的氯仿，震荡50s，室温15min，14，000rpm，4°C，离心 15min ；3,RNA沉淀将水相转移到新的15ml的离心管，加入1. 5倍水相体积的无水乙醇， 充分混勻；4、用QIAGEN miRNeasy kit富集RNA 每次吸取700 μ 1样本至离心柱中， 14，OOOrpm离心15s，弃去收集管中滤液，重复至样本均过柱；加入700 μ 1洗液1， 14，OOOrpm离心15s，弃收集管中滤液；加入500 μ 1洗液2，14，OOOrpm离心15s，弃收集管中滤液；再加入500 μ 1洗液2，14，OOOrpm离心2min，弃收集管中滤液；将离心柱放回空的收集管中，14，OOOrpm离心^iiin以干燥离心管；将离心管放入新的1. 5ml管中，加入50 μ 1 无核酸酶水，10, OOOrpm离心Imin ；将管中的液体倒回离心柱中，14，OOOrpm离心lmin，弃离心柱；5、测量浓度通常能得到 1250ng RNA/600 μ 1血清/血浆；6、用TLDA芯片配套的逆转录试剂盒通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括0. 8μ 1逆转录引物(10Χ)、0. 2μ 1 IOOmM dNIPs混合物、1. 5 μ 1逆转录酶(50U/ μ L)、0. 8 μ 1 IOX逆转录缓冲液、0. 9 μ 1 25mM氯化镁、0. 1 μ 1 RNA抑制剂以及0. 2 μ 1无核酸酶水。加入3 μ 1 (l-350ng)的总RNA。反应步骤为16°C孵育2分钟，42°C反应1分钟，50°C反应1秒，上述3步经40个循环反应，再85°C孵育5分钟；10、对芯片特异性的miRNA进行预扩增以增加表达所需的CNDA的量。预扩增的反应体系包括12. 5μ 1预扩增Master Mix (2 X) ,2. 5 μ 1预扩增引物(10 X)、7. 5 μ 1无核酸酶水、2. 5 μ 1 CDNA。反应步骤为95°C 10分钟一55°C 2分钟一72°C 2分钟一95°C 15秒、 600C 4分钟，12个循环一99. 90C 10分钟；反应结束后加入75 μ 1 0. IX TE稀释；11、取9μ 1稀释后的预扩增产物，加入450μ 1基因表达Master Mix，441yl无核酸酶水，充分混勻后，在TLDA芯片上加入100 μ 1/孔；IOOOrpm离心lmin，离心2次。 TLDA芯片实验使用的是ABI Prism 7900荧光定量PCR仪。选择384-well TaqMan Low DensityArray特定的程序进行反应；12、数据分析与处理用RQ-Manger软件进行数据处理，Ct阈值设为0. 2。运用TLDA 芯片检测发现的各组中血清/血浆稳定表达的微小核糖核酸在上文中已经罗列出。实施例4血清/血浆中miRNA的qRT_PCR验证根据上述Solexa和TLDA结果，选择满足下列条件的miRNAs用qRT_PCR方法进一步的验证1) So 1 exa测序中这些miRNAs在不同肿瘤和健康对照组中平均拷贝数> 50，变异系数< 100% ；2) TLDA芯片检测中这些miRNA在不同肿瘤和健康对照组中平均Ct值< 25， 变异系数<5% ；3)在Solexa测序和TLDA芯片检测中均显示出稳定表达。对所选择的 miR-191、miR-320和miR-484等3个miRNAs设计逆转录和qRT-PCR的引物(见表2)。候选内参miRNA的稳定性见表1、图1。在整个研究过程中均实施严格的质控。每个样本连续检测三次。所有检测均采用盲法，即在不清楚样本背景的情况下完成以避免偏倚。(1)制备RNA样品a)取100 μ 1血清/血浆；b)加3倍体积的Trizol室温放置 15min，加入终浓度为1(Γ4ρπιο1/μ 1的cel_miR-39 (TAKARA)作为内参，然后加入与血清/血浆等体积的氯仿，震荡50s，室温15min，14，OOOrpm，4°C，离心15min ；c)将水相转移到新的 15ml的离心管，加入1. 5倍水相体积的无水乙醇，充分混勻；d)用QIAGEN公司的miRNeasy kit富集RNA 每次吸取700 μ 1样本至离心柱中，14，OOOrpm离心15s，弃去收集管中滤液， 重复至样本均过柱；加入700 μ 1洗液1，14，OOOrpm离心15s，弃收集管中滤液；加入500 μ 1 洗液2，14，OOOrpm离心15s，弃收集管中滤液；再加入500 μ 1洗液2，14，OOOrpm离心2min， 弃收集管中滤液；将离心柱放回空的收集管中，14，OOOrpm离心aiiin以干燥离心管；将离心管放入新的1. 5ml管中，加入50 μ 1无核酸酶水，10, OOOrpm离心Imin ；将管中的液体倒回离心柱中，14，OOOrpm离心lmin，弃离心柱，将管中的液体作为RNA样品；(2)探针法使用ABI试剂盒。a)通过RNA逆转录反应得到cDNA。探针法的逆转录反应体系包括0. 15 μ 1 IOOmMdNTPs混合物、1 μ 1逆转录酶(50U/ μ L)、1. 5 μ 1 IOX逆转录缓冲液、0. 19 μ 1 RNA抑制剂以及3μ 1 5X逆转录引物(miR-191、miR-320、miR-484和cel-miR-39的逆转录引物混合物，每种miRNA加入3/4 μ 1逆转录引物)。加入9. 16 μ 1的总RNA。反应步骤为16°C 孵育30分钟，42 °C反应30分钟，85 °C孵育5分钟；b) q-PCR 将cDNA加入5 μ 1水稀释，取1 μ 1稀释后的cDNA，分别加入 0. 25 μ 120 XMicroRNA 检测探针(miR-191、miR-320、miR-484 和 cel-miR-39 中单个 miRNA 的探针)、2. 5μ1 2 X基因表达Master Mix、1. 25 μ 1双蒸水，5 μ 1体系进行q-PCR。仪器使用的是ABI Prism 7900荧光定量PCR仪，PCR的反应条件是95°C、5分钟进行1个循环—95°C、15秒，60°C、1分钟进行45个循环。(3)染料法a)通过RNA逆转录反应得到cDNA。染料法的逆转录的反应体系包括4 μ 1 5 X AMV 缓冲液、2 μ 1 IOmM dNTP 混合物(Takara 公司)、0· 5 μ 1 RNase 抑制剂(Takara 公司)、 2 μ IAMV (Takara公司)以及1. 5μ 1 miRNA特异性反向引物的混合物(miR-191、miR-320、 miR-484和cel-miR-39的特异性反向引物混合物(见表2)，每种加入1. 5/4 μ 1)。反应步骤为16°C孵育15分钟，42°C反应1小时，85°C孵育5分钟；b) q-PCR 将cDNA按1/5体积稀释，取0. 5 μ 1稀释后的cDNA，加入0. 15 μ 1 Taq酶 (Takara公司)，0. 5μ 1 20XEVAGREEN，0. 1 μ 1 10 μ M正向引物一种(即分别采用上述单一 miRNA 对应的正向引物)，0. 1μ 1 ΙΟμΜ 通用反向引物(URP :TGGTGTCGTGGAGTCG)，0. 6 μ 1 25mM MgCl2,0. 8 μ 1 2. 5mM dNTP 混合物(Takara公司)，1 μ 1 10 XPCR缓冲液，6· 75 μ IH2O, 10 μ 1体系进行q-PCR。仪器使用的是ABI Prism 7900荧光定量PCR仪，PCR的反应条件是95°C、5分钟进行1个循环一95°C、15秒，60°C、1分钟进行45个循环。(4)数据处理与分析每个样品血浆miRNAs的表达量比值可用方程2_Δα表示，其中ACt = CT# 本_CT。el-miK-39，我们在每一个样本提取时加入cel-miR-39的RNA控制RNA提取时的差异，计算相对表达量(cel-miR-39的引物序列=SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8)。探针法qRT-PCR结果发现在50例样本中，miR-484的稳定性最好，而miR-191和 miR-484的组合其稳定性超过了单个miR-484。染料法结果与探针法类似未列出。因此，本发明人证明了 miR-484单独及miR-191和miR-484构成的组合能够稳定地在各肿瘤病人和健康对照中表达。表1.候选内参的稳定性评分
权利要求
1.一种用于血清/血浆miRNA检测的内参，其特征在于该内参为单独的miR-484或者 miR-191和miR-484构成的组合。
2.权利要求1所述的血清/血浆miRNA内参的引物，其特征在于该引物为 miR-191 的引物为 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ；miR-484 的引物为 SEQ ID No. 5 和SEQID No. 6。
3.权利要求1所述的血清/血浆miRNA内参在制备血清/血浆miRNA内参检测试剂盒中的应用。
4.权利要求2所述的引物在制备血清/血浆miRNA内参检测试剂盒中的应用。
5.一种血清/血浆miRNA内参检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有血清/血浆miRNA 中miR-191和miR-484的引物或者单独含有miR-484的引物。
6.根据权利要求5所述的内参检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求2所述的全部引物或者单独含有权利要求2所述的miR-484的引物。
7.根据权利要求5或6所述内参检测试剂盒，其特征在于该试剂盒还可以包括PCR技术常用的试剂。
全文摘要
本发明属于基因工程和肿瘤学领域，公开了一种用于血清/血浆miRNA检测的内参及其应用。该内参为单独的miR-484或者miR-191和miR-484构成的组合。该内参及其引物可用于制备内参检测试剂盒，用于血清/血浆miRNA内参的检测。
文档编号C12N15/11GK102443638SQ20111039802
公开日2012年5月9日 申请日期2011年12月5日 优先权日2011年12月5日
发明者张辰宇, 沈洪兵, 胡志斌, 董静 申请人:南京医科大学
技术领域：
本发明属于基因工程和肿瘤学领域，涉及一种用于血清/血浆miRNA检测的内参及其应用。
背景技术：
MicroRNAs (即miRNAs)是近年来肿瘤分子生物学研究领域的一个热点。成熟 miRNA是一类长约21- 个核苷酸的小分子非编码RNA，在胞核中，miRNA首先表达为数百核苷酸长的原始(primary miRNA，pri_miRNA)，而后由Drosha核酸酶处理成约100核苷酸长的前体(precursor miRNA, pre-miRNA)，并通过Exportin-5依赖的机制转运至胞浆；在胞浆中，进一步由Dicer核酸酶处理成成熟miRNA。成熟miRNA主要通过与靶mRNA 3’-非翻译区(UTR)的碱基互补配对来调控基因的表达，可以导致靶mRNA的降解或者翻译的抑制。生物信息学研究表明，单个miRNA分子能够与数百个功能各异的靶mRNA相结合而发挥调节作用，参与包括发育、代谢、细胞增长、凋亡、干细胞分化等几乎全部的病理生理学过程，与许多疾病的发生、发展存在着紧密的联系。研究还表明miRNA的表达谱可以区分瘤组织和非瘤组织，并且具有肿瘤特异性；而miRNA整体的成熟受限可以导致细胞的恶性转化。 目前被发现的人类miRNA的数目仍在逐渐增加，而其在转录后调控方面的重要作用也正被揭示，miRNA已经成为包括肿瘤在内的多种疾病发病、治疗和预后的重要候选标志物。既往对miRNAs的研究主要集中在它们在细胞内的活动。2008年，中美科学家同步发现血清/血浆中稳定存在miRNA。这些miRNA对RNase、酸碱环境、长时间(>M 小时)室温放置及反复冻融均不敏感，血浆和血清中无明显差异。目前有关血清/血浆 miRNA的来源还没有定论，多数研究者认为肿瘤患者血清/血浆中的miRNA来源于靶组织， 但其表达变化与靶组织的一致性还有待探讨；也有研究者认为miRNA可以被选择性富集到 "microparticles(MPs) ”或‘‘exosomes” 中，由细胞以‘‘microvesicles 微泡”脱落的方式主动向外分泌。无论如何，血清/血浆miRNA具备成为优质生物标志物的潜质，即含量丰富且性质稳定，拥有以蛋白质为代表的传统生物标志物所不具备的特质，即无需抗体制备且易于精确定量，而且具有疾病特异性，为生物标志物开拓了新境界。现有的血清/血浆miRNA检测技术已经较为成熟，如基因芯片技术、高通量测序技术以及最常用而有效的实时荧光定量PCR法，使得血清/血浆miRNA表达谱的获得成为可能。然而，目前尚缺乏可用于血清/血浆miRNA检测的稳定内参。与组织/细胞miRNA 不同，TO在血清/血浆中表达很低，无法作为血清/血浆miRNA表达的内参。目前研究者常用两种方法控制实验差异一是在实验的每一步都处理等体积的“适量”血清/血浆，二是在miRNA提取时，在加入Trizol使蛋白变性后即刻加入人工合成的非人类miRNA (如线虫-39，cel-miR-39)。尽管用上述两种方法，可以有效控制实验差异，但无法控制个体本身的生物学差异，特异而稳定的血清/血浆miRNA内参的缺乏仍制约着血清/血浆miRNA研究成果临床转化及不同实验室间研究成果的比较。因此，若能筛选出可用于血清/血浆miRNAs检测的内参，并研制相应的检测试剂盒，对血清/血浆miRNA相关研究成果的临床转化及提高肿瘤等疾病的临床诊疗水平必将是一次有力的推动。
发明内容
本发明的首要目的是针对上述技术问题，提出一种用于血清/血浆miRNA检测的内参。本发明的第二个目的是提供上述血清/血浆miRNA检测内参的引物。本发明的第三个目的是提供上述血清/血浆miRNA检测内参及其引物在制备血清 /血浆miRNA内参检测试剂盒中的应用。本发明第四个目的是提供血清/血浆miRNA内参检测的试剂盒。发明人通过分离和研究不同肿瘤病人及健康对照血清/血浆中的miRNAs，寻找一组在不同疾病性状及健康者间稳定表达的内参，并研制出可便于临床应用的内参检测试剂盒，为血清/血浆miRNA研究成果的临床转化及不同实验室间研究成果的比较提供数据支持。本发明的目的是通过下列技术方案实现的一种用于血清/血浆miRNA检测的内参，该内参为单独的miR-484或者miR-191 与miR-484构成的组合。所述的血清/血浆miRNA内参的引物，这些引物为miR-191 的引物为 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ；miR-484 的引物为 SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6。所述的血清/血浆miRNA内参在制备血清/血浆miRNA内参检测试剂盒中的应用。所述血清/血浆miRNA内参的引物在制备血清/血浆miRNA内参检测试剂盒中的应用。一种血清/血浆miRNA内参检测试剂盒，该试剂盒用于检测血清/血浆中miR-484 或者miR-191和miR-484构成的组合。所述的检测试剂盒，该试剂盒含有血清/血浆miRNA中miR-191和miR-484的引物或者单独含有miR-484的引物；其中miR-191 的引物为 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ；miR-484 的引物为 SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6。所述检测试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如逆转录酶，缓冲液， dNTPs, MgCl2, DEPC水和Taq酶等；还可以含有标准品和/或对照品。具体地说，本发明解决问题的技术方案包括(1)以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本。( 血清/血浆miRNA表达谱分析选择肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、宫颈癌病人、男性健康对照和女性健康对照，检测其血清/血浆miRNA表达谱及含量，分析不同肿瘤病例和对照间血清/血浆miRNA表达的稳定性，筛选稳定表达miRNAs，即候选内参 miRNA,进行进一步验证。( 对筛选出的稳定表达的血清/血浆候选内参miRNAs在食管癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、口腔癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、肝癌和健康对照中进行定量分析， 确定可用于血清/血浆miRNAs检测的内参。(4)血清/血浆miRNA内参检测试剂盒的研制根据不同肿瘤病例和健康对照的稳定表达的血清/血浆miRNA，开发血清/血浆miRNAs 内参检测试剂盒，用于比较不同实验室间的相关研究结果并实现其临床转化。本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，并采用了 RT-PCR、 Real-timePCR 方法、SoIexa 测序技术、TaqMan Low Density Array (TLDA)芯片检测等。具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分1.研究样本的选择(1)经病理学明确诊断的肿瘤病人，包括内参筛选阶段的肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌和宫颈癌病例，和内参验证阶段的食管癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、口腔癌、胃癌、肺癌、乳腺癌和肝癌病例(2)采血前未经过手术和放化疗，无手术前放化疗(3)健康男性、女性对照本研究共采用3M例符合标准的样本进行研究。2. Trizol 试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA)和 miRNeasy Mini Kit (QIAGEN 公司) 提取血清/血浆总RNA，按常规方法操作。通常能得到 5yg RNA/50ml血清或血浆。3. Solexa 测序(1)总RNA进行PAGE电泳回收17_27nt RNA分子(2)将链接引物(adaptor prime，Solexa测序通用引物)酶联在小RNA分子的3' 与5'端(3)进行RT-PCR反应后进行测序(4)数据分析与处理4. TLDA(Applied Biosystems 公司)芯片检测(1)总RNA通过逆转录反应得到cDNA样品(2)cDNA样品进行预扩增反应(3)预扩增产物进行TLDA芯片检测，得到miRNA的表达谱(4)数据分析与处理5. Real-time RT-PCR(qRT-PCR)方法(1)取受试者的血清/血浆总RNA，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；(2)设计引物；(3)加入荧光探针或染料进行PCR反应；(4)检测并比较不同肿瘤病人和健康对照血清/血浆样本中miRNA的量的稳定性。6.内参检测试剂盒制备方法不同肿瘤病人和健康对照中拷贝数和表达水平均稳定的miRNA，通过qRT_PCR技术筛选在不同肿瘤病人和健康对照中表达稳定的一组血清/血浆miRNA，作为血清/血浆 miRNA检测的内参。最后筛选出的血清/血浆miRNA内参组成检测试剂盒(单独的miR-484 或者miR-191与miR-484构成的组合)。检测试剂盒可以包括这些血清/血浆微小核糖核酸组合的引物，探针，以及Taq酶、dNTP等试剂。7.统计分析方法运用变异系数CV分析每个miRNA在不同样本之间的变异程度。运用Normfinder 禾口定量表达数据内参基因在线分析工具(http//www. leonxie. com/referencegene. php)分析各个miRNA在不同样本中的稳定性。miRNA稳定值越低，其稳定性越高。我们在筛选阶段样本人群，包括60例肺癌(30例长生存期和30例短生存期)、48 例乳腺癌(24例一组)、40例胃癌(20例一组)、30例肝癌、30例宫颈癌病例和48例健康男性对照，48例健康女性对照，综合运用Solexa测序和TLDA芯片的研究结果发现有3种 miRNAs在各样本间可稳定表达。对稳定表达的miRNAs在另外5例食管癌、5例结肠癌、5例直肠癌、5例胰腺癌、5例口腔癌、5例胃癌、5例肺癌、5例乳腺癌、5例肝癌病例和5例健康对照中进行进一步验证，进而观察本研究结果的稳定程度。以下是本发明进一步的说明在上述筛选阶段样本中，我们将这10组合并样本经Solexa测序试验及TLDA芯片检测获得相关结果。根据Solexa测序方法，本发明人检测到在不同肿瘤和健康对照组中的血清/血浆中稳定表达(平均拷贝数> 50，变异系数< 100% )的微小核糖核酸包括hsa-miR-191、 hsa—miR-320、hsa—miR-484、hsa—miR-222、hsa-let_7a、hsa-let_7b、hsa-let_7c、 hsa-let_7d、hsa-let_7e、hsa-let_7f、hsa—miR-103、hsa—miR-107、hsa—miR-122、 hsa-miR-125a_5p、hsa-miR-139_3p、hsa-miR-140_3p、hsa-miR-192、hsa-miR-197、 hsa-miR-221、hsa-miR-23a、hsa-miR-25、hsa-miR-30d、hsa-miR-339-5p、hsa-miR-423-3p、 hsa-miR-423_5p、hsa-miR-451、hsa-miR-486_3p、hsa-miR-486_5p、hsa-miR-532_3p、 hsa—miR-584、hsa-miR-744、hsa-miR-99a。根据TLDA芯片检测，本发明人检测到在不同肿瘤和健康对照组中的血清/血浆中稳定表达(平均Ct值< 25，变异系数< 5% )的微小核糖核酸包括hsa-miR-191、 hsa—miR-320、hsa—miR-484、hsa—miR-126、hsa—miR-150、hsa—miR-24、hsa_miR-20a、 hsa—miR-17、hsa_miR-106a、hsa_miR-92a、hsa_miR-19b、hsa_miR-146a0根据上述两种方法检测的结果，选择在Solexa测序和TLDA芯片中均稳定表达的 miRNAs用qRT-PCR方法进一步的验证满足上述条件的miRNAs 包括miR_191、miR-320 和 miR-484。根据上述结果，将这3个候选内参miRNAs在另外5例食管癌、5例结肠癌、5例直肠癌、5例胰腺癌、5例口腔癌、5例胃癌、5例肺癌、5例乳腺癌、5例肝癌病例和5例健康对照分别用探针法和染料法qRT-PCR进一步的验证。Normfinder和内参在线分析软件均表明， 就血清/血浆中单个miRNA而言，miR-484的表达最为稳定，而miR-191和miR-484的组合其稳定性超过了单个miR-484。探针法和染料法结果一致。根据上述实验结果，本发明人制备了一种能用于血清/血浆miRNA内参检测的试剂盒，包含测定受试者血清/血浆中稳定存在且可检测的成熟miR-191和miR-484的引物和其他检测试剂。具体而言，miR-484单独及miR-191和miR-484构成的组合，或者miR-484单独的引物及miR-191和miR-484组合的引物构成的内参检测试剂盒，促进了血清/血浆miRNA 相关研究结果的临床转化和不同实验室研究结果的比较，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。本申请中“血清/血浆”中的“/”表示“和”及“或”的关系。本发明的有益效果
本发明提供的血清/血浆微小核糖核酸(microRNAs/miRNAs)检测内参的优点在于(1)血清/血浆miRNAs是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类小分子RNA 内参的成功研究有助于血清/血浆miRNAs在疾病早期诊断及预后判断等方面价值的临床转化，以及不同实验室之间研究结果的比较。(2)血清/血浆miRNAs内参检测试剂盒可用于检测不同受试者血清/血浆中的内参miRNAs，有助于反映不同受试者内参miRNA的基线表达水平，用于控制个体生物学差异导致的miRNA表达水平差异，以凸显真正与疾病相关的差异表达miRNA。(3)采用严密的设计和评价体系，本发明人初期采用Solexa全基因组测序技术对血清/血浆miRNAs进行直接测序，同时采用TLDA芯片检测以获取稳定表达的血清/血浆 miRNAs，并应用qRT-PCR的方法进行了单个样本验证；以上方法和策略的应用加速和保证了血清/血浆miRNAs内参检测试剂盒的应用。本发明通过研究血清/血浆中稳定表达的miRNA，寻求可用于血清/血浆miRNA检测的内参。因此，本发明获得了血清/血浆miRNAs表达数据库和稳定表达的内参miRNA; 通过血清/血浆miRNAs内参试剂盒的研制和应用，促进血清/血浆miRNAs相关研究结果的临床转化和不同实验室间研究结果的比较，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
图1.显示不同肿瘤病人和对照的3种候选内参miRNA及cel-miR-39的的表达折线图。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。实施例1样品的收集和样品资料的整理发明人自2003年7月起从江苏省内多个三级甲等医院收集了大量的各肿瘤病人及健康对照血清/血浆样品，用于研究的病例和对照样本均为同期收取，采样、分装、保存条件均一，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了 3M例符合下列标准的样本作为 Solexa测序、TLDA芯片检测和后续一系列qRT_PCR验证的实验样品1、经病理学明确诊断的肿瘤病人，包括内参筛选阶段的肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌和宫颈癌病例，和内参验证阶段的食管癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、口腔癌、胃癌、肺癌、乳腺癌和肝癌病例。2、采血前未经过手术和放化疗，无手术前放化疗。3、健康男性、女性对照。并系统采集了这些样本的人口学资料、临床资料等情况。实施例2血清/血浆中miRNA的Solexa测序实验上述符合条件的样本包括60例肺癌(30例长生存期组和30例短生存期组)、48 例乳腺癌(24例/组)、40例胃癌(20例/组)、30例肝癌、30例宫颈癌病例和48例健康男性对照，48例健康女性对照。将这10组人群经Solexa测序试验(试剂盒购自ABI公司) 获得相关结果。具体步骤为1、每组样本取血清/血浆50ml，加入等体积的Trizol试剂；2、相分离室温放置15min，然后按0. 2ml氯仿/lml Trizol试剂的体积比加入氯仿，震荡 15s,室温 15min, 12，OOOg, 4°C，离心 15min ；3、将水相转移到新的50ml的离心管，3步苯酚/氯仿除去蛋白相；4,RNA沉淀将水相转移到新的离心管中，按0. 5ml异丙醇/lml Trizol试剂体积加入异丙醇，_20°C保存 60min, 12，OOOg, 4°C，离心 60min ；5、用lml Trizol试剂重悬沉淀，将悬液转移到新的1. 5ml的离心管中；6、重复2，4步(第四步离心改为15min)；7、RNA洗涤去掉上清，加入75%乙醇，12，OOOg，4°C离心5min ；8、测量浓度通常能得到 5 μ g RNA/50ml血清/血浆；9、总RNA进行PAGE电泳回收17_27nt RNA分子；10、将链接引物(adaptor prime，Solexa测序通用引物)酶联在小RNA分子的3' 与5'端；11、进行RT-PCR反应后并进行测序；12、数据分析与处理在每组中运用Solexa测序方法发现的血清/血浆稳定表达的微小核糖核酸在上文中已经罗列出。实施例3血清/血浆中miRNA的TLDA芯片检测将上述进行Solexa测序的10组样本经TLDA芯片检测(试剂盒购自ABI公司) 获得相关结果。具体步骤为1、每组取血清/血浆600 μ 1，加入3倍体积的Trizol试剂；2、相分离室温放置 15min，加入终浓度为 10_4pmol/ μ 1 的 cel-miR-39 (TAKARA) 作为内参，然后加入与血清/血浆等体积的氯仿，震荡50s，室温15min，14，000rpm，4°C，离心 15min ；3,RNA沉淀将水相转移到新的15ml的离心管，加入1. 5倍水相体积的无水乙醇， 充分混勻；4、用QIAGEN miRNeasy kit富集RNA 每次吸取700 μ 1样本至离心柱中， 14，OOOrpm离心15s，弃去收集管中滤液，重复至样本均过柱；加入700 μ 1洗液1， 14，OOOrpm离心15s，弃收集管中滤液；加入500 μ 1洗液2，14，OOOrpm离心15s，弃收集管中滤液；再加入500 μ 1洗液2，14，OOOrpm离心2min，弃收集管中滤液；将离心柱放回空的收集管中，14，OOOrpm离心^iiin以干燥离心管；将离心管放入新的1. 5ml管中，加入50 μ 1 无核酸酶水，10, OOOrpm离心Imin ；将管中的液体倒回离心柱中，14，OOOrpm离心lmin，弃离心柱；5、测量浓度通常能得到 1250ng RNA/600 μ 1血清/血浆；6、用TLDA芯片配套的逆转录试剂盒通过RNA逆转录反应得到cDNA。逆转录的反应体系包括0. 8μ 1逆转录引物(10Χ)、0. 2μ 1 IOOmM dNIPs混合物、1. 5 μ 1逆转录酶(50U/ μ L)、0. 8 μ 1 IOX逆转录缓冲液、0. 9 μ 1 25mM氯化镁、0. 1 μ 1 RNA抑制剂以及0. 2 μ 1无核酸酶水。加入3 μ 1 (l-350ng)的总RNA。反应步骤为16°C孵育2分钟，42°C反应1分钟，50°C反应1秒，上述3步经40个循环反应，再85°C孵育5分钟；10、对芯片特异性的miRNA进行预扩增以增加表达所需的CNDA的量。预扩增的反应体系包括12. 5μ 1预扩增Master Mix (2 X) ,2. 5 μ 1预扩增引物(10 X)、7. 5 μ 1无核酸酶水、2. 5 μ 1 CDNA。反应步骤为95°C 10分钟一55°C 2分钟一72°C 2分钟一95°C 15秒、 600C 4分钟，12个循环一99. 90C 10分钟；反应结束后加入75 μ 1 0. IX TE稀释；11、取9μ 1稀释后的预扩增产物，加入450μ 1基因表达Master Mix，441yl无核酸酶水，充分混勻后，在TLDA芯片上加入100 μ 1/孔；IOOOrpm离心lmin，离心2次。 TLDA芯片实验使用的是ABI Prism 7900荧光定量PCR仪。选择384-well TaqMan Low DensityArray特定的程序进行反应；12、数据分析与处理用RQ-Manger软件进行数据处理，Ct阈值设为0. 2。运用TLDA 芯片检测发现的各组中血清/血浆稳定表达的微小核糖核酸在上文中已经罗列出。实施例4血清/血浆中miRNA的qRT_PCR验证根据上述Solexa和TLDA结果，选择满足下列条件的miRNAs用qRT_PCR方法进一步的验证1) So 1 exa测序中这些miRNAs在不同肿瘤和健康对照组中平均拷贝数> 50，变异系数< 100% ；2) TLDA芯片检测中这些miRNA在不同肿瘤和健康对照组中平均Ct值< 25， 变异系数<5% ；3)在Solexa测序和TLDA芯片检测中均显示出稳定表达。对所选择的 miR-191、miR-320和miR-484等3个miRNAs设计逆转录和qRT-PCR的引物(见表2)。候选内参miRNA的稳定性见表1、图1。在整个研究过程中均实施严格的质控。每个样本连续检测三次。所有检测均采用盲法，即在不清楚样本背景的情况下完成以避免偏倚。(1)制备RNA样品a)取100 μ 1血清/血浆；b)加3倍体积的Trizol室温放置 15min，加入终浓度为1(Γ4ρπιο1/μ 1的cel_miR-39 (TAKARA)作为内参，然后加入与血清/血浆等体积的氯仿，震荡50s，室温15min，14，OOOrpm，4°C，离心15min ；c)将水相转移到新的 15ml的离心管，加入1. 5倍水相体积的无水乙醇，充分混勻；d)用QIAGEN公司的miRNeasy kit富集RNA 每次吸取700 μ 1样本至离心柱中，14，OOOrpm离心15s，弃去收集管中滤液， 重复至样本均过柱；加入700 μ 1洗液1，14，OOOrpm离心15s，弃收集管中滤液；加入500 μ 1 洗液2，14，OOOrpm离心15s，弃收集管中滤液；再加入500 μ 1洗液2，14，OOOrpm离心2min， 弃收集管中滤液；将离心柱放回空的收集管中，14，OOOrpm离心aiiin以干燥离心管；将离心管放入新的1. 5ml管中，加入50 μ 1无核酸酶水，10, OOOrpm离心Imin ；将管中的液体倒回离心柱中，14，OOOrpm离心lmin，弃离心柱，将管中的液体作为RNA样品；(2)探针法使用ABI试剂盒。a)通过RNA逆转录反应得到cDNA。探针法的逆转录反应体系包括0. 15 μ 1 IOOmMdNTPs混合物、1 μ 1逆转录酶(50U/ μ L)、1. 5 μ 1 IOX逆转录缓冲液、0. 19 μ 1 RNA抑制剂以及3μ 1 5X逆转录引物(miR-191、miR-320、miR-484和cel-miR-39的逆转录引物混合物，每种miRNA加入3/4 μ 1逆转录引物)。加入9. 16 μ 1的总RNA。反应步骤为16°C 孵育30分钟，42 °C反应30分钟，85 °C孵育5分钟；b) q-PCR 将cDNA加入5 μ 1水稀释，取1 μ 1稀释后的cDNA，分别加入 0. 25 μ 120 XMicroRNA 检测探针(miR-191、miR-320、miR-484 和 cel-miR-39 中单个 miRNA 的探针)、2. 5μ1 2 X基因表达Master Mix、1. 25 μ 1双蒸水，5 μ 1体系进行q-PCR。仪器使用的是ABI Prism 7900荧光定量PCR仪，PCR的反应条件是95°C、5分钟进行1个循环—95°C、15秒，60°C、1分钟进行45个循环。(3)染料法a)通过RNA逆转录反应得到cDNA。染料法的逆转录的反应体系包括4 μ 1 5 X AMV 缓冲液、2 μ 1 IOmM dNTP 混合物(Takara 公司)、0· 5 μ 1 RNase 抑制剂(Takara 公司)、 2 μ IAMV (Takara公司)以及1. 5μ 1 miRNA特异性反向引物的混合物(miR-191、miR-320、 miR-484和cel-miR-39的特异性反向引物混合物(见表2)，每种加入1. 5/4 μ 1)。反应步骤为16°C孵育15分钟，42°C反应1小时，85°C孵育5分钟；b) q-PCR 将cDNA按1/5体积稀释，取0. 5 μ 1稀释后的cDNA，加入0. 15 μ 1 Taq酶 (Takara公司)，0. 5μ 1 20XEVAGREEN，0. 1 μ 1 10 μ M正向引物一种(即分别采用上述单一 miRNA 对应的正向引物)，0. 1μ 1 ΙΟμΜ 通用反向引物(URP :TGGTGTCGTGGAGTCG)，0. 6 μ 1 25mM MgCl2,0. 8 μ 1 2. 5mM dNTP 混合物(Takara公司)，1 μ 1 10 XPCR缓冲液，6· 75 μ IH2O, 10 μ 1体系进行q-PCR。仪器使用的是ABI Prism 7900荧光定量PCR仪，PCR的反应条件是95°C、5分钟进行1个循环一95°C、15秒，60°C、1分钟进行45个循环。(4)数据处理与分析每个样品血浆miRNAs的表达量比值可用方程2_Δα表示，其中ACt = CT# 本_CT。el-miK-39，我们在每一个样本提取时加入cel-miR-39的RNA控制RNA提取时的差异，计算相对表达量(cel-miR-39的引物序列=SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8)。探针法qRT-PCR结果发现在50例样本中，miR-484的稳定性最好，而miR-191和 miR-484的组合其稳定性超过了单个miR-484。染料法结果与探针法类似未列出。因此，本发明人证明了 miR-484单独及miR-191和miR-484构成的组合能够稳定地在各肿瘤病人和健康对照中表达。表1.候选内参的稳定性评分
权利要求
1.一种用于血清/血浆miRNA检测的内参，其特征在于该内参为单独的miR-484或者 miR-191和miR-484构成的组合。
2.权利要求1所述的血清/血浆miRNA内参的引物，其特征在于该引物为 miR-191 的引物为 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 ；miR-484 的引物为 SEQ ID No. 5 和SEQID No. 6。
3.权利要求1所述的血清/血浆miRNA内参在制备血清/血浆miRNA内参检测试剂盒中的应用。
4.权利要求2所述的引物在制备血清/血浆miRNA内参检测试剂盒中的应用。
5.一种血清/血浆miRNA内参检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有血清/血浆miRNA 中miR-191和miR-484的引物或者单独含有miR-484的引物。
6.根据权利要求5所述的内参检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求2所述的全部引物或者单独含有权利要求2所述的miR-484的引物。
7.根据权利要求5或6所述内参检测试剂盒，其特征在于该试剂盒还可以包括PCR技术常用的试剂。
全文摘要
本发明属于基因工程和肿瘤学领域，公开了一种用于血清/血浆miRNA检测的内参及其应用。该内参为单独的miR-484或者miR-191和miR-484构成的组合。该内参及其引物可用于制备内参检测试剂盒，用于血清/血浆miRNA内参的检测。
文档编号C12N15/11GK102443638SQ20111039802
公开日2012年5月9日 申请日期2011年12月5日 优先权日2011年12月5日
发明者张辰宇, 沈洪兵, 胡志斌, 董静 申请人:南京医科大学
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0访客 来自[未知地区] 2018年12月27日 10:47血清血浆中的mirna含量较低，提取起来不容易，但mirna对一些疾病的诊断很有帮助，提取上我们一般使用biog富集技术，可以扩大提取的量。
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