专利名称：一种北京棒杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域，具体的说是涉及一种北京棒杆菌及其应用。
背景技术：
L-赖氨酸，学名为2，6_二氨基己酸，是组成蛋白质的常见20种氨基酸中的一种碱
性氨基酸，是人体必需氨基酸之一。蛋白质是构成人体细胞的主要成份，食物中的蛋白质进入人体后经过消化先分解成氨基酸，然后人体又利用这些氨基酸再合成新的人体蛋白质，如免疫抗体、消化酶、血浆蛋白、生长激素等都是合成后的人体蛋白质。在合成蛋白质的各种氨基酸中，L-赖氨酸是最重要的一种，少了它，其它氨基酸就受到限制或得不到利用，科学家称它为人体第一必需氨基酸。近年来，科学家还发现，L-赖氨酸是控制人体生长的重要物质-抑长素中最重要的也是最必需的成份，对人的中枢神经和周围神经系统都起着重要作用。人体不能自身合成L-赖氨酸，必须从食物中吸取赖氨酸，它是帮助其它营养物质被人体充分吸收和利用的关键物质，人体只有补充了足够的L-赖氨酸才能提高食物蛋白质的吸收和利用，达到均衡营养，促进生长发育。现有技术主要以糖质为原料经微生物发酵产生，然后采用“等电点提取”加上“离子交换树脂”分离获得。L-赖氨酸产量高低与所采用的微生物种类密不可分，北京棒杆菌是在L-赖氨酸发酵中常用的菌种之一，但是其L-赖氨酸产量并不高。因此，提供一种L-赖氨酸高产菌株，对于提高L-赖氨酸的发酵效率具有重要意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种北京棒杆菌及其应用，使得所述北京棒杆菌能够提高L-赖氨酸的产量。为实现上述发明目的，本发明以野生型北京棒杆菌CICC 21721(购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心)为出发菌株，以N-甲基-N'硝基-N-亚硝基胍为诱变剂对其进行化学诱变，然后将经诱变后的北京棒杆菌CICC 21721的悬浮菌液涂布在含有新霉素的培养基上，从含有新霉素培养基上筛选出具有新霉素抗性的菌株，命名为菌株MHZ-0910。本发明将上述筛选出的菌株MHZ-0910按照东秀珠、蔡妙英主编的《常见细菌系统鉴定手册》的方法对其进行生理生化特性检测，检测结果与野生型北京棒杆菌一致。此外， 经16S DNA检测分析，菌株MHZ-0910与野生型北京棒杆菌同源性高达99%，结合生理生化特征，鉴定其为北京棒杆菌。本发明所述北京棒杆菌MHZ-0910已于2011年10月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 5361。本发明所述北京棒杆菌MHZ-0910与野生型北京棒杆菌CICC 21721的L-赖氨酸发酵对比试验显示，本发明所述北京棒杆菌MHZ-0910发酵合成的L-赖氨酸含量为29. 6g/L，而野生型北京棒杆菌CICC 21721发酵合成的L-赖氨酸含量为25. 8g/L，L-赖氨酸产量提高了 14.7%。因此，本发明所述北京棒杆菌MHZ-0910能够应用于生产L-赖氨酸中。新霉素是一种氨基糖苷类抗生素，通过结合于细胞内的核糖体上干扰细菌蛋白质合成，使之合成异常的蛋白质，并使细菌细胞膜通透性增加，导致细胞内重要生理物质外漏而呈现杀菌作用，对静止期细菌杀菌作用较强，为静止期杀菌类抗生素。而本发明所述北京棒杆菌MHZ-0910具有对新霉素的抗性并能提高L-赖氨酸合成能力。在野生菌株获得新霉素抗性后，可能由于本发明所述北京棒杆菌MHZ-0910合成异常的蛋白质抵抗新霉素，这些异常的蛋白质导致L-赖氨酸合成酶系解除了某些产物的反馈抑制作用，从而导致突变株的L-赖氨酸产量得到提高，或者MHZ-0910细胞膜上的赖氨酸转运蛋白功能发生变化促进了赖氨酸从细胞内转运出去的速度，从而导致突变株的L-赖氨酸产量得到提高。此外，本发明还提供了一种L-赖氨酸生产方法，将保藏编号为CGMCCNo. 5361的北京棒杆菌接种于种子培养基进行扩繁，然后将扩繁后的培养物转入发酵培养基发酵，发酵期间维持PH值为6-9。其中，作为优选，发酵期间的pH值为6. 5-7. 4。本发明所述生产方法可以一直进行到不再产生L-赖氨酸为止，然后可根据本领域常规方法对L-赖氨酸进行分离。对于扩繁用的种子培养基以及发酵用的发酵培养基为本领域公知，本领域技术人员均可采用合适的培养基进行L-赖氨酸的发酵。作为优选，本发明所述种子培养基由20g/ L葡萄糖、5g/L硫酸铵、lg/L磷酸二氢钾、30g/L玉米浆、3g/L豆粕水解液、100 μ g/L生物素、200μ g/L硫胺素组成，pH值为7. 2-7. 4。所述发酵培养基由95g/L糖蜜、lg/L磷酸二氢钾、25g/L玉米浆、3g/L豆粕水解液、40g/L硫酸铵、50g/L葡萄糖、30g/L碳酸钙、100 μ g/L 生物素、200 μ g/L硫胺素组成，pH值为7. 2-7. 4。由以上技术方案可知，本发明所述保藏编号为CGMCC No. 5361的北京棒杆菌 MHZ-0910以野生型北京棒杆菌CICC 21721为出发菌株，经化学诱变后通过含有新霉素培养基筛选得到，其发酵生成L-赖氨酸的能力较野生型北京棒杆菌显著提高，L-赖氨酸产量提高了 14.7%。因此，本发明所述保藏编号为CGMCC No. 5361的北京棒杆菌能够广泛应用于L-赖氨酸的发酵中。生物保藏信息说明分类命名北京棒杆菌，Corynebacterium pekinense.于2011年10月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院 3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo. 5361。
具体实施例方式本发明实施例公开了一种北京棒杆菌及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的菌株已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1 本发明所述北京棒杆菌MHZ-0910的筛选将出发菌株-野生型北京棒杆菌CICC 21721接种在LB液体培养基中30°C培养16 小时获得处于对数生长期的菌悬液，然后将该菌悬液涂布在LB固体平板上，将适量的N-甲基-N'硝基-N-亚硝基胍固体颗粒放至LB固体平板中央，置于30°C培养箱中培养16小时后刮取N-甲基-N'硝基-N-亚硝基胍颗粒周围有微弱生长的菌苔悬浮在适量的无菌生理盐水中，将悬浮有菌苔的生理盐水涂布在含有0. 5mg/L的LB固体平板上，30°C继续培养2 天，根据菌落形态、颜色等特征挑取单菌落，命名为MHZ-0910。LB液体培养基/LB固体平板配方如下牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl 5g、生物素 50ug、硫胺素lOOug、亮氨酸lOOmg、高丝氨酸100mg、苏氨酸lOOmg、甲硫氨酸lOOmg、琼脂 18g，用蒸馏水溶解并调节pH至6. 8-7. 4后定容至1000ml。其中，LB液体培养基与LB固体平板的差别在于琼脂是否添加。生物素、硫胺素、 亮氨酸、高丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸非必须添加，可根据实际需要添加。将上述筛选出的菌株MHZ-0910按照东秀珠、蔡妙英主编的《常见细菌系统鉴定手册》的方法对其进行生理生化特性检测，检测结果与野生型北京棒杆菌一致。此外，经16S DNA检测分析，菌株MHZ-0910与野生型北京棒杆菌同源性高达99%，结合生理生化特征，鉴定其为北京棒杆菌。实施例2 本发明所述L-赖氨酸生产方法及L-赖氨酸发酵对比试验1、发酵方法将本发明所述北京棒杆菌MHZ-0910接种在以下所述的种子培养基中扩繁，于 30°C振荡培养16小时，将所得培养物接种到以下所述的发酵培养基中，培养物与发酵培养基的体积比为1 10(本领域技术人员可根据实际生产中的发酵培养基的量适当调节，本比例只是优选比例)，30°C振荡培养至不再产生L-赖氨酸为止(一般为72小时左右)。在发酵培养基中振荡培养时，维持发酵培养基中的PH值介于6. 5-7. 4之间。种子培养基20g/L葡萄糖、5g/L硫酸铵、lg/L磷酸二氢钾、30g/L玉米浆、3g/L豆粕水解液、 100 μ g/L生物素、200 μ g/L硫胺素组成，pH值为7. 2-7. 4。发酵培养基95g/L糖蜜、lg/L磷酸二氢钾、25g/L玉米浆、3g/L豆粕水解液、40g/ L硫酸铵、50g/L葡萄糖、30g/L碳酸钙、100 μ g/L生物素、200 μ g/L硫胺素组成，pH值为 7. 2-7. 4。 2、L-赖氨酸发酵对比试验将本发明所述北京棒杆菌MHZ-0910和野生型北京棒杆菌CICC 21721按照上述生产方法同时进行发酵，两种菌株的发酵环境、接种量均相同，停止发酵后通过生物传感仪测定两种菌株所合成的L-赖氨酸含量。结果以L-赖氨酸盐酸盐计，野生型北京棒杆菌CICC 21721产量为25.8g/L，本发明所述北京棒杆菌MHZ-0910产量为29. 6g/L，突变菌株L-赖氨酸产量较出发菌株CICC 21721 提高了 14. 7%。以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
权利要求
1.一种北京棒杆菌，其特征在于，保藏编号为CGMCC No. 5361。
2.保藏编号为CGMCCNo. 5361的北京棒杆菌在生产L-赖氨酸中的应用。
3.—种L-赖氨酸生产方法，其特征在于，将保藏编号为CGMCC No. 5361的北京棒杆菌接种于种子培养基进行扩繁，然后将扩繁后的培养物转入发酵培养基发酵，发酵期间维持 PH值为6-9。
4.根据权利要求3所述生产方法，其特征在于，所述发酵期间的pH值为6.5-7. 4。
5.根据权利要求3所述生产方法，其特征在于，所述种子培养基由20g/L葡萄糖、5g/L 硫酸铵、lg/L磷酸二氢钾、30g/L玉米浆、3g/L豆粕水解液、100 μ g/L生物素、200 μ g/L硫胺素组成，PH值为7. 2-7.4。
6.根据权利要求3所述生产方法，其特征在于，所述发酵培养基由95g/L糖蜜、lg/L 磷酸二氢钾、25g/L玉米浆、3g/L豆粕水解液、40g/L硫酸铵、50g/L葡萄糖、30g/L碳酸钙、 100 μ g/L生物素、200 μ g/L硫胺素组成，PH值为7. 2-7. 4。
全文摘要
本发明涉及微生物领域，公开了一种北京棒杆菌，其保藏编号为CGMCC No.5361。本发明所述保藏编号为CGMCC No.5361的北京棒杆菌以野生型北京棒杆菌CICC 21721为出发菌株，经化学诱变后通过含有新霉素培养基筛选得到，其发酵生成L-赖氨酸的能力较野生型北京棒杆菌显著提高，L-赖氨酸产量提高了14.7％。因此，本发明所述保藏编号为CGMCC No.5361的北京棒杆菌能够广泛应用于L-赖氨酸的发酵中。
文档编号C12P13/08GK102382787SQ20111041462
公开日2012年3月21日 申请日期2011年12月13日 优先权日2011年12月13日
发明者何君, 周希贵, 李岩, 胡征宇, 高云飞 申请人:梅花生物科技集团股份有限公司