专利名称：使用乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白增加光合作用碳固定的方法
使用乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白增加光合作用碳固定的方法农作物产量受很多因素影响，其中一方面是影响植物生产生物量能力的因素(光合作用，养分和水分的吸收)，和另一方面是影响植物抵抗某些压力，例如生物压力(昆虫，真菌，病毒…)或非生物压力(干旱，盐度，营养缺乏· · ·)能力的因素。影响植物生产生物量的一个重要因子是光合作用。通过光合作用的机理，植物俘获大气二氧化碳并转化为糖，然后纳入植物组织中，从而产生生物量。光合作用是地球上所有初级生产力的最终来源。大部分植物有光合作用机理，其中叶绿体蛋白质酶RuBisCo (核酮糖-1，5_ 二磷酸羧化酶/加氧酶)是主要的获取二氧化碳和将其转化成糖的酶。那些植物属于所谓的C3植物，包括一些最重要的农作物，例如水稻、小麦、大麦、马铃薯、油菜籽。C3植物光合作用机理的一个已知问题是碳固定效率在某些环境条件下不是最佳，其中部分碳固定通过称为氧化的RuBisCo其他活性，而丧失。 RuBisCO能催化核酮糖-1，5_ 二磷酸的羧化和氧化。两种活性之间的平衡主要取决于植物对某些环境条件反应后改变的叶中co2/o2比率。每个羧化反应生成两分子磷酸甘油酸盐，进入卡尔文循环，最终形成淀粉和蔗糖并产生核酮糖-1，5-二磷酸。氧化反应生成单分子的磷酸甘油酸和磷酸乙醇酸。后者通过光呼吸作用重新循环为磷酸甘油酸(LeegoodR.C.等，1995)。每生成两分子磷酸乙醇酸，释放一分子CO2，造成碳固定的净损失，最终降低糖和生物量的生成。氨在此反应中也损失，并需要通过叶绿体中能量消耗反应重新固定。已经报道克服光呼吸作用作为提高光合作用最大效率和增加产量的目标(Zhu等，2008)，并且迄今已描述一些尝试来降低植物中碳损失并因此提高糖和生物量生产。Kebeish等报道阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)中光呼吸作用的损失可通过向叶绿体中引入光呼吸作用中间物乙醇酸分解代谢的细菌通路来缓解(WO 03/100066 ;Kebeish R.等,2007)。作者首先将大肠杆菌(Escherichia coli)乙醇酸脱氢酶酶的三个亚基靶向阿拉伯芥叶绿体，然后引入大肠杆菌乙醛酸连接酶和大肠杆菌羟基丙二酸半醛还原酶以完成此通路，与内源光呼吸通路平行转化乙醇酸成甘油酸。五个大肠杆菌基因的逐步核转化产生其中叶绿素乙醇酸直接转化为甘油酸的阿拉伯芥植物。这些转基因植物生长更快，生产更多芽和根生物量，并包括可溶性更高的糖。PCT/EP2009/059843描述水稻植物中增加生物量生产和/或种子生产和/或碳固定的方法，其中水稻植物用大肠杆菌乙醇酸脱氢酶三个亚基(glcD, glcE和glcF)转化,没有后续引入大肠杆菌乙醛酸连接酶和大肠杆菌羟基丙二酸半醛还原酶。本发明目标是使用细菌多个亚基乙醇酸脱氢酶(GDH)在农作物中的翻译融合，避免耗费时间和多个转化或多个表达盒转化的繁琐过程。细菌(glcD，glcE和glcF)亚基已经与灵活接头以不同配置融合，并在大肠杆菌GDH缺陷株中检测，显示重组GDH多个亚基融合蛋白DEFp, EFDp和FDEp有活性。性能最好的构建体已经转入烟草(Nicotiana tabacum),水稻和油菜籽植物，并且转基因植物显示明显增加的生长和提高的光合作用率。本发明涉及植物中增加生物量生产和/或种子生产和/或碳固定的方法，所述方法包括向植物细胞基因组引入编码乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白的核酸，其中所述引入所述核酸可从头表达有乙醇酸脱氢酶酶活性的合成多肽，并且其中所述一个多肽定位在所生成植物的叶绿体中。发明背景中，乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白是由对乙醇酸脱氢酶活性必须的乙醇酸脱氢酶亚基组成的一个多肽，一般在这些亚基之间有肽接头。本发明中，我们选择适于将细菌glcD,glcE和glcF结构域共价连接成多蛋白形式的重复接头序列(Gly4Ser)3，而不干扰所需属性，例如正确折叠，溶解性和⑶H活性。另外，接头不应被植物细胞质中的蛋白酶切割，使叶绿体中多蛋白可过量表达。发明背景中，生物量是由单个植物或植物生长表面积产生的物质量。可以测量几个参数以测定生物量生产的增加。这些参数的示例是植物高度，叶片的表面积，芽干重，根干重，种子数目，种子重量，种子大小…。种子生产或种子产率能在 每个单独植物或植物生长的每个表面积测量。这些参数一般在土壤生长测定期或生长特定步骤后测量，例如在植物营养生长期结束时，并且对比根据本发明转化一个或多个核酸的植物和未转化一个或多个这种核酸的植物。植物碳固定的增加能通过测量气体交换和叶绿素荧光参数来测定。一种使用LI-6400系统(力高泰公司(Li-Cor))和生产商所提供软件的便利方法描述于R. Kebeish等，2007，并通过引用纳入本文。发明方法涉及的核酸编码有乙醇酸脱氢酶酶活性的一个多肽。乙醇酸脱氢酶活性能根据Lord J. Μ. 1972测定，使用本申请实施例6所述的技术。或者，可用缺失形成活性内源乙醇酸脱氢酶的三个亚基的大肠杆菌突变体进行互补分析。这些大肠杆菌突变体不能以乙醇酸作为唯一碳来源生长。当这些缺陷型突变体内过量表达酶使得细菌恢复在含有乙醇酸作为唯一碳来源的培养基上生长时，意味着该酶编码大肠杆菌乙醇酸脱氢酶的功能等价物。互补分析的方法和方式描述于Bari等，2004，并通过引用纳入本文。编码有乙醇酸脱氢酶酶活性的一个多肽的核酸分子可以通过重组DNA技术(如PCR)或化学合成方法生产。所述核酸分子的鉴定和分离可通过使用已知乙醇酸脱氢酶核酸分子的序列，或部分序列，或在这些分子的反义互补链情况中，例如通过根据标准方法杂交(见如 Sambrook 等，1989)0用于本发明目的的乙醇酸脱氢酶可以是任何天然产生的乙醇酸脱氢酶，或其任何活性片段或其任何变体，其中一些氨基酸(优选1-20氨基酸，更优选1-10，甚至更优选1-5)被替换、添加或删除，从而该酶保留乙醇酸脱氢酶活性。根据本发明，“核酸”或“核酸分子”理解为多核苷酸分子，其可以是DNA或RNA类型，优选DNA类型，并特定是双链。其可是是天然或合成来源。合成核酸由体外生产。这些合成核酸的示例是那些本发明所述有乙醇酸脱氢酶酶活性的多肽的编码密码子已经根据要在其中表达的宿主生物体优化(例如,通过将密码子替换为这种宿主生物体或宿主生物体所属组的密码子使用表内相较原始宿主更优选或最优选的密码子)。密码子优化方法为技术人员熟知。优选乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白由细菌乙醇酸脱氢酶亚基的融合组成，更优选由大肠杆菌glc 操纵子的三个必要亚基(gi/1141710/gb/L43490. 1/EC0GLCC)的融合组成。最优选包括SEQ ID NO:2 (Glc D)，4 (Glc E)和6 (Glc F)的融合氨基酸序列的多肽，其中这些氨基酸序列可以通过接头连接。因此，包括ID NO: 1，3和5多核苷酸序列的核酸能用于操作本发明。本发明方法包括向植物细胞基因组引入编码有乙醇酸脱氢酶酶活性的乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白的核酸，其中所述多肽包括在氨基酸序列水平分别与SEQ ID N0:2、4和6有至少60、70、80或90%序列相同性的序列，特定是至少95%、97%、98%或至少99%，其中引入核酸可从头表达有乙醇酸脱氢酶酶活性的一个多肽，并且其中所述活性定位在叶绿体内。本发明方法也包括向植物细胞基因组引入编码有乙醇酸脱氢酶酶活性的乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白的核酸，其中所述核酸包括在核苷酸序列水平分别与SEQ ID NO: K3和5有至少60、70、80或90%序列相同性的序列，特定是至少95%、97%、98%或至少99%，其中引入核酸可从头表达有乙醇酸脱氢酶酶活性的至少一个多肽，并且其中所述活性定位在 叶绿体内。为了本发明目的，用百分比表示的两个相关核苷或氨基酸序列的“序列相同性”指两个最佳比对序列中，相同残基的位点数目(xlOO)除以比较位点数目。缺口，即比对中某一残基在一个序列中出现但另一个中没有，认为此比对中的位点是残基不相同的位点。两个序列的比对能通过EMBOSS (Rice等，2000)中Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch 1970)用默认设置(缺口开放罚分10，缺口延伸罚分O. 5)完成，从而在整体序列长度上找到最优比对。一旦外源DNA序列已知，能通过分子生物学技术开发特异性识别样品核酸(DNA或RNA)中这些序列的引物和探针。例如,能开发PCR方法来鉴定生物样品(例如植物样品,植物物质或包含植物物质的产物)中用于发明方法的基因(gdh基因)。这种PCR基于至少两个特异性“引物”，例如两者都识别用于本发明的gdh编码区内的序列(例如编码区SEQ IDNo. 1，，3，5)，或一个识别gdh编码区内的序列而另一个识别结合的转运肽内序列或调控区序列，例如启动子或包括本发明所用gdhDNA的嵌合基因的3’末端。优选引物有15-35核苷序列，在最优PCR条件下，特异性识别本发明所用gdh嵌合基因内的序列，从而特异片段(“整合片段”或识别扩增子)扩增自含有本发明所用gdh基因的核酸样品。这意味这只有目标整合片段，而没有植物基因组中其他序列或外源DNA在最优PCR条件下被扩增。本发明方法也包括向植物细胞基因组引入编码有乙醇酸脱氢酶酶活性的乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白的核酸，其中所述一个核酸在严谨条件下与选自SEQ ID N0:l、3和5的核苷序列杂交，其中引入核酸可从头表达一个有乙醇酸脱氢酶酶活性的多肽，并且其中所述活性定位在叶绿体内。本文所用的严谨杂交条件特别指下列条件在滤器上固定相关DNA序列，并且所述滤器在50%甲酰胺、5%SSPE、2x Denhardt试剂和O. 1%SDS中于42° C预杂交1-2小时，或在6x SSC、2xDenhardt试剂和O. 1%SDS中于68。C预杂交1-2小时。然后直接加入变性的dig (地高辛素)标记或放射性标记探针到预杂交液，并在上述合适温度下孵育16-24小时。孵育后，滤器随后在2x SSC、0. 1%SDS中室温洗涤30分钟，然后在O. 5xSSC和O. 1%SDS中于68° C洗涤两次，各30分钟。通过用光增强屏在-70° C将滤器接触X射线胶片(Kodak (柯达)XAR-2或等同物)24-48小时来完成放射自显影。当然，等同条件和参数能用于此方法，同时仍保留所需严谨杂交条件。本文所用的术语DNA或蛋白“包含”特定序列X，指包括或包含至少序列X的DNA或蛋白，从而其他核苷或氨基酸序列能包括在5’(或N末端)和/或3’(或C末端)末端，例如(核苷序列编码)选择性标记蛋白，(核苷序列编码)转运肽，和/或5’前导序列或3’尾随序列。相似地，在本申请正文和权利要求中使用术语“包含”，“包括”或“含有”应理解为表明涵盖规定的整体或步骤或者整体或步骤的组，但不排除其他任何整体或步骤或者整体或步骤的组。本发明方法包括在叶绿体内设置乙醇酸脱氢酶酶活性。这能通过向植物细胞核基因组中引入编码乙醇酸脱氢酶活性的核酸完成，然后编码蛋白序列融合编码叶绿体转运肽的序列来完成。或者，乙醇酸脱氢酶活性能通过用编码相应酶的核酸直接转化叶绿体基因组完成。能使用转化植物细胞或植物组织的一般技术。一系列方法包括用连接DNA序列的粒子轰击细胞，原生质体或组织。作为转入植物手段的另一系列方法包括用插入到根癌农 根菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒或毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)Ri质粒的嵌合基因。可使用其他方法，例如微注射或电穿孔或其他使用PEG的直接沉淀。技术人员能选择任何转化植物细胞或植物的合适方法和方式。为了如本发明所需在植物细胞中表达编码有酶活性多肽的核酸，能使用任何合适调控序列。调控序列会提供转录和翻译起始和终止区，其中转录起始可以是组成型或诱导型。编码区域可操作连接于这种调控序列。合适调控序列代表是组成型35S启动子。或者，能使用组成型泛素启动子，特定是玉米泛素启动子(GenBank:gi 19700915)。诱导型启动子示例是RUBISC0小亚基的光诱导启动子和“捕光复合物结合蛋白(lhcb)”启动子。有利地，可以使用包括G0S2基因5’ UTR和内含子的水稻(Oryza sativa) gos2基因的启动子区域(de Pater等，1992),水稻核酮糖-1，5_ 二磷酸羧化酶小亚基的启动子区域(KyozukaJ.等，1993)，或水稻肌动蛋白I基因的启动子区域(McElroy D.等，1990)。本发明中，也可联用启动子与位于启动子与编码序列之间的其它调控序列，如转录激活子(“增强子”)，例如专利申请WO 87/07644所述的烟草花叶病毒(TMV)的翻译激活因子，或例如Carrington和Freed 1990描述的烟草腐蚀病毒(TEV)的翻译激活子，或内含子，如玉米adhl内含子或水稻肌动蛋白的内含子I。作为调节终止子或聚腺苷酸化序列，可使用任何细菌来源的相应序列，例如根癌农根菌的nos中止子，病毒来源的相应序列，例如CaMV 35S终止子，或植物来源的相应序列，例如在申请EP 0633317描述的组蛋白终止子。在本发明优选核基因组转化的一个特定实施方式中，编码叶绿体转运肽的核酸用于编码乙醇酸脱氢酶核酸序列的5’，此转运肽序列置于启动子区域和编码乙醇酸脱氢酶的核酸之间以表达转运肽/乙醇酸脱氢酶融合蛋白。转运肽可指导乙醇酸脱氢酶进入质体，更特定是叶绿体，当稍后进入质体时，融合蛋白在转运肽和乙醇酸脱氢酶之间被切割。转运肽可是单个肽，例如EPSPS转运肽(描述于美国专利5，188，642)或植物核酮糖二羧化酶/加氧酶小亚基(RuBisCO ssu)转运肽,例如获自马铃薯(Solanum tuberosum)核酮糖1，5-二磷酸羧化酶的叶绿体转运肽(GenBank :基因gi21562，编码蛋白G68077，氨基酸1_58)，其中适当包括成熟RuBisCO ssu的N末端部分的一些氨基酸(EP 189707)，或马铃薯rbcSl基因(gi21562)的叶绿体靶向肽。转运肽可以是完整天然产生(野生型)转运肽，其功能片段，其功能突变体。也可以是嵌合转运肽，其中至少两个转运肽互相连接或其中不同转运肽部分以功能形式互相连接。这种嵌合转运肽的一个示例包括向日葵RuBisCO ssu的转运肽融合到玉米RuBisCO ssu的N末端部分，融合玉米RuBisCO ssu的转运肽,如专利EP 508909所述。或者，多肽可以使用叶绿体基因组转化直接在叶绿体内表达。整合感兴趣核酸到叶绿体基因组的方法为本领域已知，特定是基于同源重组机理的方法。合适载体和选择系统为本领域技术人员已知。多肽编码序列可以转入单独载体或构建体中，其中单独开放阅读框可以融合到一个或几个多顺反子RNA，核糖体结合位点加入到每一个单独开放阅读框前面以允许独立翻译。能用于这种整合入叶绿体基因组的方式和方法的示例在例如W006/108830中给出，其内容在此通过引入纳入。当核酸直接整合到叶绿体基因组时，不需要转运肽序列。该情况中，翻译起始密码
子(Met)可以加入到编码成熟蛋白序列以确保翻译起始。本发明的主题也是编码乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白的核酸。在一个特定实施方式中，发明的核酸编码乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白，包括将所述蛋白靶向叶绿体的氨基酸序列。在另一个特定实施方式中，发明的核酸编码乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白，其是细菌乙醇酸脱氢酶亚基的融合。在另一个特定实施方式中，发明的核酸编码乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白，是大肠杆菌glc操纵子编码的三个亚基的融合。在另一个特定实施方式中，发明的核酸编码乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白，包括分别与序列SEQ ID NO 2、4和6有至少60%序列相同性的氨基酸序列。在另一个特定实施方式中，发明的核酸编码乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白，包括分别与多核苷酸序列SEQ ID NO 1、3和5有至少60%序列相同性的多核苷酸序列。本发明主题也是植物细胞，植物组织，植物和部分或其种子，包括编码乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白的一个核酸并在叶绿体内表达有乙醇酸脱氢酶酶活性的一个多肽。上面描述引入植物细胞，植物组织，植物和部分或其种子的核酸的特定实施方式。本发明也涉及包含转化细胞的植物，特定是从转化细胞中再生的植物。再生能从任何合适方法得到。可引用下列专利和专利应用，特定涉及转化植物细胞和使植物再生的方法US4, 459，355，US4, 536，475，US5, 464，763，US5, 177，010，US5, 187，073，EP267，159，EP 604662，EP 672752，US4, 945，050，US5, 036，006，US5, 100，792，US5, 371，014，US5, 478，744，US5, 179，022，US5, 565，346，US5, 484，956，US5, 508，468，US5, 538，877，US5, 554，798，US5, 489，520，US5, 510，318，US5, 204，253，US5, 405，765，EP442174, EP486233, EP 486234, EP 539563, EP 674725, WO 91/02071 和 WO 95/06128。本方面也涉及通过培养和/或杂交上述再生植物获得的转化植物或其部分，并且涉及转化植物的种子，其特征为包括发明所述的转化植物细胞。在发明的一个特定实施方式中，转化植物或其部分选自水稻，小麦，大麦，马铃薯，油菜籽，烟草。在发明的一个特定实施方式中，转基因种子和从其所得的粗粉，油或食物，来自水稻，小麦，大麦，油菜籽或烟草植物。本发明也涉及通过加工本发明的植物、其部分或种子获得的任何产品如粗粉。例如，发明包括根据发明加工种子所得的颗粒，和由进一步加工种子或谷粒所得的粗粉，以及得自所述粗粉的任何食品。序列表SEQ ID NO: I :大肠杆菌 gel D DNA 序列SEQ ID NO:2 SEQ ID NO I编码的氨基酸序列SEQ ID N0:3:大肠杆菌 gel E DNA 序列SEQ ID NO:4 SEQ ID NO 3编码的氨基酸序列SEQ ID N0:5:大肠杆菌 gel F DNA 序列SEQ ID NO:6 SEQ ID NO 5编码的氨基酸序列附I :合成多亚基融合盒的设计。glcD，glcE和glcF:编码⑶H亚基D，E和F的细菌基因。I =(Gly4Ser)3接头。T :His6标签。箭头肠激酶切割位点。标出所引入限制位点。图2 :转基因和非转基因系的生长参数。A :叶绿体中生产DEFp的4周龄转基因Ttl植物的表型。B :7周龄烟草植物的叶面积。DEFp (n=6)，EFDp (n=5), FDEp (n=4) C :非转基因烟草(N. tabacum cv. Petit Havana) SRl 植物(n=6)。实施例I :合成多亚基基因构建体的设计细菌编码GDH的D, E和F亚基的glcD, glcE和glcF cDNA与编码(Gly4Ser) 3基序的灵活接头融合成多亚基基因构建体(图I)。引入图I所示限制位点可使glcD，glcE和glcF亚基重排，并且将多亚基盒亚克隆到细菌和植物表达载体中。另外，引入内部限制位点(Pstl/Sall和Ncol/Xhol)以促进将(Gly4Ser) 3接头换成其他灵活接头.另外，两个基因融合盒的产生可以通过Sall/Xhol限制位点删除中间位置的cDNA。引入C末端His6标签以保证检测和纯化重组蛋白。为避免His6标签对多亚基⑶H酶酶活性的可能干扰，在His6标签上游添加肠激酶切割位点，从而去除C末端标签。实施例2 :多亚基融合盒的合成。设计含有采用三种不同glcD-glcE-glcF、glcE-glcF-glcD 和 glcF-glcD-glcE 排列方式的三个细菌亚基cDNA的三个多亚基融合盒，并且合成分别编码DEFp、EFDp和FDEp相应多肽的合成基因。合成前，根据欧洲油菜(Brassica napus)密码子使用，合成基因就最大表达产率进行密码子优化。另外，根据遗传算法，合成基因同时就一大组竞争参数进行优化，例如mRNA 二级结构，隐蔽剪接位点，密码子和基序重复，和同源GC含量。实施例3 :缺失形成活性内源乙醇酸脱氢酶的三个亚基的大肠杆菌突变体的互补分析。为测定DEFp、EFDp和FDEp是否能互补大肠杆菌乙醇酸氧化酶突变体，互补分析用glc操纵子glcD亚基中有转座子插入并不能在乙醇酸作为唯一碳源情况下生长的大肠杆菌突变体JA155完成。在此突变体中过量表达DEFp，EFDp和FDEp使细菌恢复在包括乙醇酸作为唯一碳源的培养基上生长，表明所有三个多蛋白在体内有功能，并能补充活性EcGO酶的glcD亚基。实施例4 :将DEFp，EFDp和FDEp cDNA亚克隆到植物表达载体为检测烟草(N.tabacum cv. Petit Havana) SRl 植物中细菌多亚基 DEFp、EFDp 和FDEp多蛋白对⑶H活性和生物量产生的体内效果，将编码DEFp、EFDp和FDEp的cDNA插入到能使重组蛋白靶向植物细胞叶绿体的植物表达载体上。CaMV 35S启动子与重复增强子区域驱动转基因表达。合成的DEFp cDNA最初用CaMV 35S终止子上游的EcoRI和XbaI限制位点插入pTRAkc穿梭载体，生成pTRA-nptll-DEFp质粒。pTRA质粒包括烟草RB7基因(gi3522871)的骨架附着区和PPCV002的nptll盒(Konz和Schell，1986)，以用卡那霉素选择转基因植物(图2)。随后，组成型双增强的CaMV 35S启动子，查尔酮合成酶基因的5'未翻译区域和马铃薯rbcSl基因叶绿体靶向肽序列通过PCR使用pTRAkc-rbcsl-cTP质粒作为模板来扩增。然后，所扩增PCR片段使用AscI和AatII限制位点亚克隆到pTRA-nptII_DEF。 用类似方式克隆EFDp和FDEp cDNA到植物表达载体。设计三个最终构建体，分别是pTRA-35S-rbcs-cTP:DEFp，pTRA-35S-rbcs-cTP: EFDp 和 pTRA-35S-rbcs_cTP:FDEp。实施例5 :烟草植物的转化和再生植物表达载体使用Gene Pulser II电穿孔系统(美国加利福尼亚州赫告斯的伯乐公司(BioRad))根据生产商说明引入根癌农根菌GV3101细胞。为研究稳定转化烟草植物(N. tabacum cv. Petit Havana SRl)中DEFp、EFDp和FDEp的积累效果，使用卡那霉素作为选择标记通过重组根癌农根菌的叶盘转化来产生转基因Ttl植物。所产生的植物在DE73标准土壤中温室培养，有16小时自然光光周期和22° C日间/20° C夜间温度。分别通过多重PCR和免疫印迹分析筛选多至33个转基因Ttl植物中是否出现转基因和重组蛋白。33-48%的检测系在期望分子量142kDa分别生成DEFp，EFDp或FDEp。7个显示最高水平重组蛋白(总可溶性蛋白的O. 03-0. 09%)的Ttl系用于建立T1代。实施例6 :叶绿体分离和酶分析完整叶绿体使用KlefTmann等2007所述的方法分离。这种制备不会污染过氧化氢酶和延胡索酸酶活性(>95%纯度)。乙醇酸脱氢酶活性如Lord J. Μ.，1972所述检测。将100 μ g叶绿体蛋白提取物加入 100 μ mo I 磷酸钾(pH 8. 0),0. 2 μ mo I DCIP、0. Iml 1% (w/v) PMS 和 10 μ mo I 乙醇酸钾，终体积是2. 4ml。通过以固定时间间隔加入O. Iml 12M HCl来终止各分析。静置10分钟后，加入O. 5ml O. IM苯肼HCl。混合物再静置10分钟，然后在324nm检测由乙醛酸苯腙形成而引起的消光。实施例7 :从叶绿体提取物的经标记乙醇酸中释放CO2加入I μ Ci [I, 2_14C]_乙醇酸(哈脱曼(Hartmann)分析)到紧闭的15_ml反应管的50 μ g叶绿体蛋白提取物中。释放的CO2在包括连接在15-ml试管内壁O. 5M NaOH的500-μ I反应管中吸附。样品孵育5小时，并且反应管的气相通常用注射器混合。实施例8 :表达大肠杆菌⑶H的植物表型评价根据下式通过叶面积检测监控生成叶绿体中DEFp、EFDp或FDEp重组蛋白的转基因植物的生长
权利要求
1.一种增加植物中生物量生成和/或种子生产和/或碳固定的方法，所述方法包括向植物细胞基因组引入编码乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白的核酸，其中所述引入所述核酸可从头表达有乙醇酸脱氢酶酶活性的一个多肽，并且其中所述多肽定位在所产生植物的叶绿体中。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述引入所述一个核酸在植物细胞核基因组内完成，其中所述一个核酸编码的一个多肽包括将多肽靶向叶绿体的氨基酸片段。
3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白由细菌乙醇酸脱氢酶亚基的融合组成。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白由大肠杆菌glc操纵子所编码三个亚基的融合组成。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述乙醇酸脱氢酶多亚基融合 蛋白包括分别与序列SEQ ID NO 2，4和6有至少60%序列相同性的氨基酸序列。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述编码乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白的核酸包括分别与多核苷酸序列SEQ ID NO 1，3和5有至少60%序列相同性的多核苷酸序列。
7.—种编码乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白的核酸。
8.如权利要求7所述的核酸，其特征在于，所述乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白包括将所述蛋白靶向叶绿体的氨基酸序列。
9.如权利要求7或8中任一项所述的核酸，其特征在于，所述乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白由细菌乙醇酸脱氢酶亚基的融合组成。
10.如权利要求7-9中任一项所述的核酸，其特征在于，所述乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白由大肠杆菌glc操纵子所编码三个亚基的融合组成。
11.如权利要求7-10中任一项所述的核酸，其特征在于，所述乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白包括分别与序列SEQ ID NO 2，4和6有至少60%序列相同性的氨基酸序列。
12.如权利要求7-11中任一项所述的核酸，其特征在于，所述编码乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白的核酸包括分别与多核苷酸序列SEQ ID NOl, 3和5有至少60%序列相同性的多核苷酸序列。
13.一种包含乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白编码核酸的转基因植物细胞。
14.如权利要求13所述的转基因植物细胞，其特征在于，所述乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白包括将所述蛋白靶向叶绿体的氨基酸序列。
15.如权利要求13-14中任一项所述的转基因植物细胞，其特征在于，所述乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白由细菌乙醇酸脱氢酶亚基的融合组成。
16.如权利要求13-15中任一项所述的转基因植物细胞，其特征在于，所述乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白由大肠杆菌glc操纵子所编码三个亚基的融合组成。
17.如权利要求13-16中任一项所述的转基因植物细胞，其特征在于，所述乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白包括分别与序列SEQ ID NO 2，4和6有至少60%序列相同性的氨基酸序列。
18.如权利要求13-17中任一项所述的转基因植物细胞，其特征在于，所述编码乙醇酸脱氢酶多亚基融合蛋白的核酸包括分别与多核苷酸序列SEQ ID NO 1，3和5有至少60%序列相同性的多核苷酸序列。
19.一种转基因植物和其部分，所述转基因植物和其部分包括如权利要求13-18中任一项所述的转基因植物细胞。
20.如权利要求19所述的转基因植物和其部分，其特征在于，所述转基因植物和其部分选自水稻，小麦，大麦，马铃薯，油菜籽，烟草。
21.—种转基因种子和其所得粗粉、油或食物，所述转基因种子和其所得粗粉、油或食物包括如权利要求13-18中任一项所述的转基因植物细胞。
22.如权利要求21所述转基因种子和其所得粗粉、油或食物，其特征在于，所述转基因种子和其所得粗粉、油或食物选自水稻，小麦，大麦，油菜籽，烟草。
全文摘要
本发明涉及刺激植物生长和/或提高生物量产量和/或增加植物碳固定的方法，包括将一个或多个核酸引入植物细胞、植物组织或植物，其中引入核酸造成叶绿粒内从头表达由细菌多亚基乙醇酸脱氢酶亚基翻译融合形成的一个或多个有乙醇酸脱氢酶酶活性的多肽。
文档编号C12N9/04GK102858982SQ201180008103
公开日2013年1月2日 申请日期2011年2月3日 优先权日2010年2月4日
发明者F·库扎勒, G·内尔克, C·彼得汉森尔, S·希尔贝格 申请人:拜尔农科股份公司