包含在螯合剂的存在下具有高稳定性的淀粉酶的变体的清洁组合物的制作方法

专利名称：包含在螯合剂的存在下具有高稳定性的淀粉酶的变体的清洁组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含α -淀粉酶的变体的清洁组合物，所述变体相对于其亲本酶对螯合剂具有改善的稳定性。
_4] 发明背景
α -淀粉酶(α -1，4-葡聚糖_4_葡聚糖水解酶，Ε. C. 3. 2. I. I)构成一组酶，它们催化淀粉与其它直链和支链1，4_葡糖苷低聚-和多糖的水解。使用的第一细菌α -淀粉酶是来自地衣芽孢杆菌(B. Iicheniformis)的α -淀粉酶，也称为特妙淀粉酶，其已经被广泛的表征并且已经测定了这种酶的晶体结构。碱性淀粉酶如来源于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的α-淀粉酶在WO 95/26397中公开，它们构成一组在洗涤剂中使用的特殊α-淀粉酶。多种这些已知的细菌淀粉酶已经经修饰已改善它们在特定应用中的功能。特妙淀粉酶和多种高效α -淀粉酶需要钙以具有活性。发现特妙淀粉酶的晶体结构是四个钙原子结合到α-淀粉酶结构中，所述结构由带负电的氨基酸残基配位。在其它α-淀粉酶中结合到结构中的钙离子的量可能不同。这种对钙的需求在其中存在强螯合化合物的应用中，例如在洗涤剂和清洁组合物中是一个缺点。如上所述，熟知的是许多酶依赖钙或其它金属离子如镁或锌以获得活性和稳定性，因此，开发在包含螯合剂的洗涤剂和清洁组合物中既稳定又显示良好性能的酶是一个挑战。加入螯合剂以降低洗涤期间的水硬度、保护也可能存在的漂白剂，并且螯合剂也具有对移除污溃的直接效应。洗涤剂中依赖钙的酶的稳定性有时能够通过将钙加到洗涤剂中进行改善，但是这常常将随后破坏污溃移除效应。此外，将钙加到液体洗涤剂中可能引起制剂问题，即，洗涤剂的物理稳定性问题。发明概沭因此，提供α-淀粉酶的组合物和变体将是有益的，它们对螯合剂稳定并且优选具有保留下来的或比亲本α-淀粉酶更高的洗涤性能。因此，本发明的第一方面涉及包含亲本α-淀粉酶的变体的清洁组合物，其中所述变体包含在一个或多个选自193、195、197、198、200、203、206、210、212、213和243的位点上的取代，所述位点使用根据SEQ ID NO :6的编号；并且还包含清洁助剂以及任选的至少一种螯合剂，其中当在21°C和pH 8. O下测量时，所述螯合剂在低于IOmM的浓度下能够将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至O. 10mM。在另一方面，本发明涉及包含亲本α-淀粉酶的变体的清洁组合物，其中所述α -淀粉酶的变体包含与SEQ ID NO 6至少70%相同的氨基酸序列；并且还包含在一个或多个选自193、195、197、198、200、203、206、210、212、213和243的位点上的取代，所述位点
使用根据SEQ ID NO :6的编号，并且还包含清洁助剂以及任选地还包含至少一种螯合剂，其中当在21°C和pH 8. O下测量时，所述螯合剂在低于IOmM的浓度下能够将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至O. IOmM ;和清洁助剂。另一方面涉及包含亲本α-淀粉酶的变体的清洁组合物，其中所述变体包含在一个或多个选自193、195、197、198、200、203、206、210、212、213和243的位点上的取代，所述位点使用根据SEQ ID NO :6的编号，并且还包含清洁助剂以及任选的至少一种螯合剂，其中当在21°C和pH 8. O下测量时，在下述浓度下，所述螯合剂能够将游离钙离子的浓度从
2.OmM降低至O. IOmM,所述浓度小于能够将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至O. IOmM的柠檬酸盐浓度的O. 9倍；和清洁助剂。在一个优选的方面，本发明涉及包含亲本α-淀粉酶的变体的清洁组合物，其中所述变体包含在一个或多个对应于选自195、197、198、200、203、206、210、212、213、243的 位点上的改变，并且还包含在一个或多个对应于选自116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447、458 的位点上的改
变，其中(a)所述改变独立地为(i)紧接所述位点下游并邻近所述位点的氨基酸的插入，(ii)占据所述位点的氨基酸的缺失，和/或(iii)占据所述位点的氨基酸的取代，(b)所述变体具有α -淀粉酶活性；并且(c)每个位点对应于具有氨基酸序列SEQ ID NO 6的酶的氨基酸序列的位点。在另一方面，本发明涉及包含亲本α-淀粉酶的变体的清洁组合物，其中所述变体包含在氨基酸区域181、182、183、或184中的至少一个、至少两个、或至少三个缺失，并且还包含在一个或多个选自195、197、198、200、203、206、210、212、213、243的位点上的改变，并且还包含在一个或多个选自 116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447、458 的位点上的改变，其中(a)所述改变独立地为(i)紧接所述位点下游并邻近所述位点的氨基酸的插入，(ii)占据所述位点的氨基酸的缺失，和/或(iii)占据所述位点的氨基酸的取代，(b)所述变体具有α -淀粉酶活性；并且(c)每个位点对应于具有氨基酸序列SEQ ID NO 6的酶的氨基酸序列的位点。发明详述定义α -淀粉酶(α -1，4-葡聚糖_4_葡聚糖水解酶，Ε. C. 3. 2. I. I)构成一组酶，它们催化淀粉与其它直链和支链1，4-葡糖苷低聚-和多糖的水解。已知α -淀粉酶来源于广泛选择的生物，包括细菌如来自芽孢杆菌属例如地衣芽孢杆菌的菌种；来自真菌如米曲霉(Aspergillus oryzae) (TAKA-淀粉酶)或黑曲霉(Aspergillus niger)的菌种；来自植物如大麦的物种以及来自哺乳动物的物种。
野生型酶术语“野生型” α-淀粉酶指由天然存在的微生物例如天然存在的细菌、酵母或丝状真菌表达的α-淀粉酶。当亲本酶不是变体酶时，术语“野生型酶”和“亲本酶”可互换使用。变体酶本文将术语“变体”定义为具有α-淀粉酶活性的多肽，其包含在亲本或野生型α-淀粉酶的特定位点上一个或多个(或一个或若干个)氨基酸残基的改变如取代、插入、和/或缺失。优选小于50个修改形式，更优选小于30个修改形式。经由人工干预，通过修饰亲本α-淀粉酶获得改变的α-淀粉酶。亲本酶如本文所用，术语“亲本” α-淀粉酶指进行修饰以产生本发明的变体α-淀粉酶的α-淀粉酶。这个术语也指与本发明的变体进行比较的多肽。亲本可为天然存在的(野生型)多肽，或它甚至可为其通过任何合适方法制备的变体。例如，亲本蛋白可为天然存在的多肽的变体，所述多肽的氨基酸序列已经被修饰或改变。因此，亲本α-淀粉酶可具有一个或多个(或一个或若干个)氨基酸取代、插入、和/或缺失。因此，亲本α-淀 粉酶可为亲本α_淀粉酶的变体。亲本也可为等位变体，它是由占据相同染色体座位的基因的两个或更多个供选择的替代形式中的任何一个编码的多肽。改善的特性本文将术语“改善的特性”定义为与变体相关联的特性，所述变体与亲本ct -淀粉酶相比具有改善的特性。此类改善的特性包括但不限于例如当在EnzChek测定或PNP-G7测定中测量时提高的淀粉分解活性(如本文实施例部分所述)、提高的洗涤性能如去垢性能(例如对包含淀粉的污垢的去垢性能)、去污效果、抗变灰性能、稳定性如热稳定性、pH稳定性、或在包括螯合剂在内的助洗剂存在下的稳定性、在粉末、液体或凝胶洗涤剂或盘碟洗涤组合物中的稳定性、改变的温度依赖性能和活性特征、PH活性、底物特异性、产物特异性和化学稳定性。洗涤性能和/或盘碟洗涤性能可如下所述，按照本专利申请的“材料和方法”进行测量。优选地，本发明的变体包括改善特性的组合如改善的稳定性、改善的洗涤性能、改善的盘碟洗涤性能和/或在洗涤剂中改善的活性。改善的稳定性包括在浓缩洗涤剂产品中在贮藏期间的稳定性和在稀释洗涤剂中在洗涤期间的稳定性。改善的特性包括在低温下改善的洗涤或盘碟洗涤性能。在本文上下文中的术语“活性”是在特定条件下，通过每单位时间和每单位酶蛋白在包含三个或更多个1，4-α-连接的D-葡萄糖单位的多糖(例如淀粉)中水解1，4- a -D-糖苷键数量测得的淀粉水解活性，例如在特定条件下每mL酶样品的每g酶蛋白获得的活性。活性可如下所述，按照“材料和方法”在例如EnzChek测定或PNP-G7测定中进行测量。本专利申请中术语“活性”与“淀粉水解活性”互换使用。术语“比活性”常用于描述获得的每mL(或g)酶蛋白的最大活性。改善的化学稳定性本文将术语“改善的化学稳定性”定义为在存在化学制品的情况下孵育一段时间后显示保留酶活性的变体酶，所述化学制品是天然存在的或合成的，它们减少亲本酶的酶活性。改善的化学稳定性也可使变体能够在存在此类化学品的情况下更好地催化反应。在本发明的一个特定方面，改善的化学稳定性是在洗涤剂、具体地讲在液体洗涤剂中的改善的化学稳定性。改善的洗涤剂稳定性具体讲是当将本发明的α-淀粉酶的变体混合到包含螯合剂的液体洗涤剂制剂中时改善的α-淀粉酶活性稳定性，所述液体也包括凝胶或糊剂。液体洗涤剂制剂可指在衣物洗涤或自动盘碟洗涤过程中加入的浓缩洗涤剂或稀释洗涤剂如洗涤溶液，即，其中加入浓缩洗涤剂的水溶液。
在本发明中液体洗涤剂用作液体衣物洗涤剂特别有效。稳定性术语“稳定性”包括贮存稳定性和在使用期间(例如在洗涤过程期间)的稳定性并反映淀粉酶根据时间的稳定性，例如当将淀粉酶保留在溶液(具体地讲洗涤剂溶液)中时保留多少活性。例如α-淀粉酶的变体在31°C下，18小时后可具有超过70%的残余活性(即，多少活性被保留)。稳定性受多个因素的影响，例如pH、温度、洗涤剂组合物如助洗剂、表面活性剂等的量和类型。使用如“方法和材料”部分所述的EnzCheck测定或PNP-G7测定测量淀粉酶稳定性。改善的稳定性本文将术语“改善的稳定性”定义为变体酶展示出比亲本α -淀粉酶提高的稳定性，例如当如“方法和材料”部分所述以EnzCheck测定测量时，在(I. 5w/v)DTPA的存在下，在31 °C，pH 8下，18小时后具有超过70%的残余活性或相对于亲本具有至少IOpp的残余活性改善。如“方法和材料”部分所述，以亲本残余活性和变体残余活性之间的差值计算变体相对于亲本的残余活性改善百分点(PP)。助洗剂助洗剂可根据M. K. Nagarajan等人，JAOCS,第61卷,9(1984年9月)， 第1475-1478页所述的测试方法进行分类，所述方法用于测定将溶液中pH 8的水硬度从
2.OmM(CaCO3)降低至O. IOmM所需的最低助洗剂含量。所述助洗剂可尤其是与钙和镁离子形成水溶性络合物的螯合剂。螯合剂是与某些金属离子形成分子、钝化所述离子以便它们不能与其它元素反应的化学物质，因此，粘合剂通过形成螯合物抑制化学活性。螯合是在配体和单个中心原子之间形成或存在两个或更多个单独的结合。所述配体可为任何有机化合物、硅酸盐或磷酸盐。在本发明上下文中术语“螯合剂”包括螯合剂、络合剂、或多价螯合剂，它们与金属离子如钙和镁形成水溶性络合物。螯合效应描述了螯合配体对金属离子的亲和力比相似的非螯合配体集合对相同金属的亲和力更强。螯合剂具有与金属离子，具体地讲钙(Ca2+)离子的结合能力，并且已经将其广泛用于洗涤剂和组合物(一般来讲，用于洗涤如衣物洗涤或盘碟洗涤)。然而螯合剂已经显示它们自身抑制酶活性。在本专利申请中术语螯合剂与“络合剂”或“螯合试剂”互换使用。因为大多数α -淀粉酶是钙敏感的，这些螯合剂的存在可减弱酶活性。α -淀粉酶的钙敏感性可通过在强螯合剂的存在下孵育给定α-淀粉酶并分析这种孵育对所讨论的α-淀粉酶活性的影响进行测定。钙敏感性α-淀粉酶将在孵育期间失去大部分或全部活性。表征螯合剂如上文所提到的，螯合物效应或螯合效应描述了螯合配体对金属离子的亲和力比相似的非螯合配体集合对相同金属的亲和力更强。然而，这种螯合效应的强度可通过多种类型的测定或测量方法进行测定，从而根据它们的螯合效应(或强度)区分螯合剂或给它们分级。在优选的测定中，可通过螯合剂在pH 8. O下将游离钙离子(Ca2+)的浓度从2. OmM降低至O. IOmM或更低的能力表征它们,例如通过使用根据M. K. Nagarajan等人，JA0CS,第61卷,9 (1984年9月)，第1475-1478页所述的方法进行测试。使用Nagarajan等人的方法表征螯合剂的实例在实施例2a中进行了描述。优选地，当在pH 8.0，21°C下测量时，根据本发明的螯合剂包括下列螯合剂，所述螯合剂在低于10mM，优选低于9. 5mM，优选低于9mM，优选低于8. 5mM,优选低于8mM,优选低于7. 5mM,优选低于7mM,优选低于6. 5mM,优选低于6mM,优选低于5. 5mM,优选地,优选低于5mM,优选低于4. 5mM,低于4mM,优选低于3. 5mM,优选低于3mM,优选低于2. 5mM,优选低于2mM,优选低于I. 5mM或优选低于ImM的浓度下能够将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至O. ImM或更低。优选地，当在pH 8，21°C下，在80mM的氯化钾和49mM的EPPS((4-(2-羟乙基)哌嗪-I-丙磺酸))中测量时，根据本发明的螯合剂包括下列螯合剂，所述螯合剂在低于IOmM,优选低于9. 5mM,优选低于9mM，优选低于8. 5mM,优选低于8mM，优选低于7. 5mM,优选低于7mM,优选低于6. 5mM,优选低于6mM,优选低于5. 5mM,优选地,优选低于5mM,优选低于
4.5mM,低于4mM，优选低于3. 5mM,优选低于3mM，优选低于2. 5mM,优选低于2mM，优选低于
1.5mM或优选低于ImM的浓度下能够将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至O. ImM。在一个尤其优选的实施方案中，如“材料和方法”部分所述，当在pH 8，21°C下，在80mM的氯化钾和49mM的EPPS中并使用用于测定游离钙离子的浓度的钙离子选择性电极测量时，所述螯 合剂能够将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至O. ImM。因此优选地，如“材料和方法”部分所述，当在pH 8. 0，21°C下测量时，所述螯合剂包括下列螯合剂，所述螯合剂在低于10mM，优选低于9. 5mM,优选低于9. OmM,优选低于8. 5mM,优选低于8. OmM,优选低于7. 5mM,优选低于7. OmM,优选低于6. 5mM,优选低于6. OmM,优选低于5. 5mM,优选地，优选低于5. OmM,优选低于4. 5mM,低于4. OmM,优选低于3. 5mM,优选低于3. OmM,优选低于2. 5mM,优选低于
2.OmM,优选低于I. 5mM或优选低于I. OmM的浓度下能够将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至 O. IOmM0在一个尤其优选的实施方案中，当在pH 8和21°C下，在80mM的氯化钾和49mM的EPPS中测量时，所述螯合剂在9mM至O. 5mM,优选9mM至ImM，优选8mM至ImM，优选7mM至ImM,优选6mM至ImM,优选5mM至ImM,优选4mM至ImM,优选3mM至ImM,优选2mM至ImM,优选 9. OmM 至 I. 5mM,优选 8. OmM 至 I. 5mM,优选 7. OmM 至 I. 5mM,优选 6. OmM 至 I. 5mM,优选
5.OmM 至 I. 5mM,优选 4. OmM 至 I. 5mM,优选 3. O 至 I. 5mM,优选 2. 5mM 至 I. OmM,优选 2. OmM至I. ImM，优选I. 85mM至I. OmM的浓度下能够将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至O. 10mM。游离钙离子的浓度从2. OmM的Ca2+降低至O. IOmM对应于水硬度从200ppm(在酸性CO2的存在下，CaCO3为Ca(HCO3)2形式)降低至lOppm。最低助洗剂含量根据螯合剂钠盐并基于100%干燥螯合剂计算。螯合剂的螯合效应也可相对于柠檬酸盐进行测量。给能够将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至O. IOmM的柠檬酸盐浓度赋值为I并且将螯合剂的结果与该值比较。当在PH 8. O和21°C下测量时，在下述浓度下，根据本发明的优选的螯合剂能够将游离钙的浓度从2. OmM降低至O. 10mM，所述浓度低于柠檬酸盐浓度的O. 9倍，例如低于O. 8倍，例如低于O. 7倍，例如低于O. 6倍，例如低于O. 5倍，例如低于O. 4倍，例如低于O. 3倍，例如低于O. 2倍，例如低于O. I倍。当在pH 8. 0，21°C下使用用于测定游离钙离子的浓度的钙离子选择性电极测量时，当在PH 8. O和21°C下，在80mM的氯化钾和49mM的EPPS中测量时，在下述浓度下，根据本发明的优选的螯合剂能够将游离钙的浓度从2. OmM降低至O. 10mM，所述浓度低于柠檬酸盐浓度的O. 9倍，例如低于O. 8倍，例如低于O. 7倍，例如低于O. 6倍，例如低于
O.5倍，例如低于O. 4倍，例如低于O. 3倍，例如低于O. 2倍，例如低于O. I倍。在一个尤其优选的实施方案中，当在pH 8. O和21°C下测量时，在下述浓度下，所述螯合剂能够将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至O. 10mM，所述浓度低于能够将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至O. IOmM的柠檬酸盐浓度的I. O倍至O. I倍，例如低于O. 9倍至O. I倍，例如低于O. 8倍至O. I倍，例如低于O. 7倍至O. I倍，例如低于O. 6倍至O. I倍，例如低于O. 5倍至O. I倍，例如低于O. 4倍至O. I倍，例如低于O. 35倍至O. I倍，例如低于O. 3倍至O. I倍。本发明的另一个实施方案涉及包含亲本α -淀粉酶的变体的清洁组合物，其中所述变体α -淀粉酶包含在一个或多个选自193、195、197、198、200、203、206、210、212和213的位点上的取代，所述位点使用根据SEQ ID NO :6的编号，并且还包含至少一种螯合剂，其中当在21°C和pH 8. O下测量时，所述螯合剂在低于IOmM的浓度下能够将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至O. IOmM ;和清洁助剂，在本发明的一个优选的实施方案中，所述清洁组合物包含亲本α-淀粉酶的变体，其中所述变体包含在一个或多个在193至213的范围内的位点上的取代,所述位点使用根据SEQ ID NO :6的编号，并且还包含至少一种螯合剂，其中当在21°C和pH 8下测量时，在下述浓度下，所述螯合剂能够将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至O. 10mM，所述浓度小于能够将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至O. IOmM的柠檬酸盐浓度的O. 9倍；和清洁助剂。本发明的另一个实施方案涉及包含亲本α -淀粉酶的变体的清洁组合物，其中所述变体α -淀粉酶包含与SEQ ID NO 6至少70%相同的氨基酸序列，并且还包含在一个或多个选自193、195、197、198、200、203、206、210、212和213的位点上的取代，所述位点使用根据SEQ ID NO :6的编号，并且还包含至少一种螯合剂，其中当在21°C和pH 8. O下测量时，所述螯合剂在低于IOmM的浓度下能够将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至O. 10mM。因此，根据本发明的螯合剂能够将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至O. 10mM，所述螯合剂的浓度比在相同条件下将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至O. IOmM所需的柠檬酸盐浓度更低。作为另外一种选择，将螯合剂和金属离子如钙和/或镁离子形成的络合物的强度表达为log K值(平衡或结合或分离或稳定常数)。这个常数可在给定pH、给定稳定和给定离子强度下测量。如上文所提到的那样，将螯合剂和金属离子如钙和/或镁离子形成的络合物的强度表达为log K值(平衡或结合或分离或稳定常数)，该常数可通过等温滴定微量热法(isothermal titration calorimetry, ITC),如 A. Nielsen 等人，Anal. Biochem.,第 314卷，(2003)，第227-234页所述进行测量，并且根据K值，可将log K计算为K值的对数(底数10)。通过这种方法测得的log K值将取决于温度、pH、离子强度而不同，因此，当比较log K值时，在相似、优选在相同条件下测定它们是重要的。此外，通过导入标准物如柠檬酸盐作为基准，可减少实验中变量造成的影响。优选地，如本专利申请的“材料和方法”部分所述测定log K，因此，在本发明的一个实施方案中，当如“材料和方法”部分所述，在pH10和19°C下测量log K时，在根据本发明的组合物中的螯合剂具有至少3，例如至少4，例如至少5，例如至少6，例如至少7，例如至少8，例如至少9，例如至少10，例如至少11的log K。在根据本发明的组合物中的螯合剂的log K值也可在3-11的范围内，例如3-10，例如3-9，例如3-8，例如4-11，例如5-11，例如6-11，例如4-10，例如5-10，例如4-9，例如5-9，例如4-8，具体地讲5-8。优选地，在根据本发明的组合物中的螯合剂的log K值是至少1，例如至少I. 33，例如至少I. 67，例如至少2，例如至少2. 33，例如至少2. 67，例如至少3，例如至少3. 33，例如至少3. 67倍的柠檬酸盐log K的因数，所述柠檬酸盐的log K如实施例2b所述进行测定。根据本发明的组合物中的螯合剂也可在因数1-3.67的范围内，例如
1-3.33，例如 1-3. 00，例如 1-2. 67，例如 I. 33-3. 67，例如 I. 33-3. 33，例如 I. 33-3. 00，例如
I.33-2. 67，例如 I. 67-3. 67，例如 I. 67-3. 33，例如 I. 67-3，具体地讲 I. 67-2. 67 倍的柠檬酸盐log K，所述柠檬酸盐的log K如“材料和方法”部分所述进行测定。可用的螯合剂可为，但不限于下列螯合剂N-(1，2-二羧基-乙基)_D，L-天冬氨酸(105)4-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N，N- 二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二琥珀酸(IDA)、N_(2_磺甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨二乙酸郎0么)、0-丙氨酸4，^二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N，N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N，N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N，N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N，N- 二乙酸(ANDA)、对氨基苯磺酸-N、N- 二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N，N- 二乙酸(TUDA)、磺甲基-N，N-二乙酸(SMDA)、N-(羟乙基)-乙二胺三乙酸(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、氨基三亚甲基膦酸(ATMP)。优选的螯合剂可包含氨基并且可为例如氨基-聚羧酸酯或膦酸酯。它可为包含一个、两个或三个氨基(通常为仲或叔氨基)的单体分子，并且它可包含两个、三个、四个或五个羧基或甚至更多个羧基。螯合剂可包含磷或不含磷。有多个螯合剂分类方法，一个方法可为如下方法螯合剂具有或基于羧酸根基团如EDTA(乙二胺四乙酸)、NTA(2，2'，2"-次氮基三乙酸酯)、柠檬酸根(盐或酯)、2_羟基丙烷-1，2，3-三羧酸酯、DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、MGDA(甲基甘氨酸二乙酸或N，N’ -双(羧甲基)丙氨酸)、EGTA(乙二醇四乙酸)、EDDS (I，2-乙二胺-N，N’ - 二琥珀酸)、GLDA(L_谷氨酸、N，N- 二乙酸)、聚羧酸酯如PAA [聚(丙烯酸)]、PAA/PMA[共聚(丙烯酸/马来酸)]、或它们的混合物。包含磷的螯合剂可为多磷酸盐或磷酸盐，例如三聚磷酸钠(STP)、HEDP (I-羟基亚乙基-I，I-二膦酸)、EDTMP [I，2-乙二胺四(亚甲基膦酸]、EDTMPA (乙二胺四亚甲基膦酸)、DTPMP ( 二亚乙基三胺五亚甲基膦酸)、DTMPA ( 二亚乙基三胺五亚甲基膦酸)。螯合剂可包含氮如 EDTA、NTA、DTPA, PDTA, GLDA, MGDA, EDDS, EDTMP, EDTMPA,以及 DTPMP 或 ASMA、ASDA, ASMP, IDA、SMAS, SEAS、SMGL, SEGL, MIDA、a -ALDA、SEDA、ISDA、PHDA, ANDA, SLDA,TUDA, SMDA, HEDTA, DEG, ATMP、或它们的混合物。因此，优选的螯合剂可为但不限于下列螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五亚甲基膦酸(DTMPA、DTPMP)、羟基亚乙基二膦酸(HEDP)、1，2_乙二胺N，N' - 二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、丙二胺四乙酸(PDTA)、
2-羟基吡啶-N-氧化物(HPNO)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸N，N-二乙酸(N，N- 二羧甲基谷氨酸四钠盐(GLDA)和次氮基三乙酸(NTA)、或它们的混合物。所述螯合剂可以酸性形式或盐形式存在，优选地，所述螯合剂可以钠、铵或钾盐形式存在。螯合剂在所述组合物中的量可为O. 0001重量％至20重量％，优选O. 01至10重 量％，更优选O. I重量％至5重量％。亲本a -淀粉酶亲本a -淀粉酶主要可为期望由其制备在贮藏或使用期间(例如在洗涤或淀粉水解过程中)具有改善的稳定性的任何a -淀粉酶。因此，改善的稳定性可视为贮藏期间淀粉水解活性损失的降低或使用期间提高到活性和性能。已知α-淀粉酶来源于广泛选择的生物，包括细菌如来自芽孢杆菌属例如地衣芽孢杆菌的菌种；来自真菌如米曲霉(ΤΑΚΑ-淀粉酶)或黑曲霉的菌种；来自植物如大麦的物种以及来自哺乳动物的物种。亲本α-淀粉酶主要可为任何起源的任何此类α-淀粉酶。熟知的是由芽胞杆菌属产生的许多α-淀粉酶在氨基酸水平上是高度相同的。因为发现这些α-淀粉酶基本上相同，认为它们属于同一类的α-淀粉酶，称为“特妙淀粉酶样α-淀粉酶”类。因此，在本文上下文中，术语“特妙淀粉酶样α-淀粉酶”旨在指示α-淀粉酶，具体地讲芽孢杆菌属α -淀粉酶，其在氨基酸水平上表现为基本上相同，g卩，与具有如本文SEQ ID NO 20 (TermamyI )所示的氨基酸序列的地衣芽孢杆菌α -淀粉酶至少60%的同一性。特妙淀粉酶样α -淀粉酶许多已知芽孢杆菌属α -淀粉酶的同一性可见于下表I :表权利要求
1.一种清洁组合物，包含 (a)亲本a-淀粉酶的变体，其中所述变体包含在一个或多个选自195、193、197、198、·200、203、206、210、212、213和243的位点上的取代，所述位点使用根据SEQ ID NO 6的编号；和 (b)清洁助剂，优选地，其量为0.01至99.9重量％ ;以及任选的 (c)至少一种螯合剂，其中当在21°C和pH 8.0下测量时，所述螯合剂在低于IOmM的浓度下能够将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至0. 10mM。
2.如权利要求I所述的组合物，包含螯合剂，其中 (a)当在21°C和pH8. 0下，在80mM的氯化钾和49mM的EPPS中测量时，所述螯合剂在低于IOmM的浓度下能够将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至0. IOmM ;和/或 (b)当在如实施例2a所述的测定中测量时，所述螯合剂在低于IOmM的浓度下能够将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至0. IOmM ;和/或 (c)所述螯合剂在低于8mM，优选低于7mM，优选低于6mM，优选低于5mM，优选低于4mM的螯合剂浓度下能够将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至0. IOmM ;和/或 (d)当在21°C和pH8下测量时，在下述螯合剂浓度下，所述螯合剂能够将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至0. 10mM，所述螯合剂浓度低于能够将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至0. IOmM的柠檬酸盐浓度的0. 9倍；和/或 (e)在下述螯合剂浓度下，所述螯合剂能够将游离钙离子的浓度从2.OmM降低至·0.IOmM,所述螯合剂浓度低于能够将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至0. IOmM的柠檬酸盐浓度的0. 7倍，例如低于0. 5倍，例如低于0. 3倍。
3.一种清洁组合物,包含 (a)亲本a-淀粉酶的变体，其中所述变体包含在一个或多个选自195、193、197、198、200、203、206、210、212、213和243的位点上的取代，所述位点使用根据SEQ ID NO 6的编号；和 (b)清洁助剂，优选地，其量为0.01至99. 9重量以及任选的(c)至少一种螯合剂，其中当在21°C和pH 8. 0下测量时，在下述螯合剂浓度下，所述螯合剂能够将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至0. 10mM，所述螯合剂浓度低于能够将游离钙离子从2. OmM降低至·0.IOmM的柠檬酸盐浓度的0. 9倍。
4.如权利要求I或权利要求2所述的组合物，其中 (a)所述变体包含至少两个在一个或多个对应于位点195、193、197、198、200、203、·206、210、212、213或243的位点上的取代，所述位点使用根据SEQ ID NO :6的编号；和/或 (b)所述亲本a-淀粉酶序列通过下列取代中的至少一个进行修饰193为[G、A、S、T或 M];位点 195 为[F、W、Y、L、I 或 V];位点 197 为[F、W、Y、L、I 或 V];位点 198 为[Q 或N];位点 200 为[F、W、Y、L、I 或 V];位点 203 为[F、W、Y、L、I 或 V];位点 206 为[F、W、Y、N、L、I、V、H、Q、D 或 E];位点 210 为[F、W、Y、L、I 或 V];位点 212 为[F、W、Y、L、I 或 V]或位点 213 为[G、A、S、T 或 M];或 243 为[F、W、Y、L、I 或 V];和 / 或 (C)所述亲本a -淀粉酶序列通过下列取代中的至少一个进行修饰193为T ;位点195为F或Y ;位点197为F或L ;位点198为N ;位点200为F ;位点203为F ;位点206为Y ;位点210为Y ;位点212为V或位点213为A ;或位点243为F和/或所述变体还包含在氨基酸区域181、182、183、或184中的至少一个、至少两个、或至少三个缺失(使用SEQ ID NO 6用于编号);和/或 (d)所述变体包含在一个或多个对应于成熟多肽SEQID NO :6的位点193、195、197、.198、200、203、206、210、212、213的位点上的取代和在一个或多个对应于成熟多肽SEQ IDNO 6 的位点 116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、.320、339、359、418、431、434、447、458 的位点上的取代；和 / 或 (e)在螯合剂的存在下，在pH8和31°C下，18小时后，所述变体具有至少60%的残余活性，其中在21°C和pH 8.0下，所述螯合剂在低于IOmM的浓度下能够将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至0. IOmM ;和/或 (f)在螯合剂的存在下，在PH8和31°C下，18小时后，所述变体具有至少70%的残余活性，其中在21°C和pH 8.0下，所述螯合剂在低于IOmM的浓度下能够将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至0. IOmM,并且其中所述残余活性如“材料和方法”部分所述进行测量；和/或 (g)当如“材料和方法”部分所述在AMSA中测量时，所述变体与所述亲本a-淀粉酶相比具有改善的洗涤性能。
5.如任一项前述权利要求所述的组合物，其中所述螯合剂选自EDTA、MGDA、EGTA、DTPA, DTPMP, HEDP,以及它们的混合物。
6.如任一项前述权利要求所述的组合物，其中所述亲本a-淀粉酶的变体包含在一个 或多个对应于选自成熟多肽 SEQ ID NO 6 的 195、197、198、200、203、206、210、212、213、243的位点上的改变，并且还包含在一个或多个对应于选自成熟多肽SEQ ID NO :6的116、118、.129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、.434、447、458的位点上的改变；其中 (a)所述一个或多个改变独立地为 (i)紧接所述位点下游并邻近所述位点的氨基酸的插入， (ii)占据所述位点的氨基酸的缺失，和/或 (iii)占据所述位点的氨基酸的取代， (b)所述变体具有a-淀粉酶活性；并且 (c)每个位点对应于具有氨基酸序列SEQID NO 6的酶的氨基酸序列的位点。
7.如任一项前述权利要求所述的组合物，其中所述亲本a-淀粉酶的变体包含在氨基酸区域181、182、183、或184中的至少一个、至少两个、或至少三个缺失，并且还包含在一个或多个选自195、197、198、200、203、206、210、212、213、243的位点上的改变，并且还包含在一个或多个选自 116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、.303、320、339、359、418、431、434、447、458 的位点上的改变，其中 (a)所述一个或多个改变独立地为 (i)紧接所述位点下游并邻近所述位点的氨基酸的插入， (ii)占据所述位点的氨基酸的缺失，和/或 (iii)占据所述位点的氨基酸的取代， (b)所述变体具有a-淀粉酶活性；并且 (c)每个位点对应于具有氨基酸序列SEQID NO :6的酶的氨基酸序列的位点。
8.如任一项前述权利要求所述的组合物，其中在包含螯合剂的组合物中，所述变体相对于所述亲本a-淀粉酶或相对于SEQ ID N0:6具有改善的稳定性，其中在21°C和pH 8.0下，所述螯合剂在低于IOmM的浓度下能够将游离钙离子的浓度从2. OmM降低至0. 10禮，优选地，其中在螯合剂的存在下，在PH 8下，18小时后，所述变体具有至少60%的残余活性，其中在21°C和pH 8. 0下，所述螯合剂在低于IOmM的浓度下能够将游离钙离子的浓度从2.OmM降低至0. 10mM，其中所述残余活性如“材料和方法”部分所述进行测量。
9.如任一项前述权利要求所述的组合物，其中所述具有淀粉分解活性的变体具有的氨基酸序列与成熟多肽SEQ ID NO :6、8、10、12、18或20具有至少60%，更优选至少65%，更优选至少70%,更优选至少75%,更优选至少80%,更优选至少85%,甚至更优选至少90%,并且最优选至少95%的同一性。
10.如任一项前述权利要求所述的组合物，其中所述具有淀粉分解活性的亲本多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸优选在至少低严格条件下，更优选在至少中严格条件下，甚至更优选在至少中-高严格条件下，并且最优选在至少高严格条件下与下列序列杂交a)成 熟多肽编码序列SEQ ID NO :5、7、9或11、17、19 ； (ii)包含成熟多肽编码序列SEQ ID NO 5、7、9、11、17、19的基因组DNA序列；或(iii) (i)或(ii)的全长互补链。
11.如任一项前述权利要求所述的组合物，其中所述淀粉酶为亲本a-淀粉酶的变体，其中所述亲本a -淀粉酶为SEQ ID NO 6的酶，并且所述变体包含缺失D183*和G184*以及下列突变组中的一个(a)N195F+H210Y；(b)N195F+V206L、H、Y；(c)N195F+V206L+H210Y；(d)N195F+V206Y+Y243F； (e)NS18056-当我们得到突变时(f)S193T+V206L；(g)G133E+G149R+N195Y+Y203F+V206L； (h)I206L、Y； ⑴Y243F(j)N195F+V206L+Y243F ；(k)N195F ;或(1)V206F+Y243F。
12.如任一项前述权利要求所述的组合物，其中所述螯合剂选自DTPA、HEDP、MGDA、DTPMP,以及它们的混合物。
13.如任一项前述权利要求所述的组合物，其中所述清洁助剂包含以下中的一种或多种香料微胶囊、织物调色剂、蛋白酶、聚乙烯亚胺聚合物、脂肪酶、以及它们的任何混合物。
14.如任一项前述权利要求所述的组合物，其中所述组合物为液体衣物洗涤剂组合物。
15.—种衣物洗涤方法，包括优选在30°C或更低的温度下，或更优选在20°C或更低的温度下，用根据任一项前述权利要求的组合物洗涤衣服。
全文摘要
本发明涉及包含α-淀粉酶的变体的清洁组合物以及包含此类组合物的清洁方法，所述变体相对于其亲本酶对螯合剂具有改善的稳定性。
文档编号C12N9/28GK102753670SQ201180008929
公开日2012年10月24日 申请日期2011年2月10日 优先权日2010年2月10日
发明者埃斯基尔森·西格纳·拉森, 安妮特·赫勒·约翰森, 延斯·厄布罗, 弗兰克·温特·拉斯穆森, 拉尔斯·贝耶尔, 斯文·卡斯加德, 林塞·苏珊·比伊克, 米歇尔·米克, 艾伦·斯文森, 菲利普·弗兰克·苏特, 迈克尔·绍尔特, 马斯·埃斯克隆·比约恩沃德 申请人:宝洁公司