专利名称：用于jc病毒抗体的测定的制作方法
技术领域：
本发明涉及分析样品中JC病毒抗体的存在的方法和试剂。
背景技术：
进行性多灶性白质脑病(PML)是一种与JC病毒(JCV)接触相关的中枢神经系统 (CNS)的机会性感染，据信JC病毒是一种仅在持续性免疫抑制或免疫调节条件下在人体内致病的多瘤病毒。虽然PML的发展需要存在JCV，但认为PML风险以并未彻底了解的方式与引起病毒致病的多种病毒和宿主有关因子的会聚相关(Major, " Progressive MultifocalLeukoencephalopathy in Patients on Immunomodulatory Therapies " Annu. Rev.Med. 61 :35-47(2010) [2009年8月31日，早于印刷刊物的电子版])。所公布的报道人群中JCV感染流行的研究各种各样。该信息基于各种类型的研究，包括对病毒DNA的PCR分析和JCV抗体的检测。尽管人群中JCV流行，但即使是在有免疫抑制记录的个体中JCV感染也很少导致PML。所公布的有关JCV DNA检测的报告表明所述方法不灵敏并且在评估与JCV接触方面的用途有限，因为在JCV感染的PML患者的血浆、血清或外周血单核细胞中检测到JCVDNA的情况很少并且不一致。抗JCV抗体的检测似乎是更灵敏的JCV感染标志，然而报道的结果是变化的。在1973年，Padgett和Walker公布了使用血细胞凝集抑制(HI)测定报道 JCV 血清阳性率为 65-84% 的研究(Padgett 和 Walker, " Prevalence of antibodiesin human sera agains JC virus,an isolate from a case of progressive multifocalleukoenc印halopathy" J. Infect. Pis. 127 :467-70,1973)。后来使用 HI 测定或 ELISA 的JCV血清阳性率的报道值在33-91%之间变化。这些研究中的可变血清阳性率很可能是由于研究规模和人口统计数据的显著差异，并且可能最重要的是测定方法的差异。因此，期望实现可靠灵敏的确定JCV抗体存在的测定，其可例如用于评估个体是否已接触JCV。发明概述本发明涉及对经分析证实的灵敏的检测生物流体(例如血清或血浆)中JCV抗体存在的测的开发。因此，本发明涉及一种方法，所述方法包括从受试者获得生物样品(例如，血浆、血清、血液、尿或脑脊髓液(CSF));在适于样品中的JCV抗体与HPVLP结合的条件下使所述样品接触高度纯化的病毒样颗粒(HPVLP);检测样品中与HPVLP结合的JCV抗体的水平；和使检测水平与参考相关联，使得所述参考被选择为指示不大于3%的假阴性率并且与样品的其它组分，例如抗其它多瘤病毒(例如，BK病毒(BKV))的抗体的交叉反应性最低。在一些实施方案中，用来自受试者的样品处理源自对照样品或样品集的参考。在一些实施方案中，选择所述参考以使测定的假阴性率不大于1%。在一个实施方案中，纯化HPVLP制剂中至少约10%的HPVLP中的每个HPVLP含有5个以上VPl多肽。在一个实施方案中，纯化HPVLP制剂中至少约15%、约20%、约25%、约30%、约40%、约50%、约60%、约65%、约70%、约80%或约90%的HPVLP中的每个HPVLP含有5个以上VPl多肽。可进行测定，使得HPVLP固定在固体基底上，例如微量滴定板或载玻片上。在一些实施方案中，HPVLP基本上由VPl病毒蛋白组成。HPVLP可进一步包含其它病毒蛋白，例如VP2或VP3的至少一种。HPVLP中的病毒蛋白可经重组得到(例如MADl株VPl)或可为天然存在的病毒蛋白(例如，源自天然存在的来源)。可使用(例如)从目前正用免疫调节药物进行治疗的受试者、考虑采用免疫调节药物进行治疗的受试者或怀疑患有进行性多灶性白质脑病(PML)的受试者获得的生物样品进行所述方法。
在一些方面，测定方法为进一步包括二次确认测定过程的两步法测定，二次确认测定过程包括使来自受试者的一部分生物样品与溶液中的HPVLP接触(用附着在固体基底的HPVLP培育样品之前)，从而提供二次样品；在与初步测定所用条件相同的条件下使二次样品与HPVLP接触；检测二次样品中与HPVLP结合的JCV抗体水平；和比较二次样品中JCV抗体的检测水平和未用可溶性HPVLP预先培育的样品中JCV抗体的水平，使得与未预先培育的样品相比，二次测定样品中的检测水平降低表明样品JCV抗体呈阳性，并且检测水平的变化低于指定百分比表明样品中不存在JCV特异性抗体。本文所述测定可用于测定从未接受用免疫调节剂进行治疗的受试者或先前已接受免疫调节剂，但不再接受用免疫调节剂进行治疗的受试者或目前正在经受用免疫调节剂进行治疗的受试者的JCV抗体的存在。本发明描述的测定中对与HPVLP结合的JCV抗体的检测可表明受试者罹患PML的风险增加。对JCV抗体的检测还可表明施用某些治疗剂，例如某些免疫调节剂时，受试者发生不良症状(例如PML发展)的风险增加，从而使受试者不为用这些试剂治疗的候选者。例如，对来自受试者的样品中的JCV抗体的检测可表明受试者不是用抗VLA-4治疗剂(例如那他珠单抗)进行治疗的候选者。在某些实施方案中，对生物样品中的JCV抗体的检测可表明受试者为用免疫调节剂(例如那他珠单抗)进行治疗的候选者，不同的是与不具有可检测JCV抗体的受试者相比，受试者在治疗期间将经受加强的监测。例如，加强的监测可包括观察不良症状，例如可能表明PML发展的症状。本发明描述的测定中检测与HPVLP结合的JCV抗体失败可表明受试者为接受用免疫调节剂(例如那他珠单抗)进行治疗的候选者，并且在一个实施方案中，对受试者进一步施用免疫调节剂。可对确定不具有JCV抗体的受试者至少每年再测试一次(例如，至少每3个月、每6个月、每9个月或每12个月一次)，以确定受试者是否已产生了 JCV抗体，这可能表明受试者已感染了 JCV。先前生物样品中没有可检测JCV抗体而随后在生物样品中产生JCV抗体的受试者可停止接受用免疫调节剂进行治疗。在一些实施方案中，先如鉴定为具有JCV抗体的受试者随后可在日后测试并确定不具有JCV抗体。可将这些受试者确定为接受用免疫调节剂(例如那他珠单抗)进行治疗的候选者。在一个实施方案中，可向先前经测试对JCV抗体的存在呈阳性而后来经测试对JCV抗体呈阴性的受试者施用免疫调节剂，并且与从未测试为对JCV抗体呈阳性的受试者相比经受加强的监测，例如监测可能表明PML发展的症状。本发明描述的测定可用于治疗患有免疫性疾病或病症(例如多发性硬化(MS)或克罗恩氏病(⑶))的受试者。在一个实施方案中，本文所述的测定经证实可用于MS和⑶患者，如通过显示该测定在受控试验环境(例如临床试验)中可有效检测MS和CD患者的JCV抗体所证实。另一方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含HPVLP和至少一种用于鉴定样品(例如生物样品)中JCV抗体水平的测定的试剂。在其它方面，本发明涉及包含基本上由含有VPl的颗粒组成的HPVLP颗粒的溶液，所述含有VPl的颗粒的尺寸大于VPl五聚体的尺寸，例如含有约5、10、20、30、40、50、60、70 或72个五聚体或含有约25个VPl分子、约50个VPl分子、约100个VPl分子、约150个VPl分子、约200个VPl分子、约300个VPl分子、约350个VPl分子或约360个VPl分子。本发明描述的另一方面是一种制备HPVLP溶液的方法，所述方法包括从溶液中去除与VPl五聚体尺寸相同或更小的VPl颗粒。在一方法中，VPl多肽在细胞，例如昆虫细胞或哺乳动物细胞中表达。溶解细胞，然后用核酸酶(例如benzonase核酸酶)处理细胞。通过沉淀，例如通过盐(例如，硫酸铵)沉淀去除细胞碎片，然后浓缩含有VPl的上清液并且使用渗滤，例如经由一次或两次通过膜(例如切向流过滤(TFF)膜)进一步纯化。然后通过离子交换步骤进一步纯化含有VPl颗粒Uf^BHPVLP)的溶液，并且(例如)用缓冲液进行HPVLP的洗脱。例如，可通过电泳(例如，SDS-PAGE)或质谱分析法评估VPI纯度。可通过显微镜检查，例如电子显微镜检查确认HPVLP的存在。可通过沉降速度分析超速离心法确定呈HPVLP形式的总蛋白质的百分比。在一方面，本发明描述了鉴定处于发展PML的风险的受试者的方法，例如通过从受试者获得生物样品；在适于样品中的JC病毒(JCV)抗体与HPVLP结合的条件下使生物样品与HPVLP接触；检测样品中与HPVLP结合的JCV抗体的水平；和使检测水平与参考集相关联而鉴定，其中如果检测到JCV抗体结合，则受试者罹患PML的风险增加。参考集被选择为指示约5%、为约3%、为约1%或更低的假阴性率。在另一方面，本发明描述了鉴定受试者的PML风险的方法，所述方法通过确定来自受试者，例如来自血浆、血液或血清样品的样品中抗JCV抗体的水平；和根据样品中抗JCV抗体的水平指定受试者的风险水平来进行。受试者可能正在接受免疫调节疗法，例如抗VLA4治疗(例如那他珠单抗)；或可能是接受免疫调节疗法的候选者。在一些实施方案中，受试者者可能已诊断患有免疫性疾病或病症，例如多发性硬化或克罗恩氏病。在一个实施方案中，使用一步法测定来确定抗JCV抗体的水平,而在另一个实施方案中，使用两步法测定来确定抗JCV抗体的水平。一步法测定或两步法测定可包括ELISA测定。在一个实施方案中，鉴定受试者的PML风险的方法进一步包括确定初始样品的次日样品中受试者体内抗JCV抗体的水平；比较来自次日样品中的抗JCV抗体的水平和来自初始样品的样品中的水平；和确定相比在初始样品的时间，受试者在次日摧患PML的风险是否增加。在一方面，本发明描述了一种监测受试者PML风险的方法，所述方法包括使用第一天的样品确定受试者体内抗JCV抗体的水平；在第一天时基于受试者体内抗JCV抗体的水平指定PML的风险(例如，高或中度或低风险)；使用第二天的样品确定确定受试者体内抗JCV抗体的水平；在第二天时基于受试者体内抗JCV抗体的水平指定PML的风险(例如，高或中度或低风险)。如本文中所使用，“HPVLP”是主要由VPl蛋白组成的高度纯化VLP( “病毒样颗粒”)。本发明描述的“HPVLP”主要由来自多瘤病毒、JC病毒(JCV)，可为天然存在的VPl或重组VPl的主要衣壳蛋白“VP1”构成。HPVLP可由例如VPl的一个以上的五聚体亚单位、至少10个五聚体亚单位、至少20个五聚体亚单位、至少30个五聚体亚单位、至少50个五聚体亚单位、至少72个五聚 体亚单位或更多个五聚体亚单位构成。HPVLP可含有呈未确定构型的VPl多肽(例如多肽可能以或可能不以五聚体组织)，这种情况下HPVLP可由5个以上的VPl多肽、至少50个VPl多肽、至少150个VPl多肽、至少360个VPl多肽或更多个VPl多肽构成。HPVLP包括含有约10至24个五聚体的衣壳粒。本发明描述的HPVLP可结合抗天然存在的完整JC病毒的抗体。在一些实施方案中，HPVLP包括第二和任选第三种类型的多肽，该多肽为JC病毒的小衣壳蛋白，例如至少一个VP2或VP3多肽。VP2或VP3可为重组多肽或天然存在的多肽或自然衍生的多肽。这种“高度纯化”颗粒含有I个以上的VPl五聚体，例如至少5个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、72个VPl五聚体或少于100个VPl五聚体。例如，可通过涉及
双重过滤的方法获得这种高度纯化颗粒。例如,在一个实施方案中,可通过(例如)蔗糖垫离心纯化颗粒至少两次来获得高度纯化的VLP制剂。通常，可通过使用限定的对照样品，通过其在ELISA测定中的活性鉴定HPVLP制剂。在一些情况下，这种对照样品为阴性对照和/或含有低水平JCV抗体的对照样品。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有如本发明所述领域中普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然与本文所述类似或等效的方法和材料可用于本发明的实践或试验中，但还是在下文描述了适合的方法和材料。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均通过引用整体并入。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实例仅为说明而非旨在限制。以下附图和描述中阐明了本发明一个或多个实施方案的详情。通过这些描述和附图以及权力要求，本发明的其它特征、目标和优点将显而易见。
图1为描绘来自对其尿中的JCV DNA呈阳性(尿阳性)和对其尿中的JCV DNA呈阴性(尿阴性)的受试者的样品的HPVLP ELISA的结果的图。方框表示在中心处具有中线的四分位数间距(IQR);括号表示I. 5倍IQR内的观测值。“+”号表示超出I. 5倍IQR的观测值(离群值)。*曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)。图2为描绘通过ELISA测量的抗JCV抗体水平与通过qPCR测量的尿JCV DNA水平(η = 204)的相对比的图。开口圆表示在匹配STRATA时间点收集的尿和血清样品。闭合圆表示在不同时间点收集的样品。对于DNA试验结果低于定量水平(< 500拷贝数/毫升)的17个样品而言，将水平设定为检测极限。图3为描绘来自一只经BKV免疫的兔子的BKV-JCV交叉反应性数据的图。来自BKV免疫免子的抗血清以高亲和性(EC50 = I 100,000)结合BKV VLP并且与JCV VLP交叉反应(EC50 = I 5，000)。图4A和4B描绘了在筛查和确认ELISA中来自尿阴性(η = 311)(图4Α)和尿阳性(η = 204)(图4Β)患者的血清样品的抗JCV测定反应性。示出了筛查ELISA中样品血清反应性的分布，突出显示了下部OiOD45tl = O. 10)和上部(nOD· = O. 25)切点(左图)。在补充确认ELISA(右图)中，突出显示了 40%抑制切点(垂直线)，阴影区表示未确认具有抗JICV特异性抗体的样品OiOD45tl ( O. 25，抑制百分比彡40% )0图5A和5B为描绘所有患者(η = 515)(图5Α)和尿阳性患者(η = 204)(图5Β)在每个10%抑制范围内的观测频率。分布由2个明确定义的峰值组成，在40%抑制下最佳分离。40%抑制水平对应于尿阳性样品的响应分布的大致第5个下百分位数。图6Α和6Β为11个预PML样品的来自筛查ELISA (图6Α)的nOD45(l值与来自确认ELISA (图5B)的抑制百分比相对比的图。水平线表示O. 10和O. 25的nOD450值，垂直线表 示40%的抑制百分比。发明详述将假阴性降到最低并将交叉反应抗体的检测减到最少的JCV抗体灵敏测定可用于鉴定已经接触JCV的个体。这种试验的开发可用于鉴定具有JCV现症感染或过去已充分接触JCV而产生抗病毒抗体的个体。这种测定也可提供辅助临床医师的手段，以使其对PML具有临床警惕性并对风险进行分级。例如，医师和患者可使用这种试验作为通过精确评估受试者是否已经接触JCV来评估患者发展PML风险的一部分。在一些情况下，分析包括确定来自患者的生物样品中的JCV抗体水平。开发可用于JCV抗体的测定，例如确立有效切点存在某些困难。申请人已经使用源自对JCV DNA呈尿阳性或尿阴性的患者的尿和血浆样品的测定数据解决了这个问题。另一个问题是开发具有特异性和再现性的测定。申请人已通过在抗体测定中使用含有高度纯化病毒蛋白的颗粒解决了这个问题。另外，申请人已发现，使用二次测定解析在初步测定中具有不确定结果的样品改善了该测定用于对这些样品提供可用结果的效用。因此，已开发出使用含有高度纯化VPl的病毒样颗粒(VLP)的分析验证测定，以检测体液，例如血清、血浆、尿、CSF或含有抗体的其它体液中JCV抗体的存在。在验证新测定的实验中，鉴定出JCV抗体在参与临床研究的MS患者群体中的流行率为大约54%。本文所述测定的主要特征是使用高度纯化的病毒样颗粒(HPVLP)。本文所述测定的一个优点是对于JCV抗体的检测而言，其具有较低的假阴性率，例如假阴性率为约10%、约8%、约6%、约4%、约3%、约I %或更低。通常，对于JCV抗体的检测而言，测定的假阴性率仅为约3%或更低。如本文所述，新测定可用于监测JCV的血清转化率。例如，已使用所述测定发现最初对JCV抗体呈阴性的所测试的受试者组群中年血清转化率不超过约2%。这证实测定可用于监测个体随时间推移的JCV接触状态。该测定可用于检测任何人类受试者，包括考虑用免疫调节剂进行治疗，例如抗VLA-4疗法(例如，那他珠单抗)、抗CD20疗法(例如，利妥昔单抗)、抗CDlla疗法(例如，依法利珠单抗)或吗替麦考酚酯的受试者；目前正在用免疫调节剂进行治疗的受试者；或已经停止用免疫调节剂治疗的受试者体内的JCV抗体。该测定可用于易患PML的其它个体，例如具有淋巴组织增生症，例如多发性骨髓瘤或淋巴瘤的个体；感染人免疫缺陷病毒(HIV)或患有获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、血液肿瘤或自身免疫疾病(例如全身性红斑狼疮(SLE))、炎症性肠病(例如克罗恩氏病(CD)或溃疡性结肠炎)、多发性硬化(MS)或关节炎(例如，风湿性关节炎(RA))的个体。该测定也可用于接受免疫抑制疗法或免疫调节疗法的受试者，例如移植患者。示例性免疫抑制疗法或免疫调节疗法包括那他珠单抗、利妥昔单抗、依法利珠单抗和吗替麦考酚酯。该测定可用于检测患有病症或正用 Piccinni 等 〃 Stronger association of drug-induced progressive multifocalleukoencephalopathy (PML)with biological immunomodulating agents" Eur. J Clin.PharmacoI.並199-206，2010中公开的药物治疗的受试者体内的JCV抗体，所述文献的内容通过引用并入本文。VPl据发现，在JCV抗体的测定中使用HPVLP可提高测定的精确性并可用于适于分析和诊断目的的测定中。可使用本领域中已知的方法生成用于产生HPVLP的VPl并且可为天然存在的VPI或重组生成的VPI，例如来自JCV病毒的VPI。通常，使用的VPI为来自JCV的MADl株的VPl。在一些实施方案中，测定中使用的VPl包括来自一个以上JCV株，例如来自 菌株1A、1B、2A、2B、3、4和7中的一个或多个的VP1。制备VPl之后，然后通过标准生物化学方法，包括密度梯度/超速离心方法，或一系列化学沉淀步骤、浓缩/渗滤和离子交换色谱法进一步纯化用于本文所述测定中的VP1。纯化方法通常包括去除包括单体VPl多肽或五聚体VPl的较小蛋白的步骤。这些较小颗粒的去除可例如分一步或两步进行(例如，去除VPl单体的第一过滤步骤，和随后的去除五聚体VPl颗粒的第二过滤步骤)。此类生物化学纯化方法为本领域的技术人员所已知。实施例I和7提供了两种不同的JCV VPl-VLP纯化方法。根据本发明一方面的HPVLP制剂(HPVLP)不含显著量的VPl单体(例如，已经纯化去除单体)。根据本发明另一方面的HPVLP制剂不含显著量的尺寸与VPl五聚体相同或更小(包括单体)构型的VPl分子。可由重组VPl或天然存在的VPl (例如，从病毒或病毒衣壳分离)制备HPVLP。在一些实施方案中，另外的JCV组分，例如来自JC病毒的一种或两种次要衣壳蛋白，例如VP2或VP3包含在HPVLP颗粒中或与基底相关。在一些情况中，重组表达的VPl可能不装配成类似于天然存在的病毒衣壳的五聚体或HPVLP，例如重组表达的VPl可装配成管状或其它非球形几何形状。因此，本发明涉及产生几何形状大体呈球形的HPVLP的方法。本发明包括HPVLP制剂，其中所述制剂中至少约 10%、约 15%、约 20%、约 25%、约 50%、约 60%、约 65%、约 70%、约 80%、约 90%、约95%或约99%的HPVLP类似于天然存在的JCV衣壳(例如，呈二十面体或大致呈球形构型)。在一些实施方案中，HPVLP制剂在制剂中含有至少10%、15%、20%、50%、60%、70%、80 %、90 %、95 %或99 %的类似于天然JCV衣壳的HPVLP。这种方法包括在产生这种制剂的条件下表达病毒蛋白和/或分离和纯化如本文所述的表达病毒蛋白以制备这种制剂。制备HPVLP的方法例如，通过用表达VPl基因(例如来自JC病毒的VPl基因)的载体转化杆状病毒制备HPVLP。用杆状病毒感染细胞培养物，例如昆虫细胞培养物(例如，SF9细胞)或哺乳动物细胞培养物，并且细胞表达VPl蛋白质。通过溶解细胞和通过一系列离心和超滤步骤纯化颗粒来分离HPVLP。通常，使用诸如蔗糖垫沉降、等密度超速离心和广泛超滤或本领域技术人员已知的其它方法进行纯化。在某些实施方案中，纯化包括通过蔗糖垫离心颗粒两次。在一替代性纯化方法中，使细胞溶解并通过一系列沉淀和浓缩/渗滤步骤以及最后的离子交换步骤来分离颗粒。可使用本领域中已知的任何适合技术，例如分析超速离心、电子显微镜检查、PAGE分析、质谱分析法、蛋白质浓缩或采用对照血清的ELISA中的活性测定来评估纯度。不够纯的VLP引起产生假高JCV抗体水平或计算接触率的高本底。在一些实施方案中，HPVLP含有作为唯一 JC病毒蛋白的VPl。在一些实施方案中，HPVLP为异质颗粒，并且因此包括VPl蛋白和JC病毒的至少一种次要衣壳蛋白，例如VP2或VP3。在另一个实施方案中，HPVLP包括VP1、VP2和VP3蛋白。可使用本领域中已知的方法，例如通过在相同或不同启动子的控制下用包含VPl和VP2基因的核酸转化杆状病毒来产生包括VPl和VP2的HPVLP。用杆状病毒感染细胞培养物，并且细胞表达VPl和VP2，并且形成包括两种类型蛋白质的HPVLP。在一个实施方案中，VPl和VP2基因在不同的DNA分子上，所述DNA分子被转化至不同杆状病毒中并且杆状病毒用于转染相同培养物中的细胞。所述细胞表达VPl和VP2蛋白，并且形成包括两种类型蛋白·质的HPVLP。在一些情况下，异质HPVLP将包括每5个VPl多肽(例如)一个或两个的VP2多肽。通常，HPVLP含有的VPl多肽多于VP2多肽，与在天然存在的JC病毒中一样。 例如，可分别用包括VPI和VP3基因或VPI和VP2基因的核酸，在相同或不同启动子控制下转化杆状病毒，来产生包括VPl和VP3或VPl和VP2分子的HPVLP。用杆状病毒感染细胞培养物，并且所述细胞表达VPl和VP3或VPl和VP2，并且形成包括两种类型蛋白质HPVLP。在一些实施方案中，VPl和VP3或VPl和VP2基因在不同的DNA分子上，并且所述DNA分子被转化至不同杆状病毒中，并且用杆状病毒转染相同培养物中的细胞。所述细胞分别表达VPl和VP3蛋白或VPl和VP2基因并且形成包括两种类型蛋白质HPVLP。可使用本领域中已知的方法，例如用于分离JCV衣壳的方法从这种制剂中分离HPVLP颗粒。通常，异质HPVLP中的VPl五聚体将包括(例如)5个VPl多肽和I个VP3多肽和/或I个VP2多肽，这取决于VP3基因或VP2基因是否用于构成所述构造。HPVLP中存在的VPl多肽通常比VP3或VP2多肽多。在一些实施方案中，VP2或VP3来自非JC病毒的多瘤病毒，例如BK病毒多肽。可通过用包括VP1、VP2和VP3基因的核酸(例如，环状DNA，例如< 5. 5kb)，例如在相同或不同启动子控制下转化杆状病毒来产生包括全部3种VP1、VP2和VP3分子的HPVLP。用杆状病毒感染细胞培养物，例如哺乳动物细胞培养物，并且所述细胞表达VP1、VP2和VP3蛋白质。从而形成包括三种类型蛋白质的HPVLP。在一个实施方案中，VPl和VP2或VP3基因中的任一种或两种在不同的DNA分子上，所述DNA分子被转化至相同或不同杆状病毒中，并用杆状病毒感染相同或单独培养物中的细胞。所述细胞表达VP1、VP2和VP3蛋白质，并且形成包括两种类型蛋白质的HPVLP。异质HPVLP可包括(例如)5个VPl多肽和VP2和VP3多肽各一个，但在制剂中比例可发生变化。HPVLP中存在的VPl多肽通常比VP2和VP3多肽多。在一些实施方案中，HPVLP相比VPl五聚体的尺寸较大。所谓尺寸较大是指HPVLP颗粒中所含的蛋白质质量比仅含VPl的五聚体大。在其它实施方案中，制备HPVLP溶液的方法可包括从溶液中去除与VPl五聚体尺寸相同或更小的颗粒(例如，VPl单体或含有小VPl的颗粒)。可使用诸如离心和尺寸排阻色谱法的方法进行该纯化步骤。在一些实施方案中，本领域中已知的其它方法，例如离子交换色谱法可用于制备比VPl五聚体更大的HPVLP。通常，与非HLVLP颗粒相比，适用于测定的HPVLP制剂将含有至少20% HPVLP、至少25% HPVLP、至少40% HPVLP、至少60% HPVLP、至少 65% HPVLP、至少 70% HPVLP、至少 80% HPVLP、至少 85% HPVLP、至少 90% HPVLP、至少95% HPVLP或至少99% HPVLP (例如，按与VPl单体和含有少于5个VPl分子的聚集体相比五聚体的百分比计)。切点本发明提供了采用“切点”以降低假阴性和假阳性率的分析方法。根据对例如在复制样品和多个重复抽样样品(例如，对照样品的至少2个、至少4个或至少8个重复抽样样品)之间进行平均得到的来自HPVLP测定的数据确立切点(例如，以检测生物样品中的JCV抗体)。在根据本发明的一种测定形式中，来自初期HPVLP筛查测定(例如ELISA测定)的结果将导致试验样品被分类为具有或不具有JCV特异性抗体，或者，如果样品不属于这 两种分类中的一种，则将对样品进行补充确认测定。例如，在本发明描述的HPVLP ELISA测定中产生的结果比确立水平(例如，HOD450 < O. I)低的样品将分类为缺乏JCV特异性抗体，并且在ELISA中提供的结果比确定水平更高(例如，HOD450 > O. 25)的样品将分类为对JCV特异性抗体呈阳性。可在确认测定中测试明显不属于这些分类之一的样品(例如，O. I< 0D450 < O.25)。在一个实施方案中，确认测定需要预培育步骤，其中用缓冲液(或其它适合溶液)对照或HPVLP (在缓冲液或其它适合溶液中)预培育试验样品以在HPVLP ELISA中分析之前预先吸附JCV特异性抗体，如以下进一步详细描述。用HPVLP预培育之后，如果初步测定中的反应与缓冲液对照相比减少不足40%，则说明样品对JCV特异性抗体的存在呈阴性。如果用HPVLP预培育后结果显示与缓冲液对照相比反应减少> 40%，则说明样品含有JCV特异性抗体。在一些实施方案，仅进行确认测定。实施例4中提供了选择和验证合适切点的方法的实例。基底任何合适的固体基底均可用于HPVLP测定形式。在一些实施方案中，基底为微量滴定板(例如，96孔板)、载玻片、珠或柱。基底可适于发色或化学发光检测法。测定通过将生物样品加至已涂覆有HPVLP的基底上进行测定并使用本领域中已知的方法进行检测。通常，使用固体基础平台，例如微量滴定板(例如，96孔板)；但可使用本领域中已知的其它形式。在一些实施方案中，在测定中使用之前稀释生物样品。在某些实施方案中，测定形式为酶联免疫测定(ELISA)。广义而言，所述方法通常包括用捕捉抗原(例如HPVLP)涂覆基底，培育含有针对捕获试剂的结合抗体的样品，洗涤以去除非特异性结合物种和通过(例如)发色或化学发光测定检测结合免疫复合物。发色基底产生可目视或使用分光光度计检测和测量的有色终产物。化学发光基底产生可使用亮度计测量的光。将板用HPVLP涂覆通常包括用合适浓度(例如，I μ g/ml)的HPVLP溶液培育固体基底(例如微量滴定板的孔)过夜或指定小时数。HPVLP可包括作为唯一 JCV病毒组分的VPl，或HPVLP可为异质颗粒，每个颗粒含有VP2或VP3的至少一种或每个颗粒含有VP2和VP3每种中的至少一个。涂覆HPVLP之后，洗涤板的孔。然后将基底用对于待试验样品呈抗原中性的非特异性蛋白“涂覆”。合适的涂覆材料在本领域中是已知的并且包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白或奶粉溶液。在可有效允许复合物形成(HPVLP/JCV抗体)的条件下在制备的基底上培育样品或参考物，从而形成结合复合物。使用可与人抗体结合的标记抗体进行结合复合物的检测。通常，标记抗体可检测人IgG或人IgG和IgM。在一些情况下，可使用二次或三次检测法进行测定。参考样品可有根据个体尿中JCV DNA的存在(尿阳性)从已知感染了 JC病毒的个体中分离的相同生物材料(例如，血浆、血清、尿或CSF)制得。参考样品可用于确立测定切点，使得测定的假阴性率不超过1% _3%。“在可有效允许复合物形成的条件下”通常指其中已稀释试剂以降低本底并提供 在指定范围内的结果读数的条件。在非限制性实例中，稀释剂可包括包含BSA的溶液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)或含Tween的PBS。“合适”条件还包括足以允许有效结合的温度和/或一段时间的条件。培育通常在约25°C至27°C的温度下进行约I至2h或I至4h，或可在约4°C下过夜。然而，本领域中的人员将理解其它条件可能是合适的。通常，在测定的培育期间进行一次或多次洗涤。合适的洗涤溶液包括稀释缓冲液(例如，PBS或PBS/Tween)或硼酸盐缓冲液。通常，使用本领域中众所周知的方法进行与HPVLP结合的抗体的检测。通常，这些方法基于检测标记或标志，例如放射性、荧光、生物或酶标签。关于这些标记的用途的美国专利包括(例如)美国专利 No. 3，817，837,3, 850，752,3, 939，350,3, 996，345,4, 277，437、4，275，149和4，366，241。通常，使用标记的二次抗体检测JCV抗体结合。通常，二次抗体对检测人IgG有特异性。例如使用可见光谱分光光度计测量产生的色度实现量化。实施例2说明了进行测定的方法并且本领域中的人员将理解可进行适当修改。在一个实施方案中，在医务室中，例如由医护人员，例如医生、护士或在从患者获得生物样品的机构工作的技术人员进行测定。在另一个实施方案中，将从患者获得的生物样品转移至另一机构，例如进行测定的第三方机构。在后一种情况下，例如可通过以邮件或电子提交形式(例如通过传真或电子邮件)或通过在线数据库将测定的结果报告返回给医护人员。在一个实施方案中，可将测定(包括筛查测定和任选的确认测定)的结果储存在数据库中并且可由医护人员，例如通过万维网访问。二次试验在一些情况下，例如，当样品中的JCV抗体水平落入指定“灰区(equivocalzone) ”或“不确定区(indeterminate zone) ”时,例如确定有关JCV抗体的存在或缺乏的确定性有限时，采用样品的二次试验(本文也称为“确认测定”)。对于二次试验，使用两份生物样品等分试样。在测定中使用之前，通过在存在测定缓冲液存在下，将样品在溶液中预培育一段时间(例如，在4°C下培育30min、lh或更长时间(例如过夜))来制备第一份等分试样。在测定中使用之前，通过HPVLP存在下，将样品在溶液中预培育一段时间(例如，30min或Ih或更长时间)来制备第二份等分试样。然后将两份等分试样用于本文所述的HPVLP测定，并且将样品指定为JCV抗体阳性或抗体阴性。如果在初步测定中对于用溶液中的HPVLP培育的等分试样的结果与用缓冲液培育的第一份等分试样相同(即，OD大致相同)，则说明样品对JCV特异性抗体的存在呈阴性。如果预培育后(即，在二次测定中)测定结果更低，则说明样品含有JCV特异性抗体。本文描述的利用二次试验的测定在本文中也称为“两步法试验”或“两步法测定”。测定结果的报道在一些实施方案中，测定包括可为相对于参考的水平(例如，0D)的读数或评估样品是否为阳性、阴性或不确定JCV抗体的存在的读数。在一些实施方案中，提供了包括至少一种HPVLP和任选用于测定的其它组分的试剂盒。例如，试剂盒可包括用于制备进行初步ELISA测定和二次确认测定的工具的测定阳性和阴性对照、缓冲液和基底(例如，微量滴定板)。试剂盒可包括(例如)溶剂或缓冲液、对照、稳定剂、防腐剂、二次抗体(例如，抗HRP抗体(IgG))和检测试剂。 HPVLP可以任何形式提供(例如液体、干燥、半干燥或冻干形式)或以冷冻条件下储存的形式提供。在一些实施方案中，将制备的HPVLP团块化并以半固体形式储存。通常，HPVLP以无菌形式提供。当HPVLP以液体溶液提供时，液体溶液通常为水溶液，例如无菌水溶液。当HPVLP以干燥形式提供时，通常通过添加适合溶剂实现复水。可任选在试剂盒中提供溶剂，例如无菌缓冲液。试剂盒可包括用于含有浓度适用于测定的HPVLP的组合物的一个或多个容器或具有测定中所用稀释的说明书。在一些实施方案中，试剂盒容纳有用于HPVLP和测定组分的分立的容器、分隔器或隔室以及信息材料。例如，HPVLP可容纳在瓶或小瓶中，并且信息材料可容纳在塑料套管或包装中。在其它实施方案中，试剂盒的分立元件容纳在单个未分隔的器中。例如，HPVLP组合物容纳在信息材料以标签形式附于其上的瓶或小瓶中。在一些实施方案中，试剂盒包括若干(例如一包)单独容器，每个容器容纳有一个或多个HPVLP单位形式(例如，与一种测定一起使用)。例如，试剂盒包括若干个安瓿、箔材包装或泡罩包装，各自容纳有用于筛查或确认测定的单一 HPVLP。试剂盒的容器可为气密的和/或防水的。可标记容器以便使用。在一个实施方案中，试剂盒可包括用于进行和说明测定的信息材料。在另一个实施方案中，试剂盒可向(例如)治疗中心或医护人员提供关于去何处报道测定结果的指导。试剂盒可包括用于报道本文所述HPVLP测定结果的表格和关于将这些表格发送至何处的地址和联系信息或其它有关信息；或在在线数据库或在线应用(例如app)中报道结果的URL(统一资源定位符)地址。在另一个实施方案中，信息材料可包括关于根据测定结果，患者是否应接受用免疫调节药物进行治疗的指导。试剂盒的信息材料的形式不受限制。在许多情况下，以印刷品形式，例如印刷文本、图纸和/或照片(例如，标记或印刷图)提供信息材料，例如说明书。然而，也可以其它形式，例如计算机可读材料、录像或录音形式提供信息材料。在另一个实施方案中，试剂盒的信息材料为联系信息，例如物理地址、电子邮件地址、网站或电话号码，其中试剂盒的用户可获得关于HPVP测定和/或其在本文所述方法中的用途的真实信息。当然，也可以任何形式的组合提供信息材料。在一些实施方案中，可将生物样品提供给在测定中评估样品并提供读数的测定提供者，例如服务提供者(例如第三方机构)或医护人员。例如，在一个实施方案中，测定提供者收来自受试者的生物样品，例如血浆、血液或血清样品，并且使用本文所述的测定评估样品，并且确定样品含有JCV抗体。然后，测定提供者，例如服务提供者或医护人员可推断受试者罹患PML的风险增加。测定提供者可进一步确定受试者不为接受用免疫调节剂例如抗VLA疗法(例如那他珠单抗)进行治疗的候选者，或受试者为接受用免疫调节剂进行治疗的候选者，但是与确定不具有JCV抗体的受试者相比，该候选者将接受加强监测。例如，将更频繁地检查候选者不良症状的发展，例如可能表明PML发展的症状。在一个实施方案中，测定提供者进行本文所述的测定并确定受试者不具有可检测的JCV抗体。测定提供者进一步确定受试者为接受用免疫调节剂(例如那他珠单抗)进行治疗的候选者。在一个实施方案中，测定提供者告知医护人员受试者是用免疫调节剂进行治疗的候选者，并且向候选者施用免疫调节剂。测定提供者可以任何适合形式，例如通过邮件或电子形式或通过在线数据库向 (例如)医护人员或患者或保险公司提供评估结果和任选关于诊断、预后或恰当疗法选择中一种或多种的结论。测定提供者收集和提供的信息可存储在数据库中。以下实施例进一步说明了本发明，这些实施例不得视为进行进一步限制。
实施例实施例I :高度纯化的VPl颗粒的合成和纯化在经重组杆状病毒转染的SF9昆虫细胞中生成由JCV或BKV衣壳蛋白组成的HPVLP。就含有JCV VPl的颗粒而言，用来自JCVMad-I株的表达VPl的核酸转化重组杆状病毒。将重组VLP在细胞溶解之前收获并通过差速超速离心、洗涤剂洗涤和超滤来纯化。简言之，感染后约3天通过在3000XG下离心收获杆状病毒感染的细胞并且冷冻储存直至纯化HPVLP。使用约IOOg冷冻细胞团块进行纯化。使解冻细胞溶解于500ml补充有 O. ImM CaCl2(PBS-C)的 PBS 中。通过使细胞悬液通过 Microf luidics Microfluidizer 两次使细胞破裂。通过在8000XG下团块化15min去除细胞碎片。用PBS-C将上清液体积调节至720ml并加载至5ml 40%蔗糖垫上。通过在100，000XG下的SW28转子中的蔗糖垫5h，团块化HPVLP两次。将HPVLP团块重悬于PBS-CaCl2中，然后在37°C下用O. 25%脱氧胆酸盐处理lh，然后通过在4°C下加入补充有O. ImM CaCl2的4M NaCl处理lh。通过在8000XG下离心15min去除沉淀物质。浓缩所得的上清液并通过Pelicon-2500，000M WCO膜(Millipore)超滤进行缓冲交换。将浓缩VLP涂覆到Optiprep (Sigma, St. Louis, MO)的25-40%不连续梯度的中央并且于50. 2型转子中在190，OOOg下分条带17h。收集VLP条带，然后浓缩，并且于Amicon搅拌装置(Millipore)中用300，000MWC0 (截留分子量)膜并进行缓冲交换。通过0.22yPES(聚醚砜)过滤器过滤浓缩物质并储存于4°C下。以这种方式制备的VLP在本文中称为HPVLP。通常通过凝胶电泳和电子显微镜检查确定VLP质量。 为了使VLP变性以进行蛋白质确定，加入EDTA、DTT和SDS至最终浓度分别为2mM、2mM和2%。通过使用Pierce BCA(二喹啉甲酸)测定确定完全变性的蛋白质的浓度。为了通过凝胶电泳进行分析，使用Nu PAGE 吗啉乙磺酸-SDS缓冲体系(Invitrogen, Carlsbad, CA)将产生2 μ g至5 μ g总蛋白的足够体积加载于预烧注的4% -20%聚丙烯酰胺凝胶(NO VEX, San Diego, CA)上。在70mA/凝胶至80mA/凝胶的恒定电流下使凝胶电泳30min。用蒸懼水中的50%甲醇和10%醋酸固定蛋白质条带并根据生产商的建议用商用胶状考马斯蓝试剂(Invitrogen)显现蛋白质条带。使用电子显微镜检查评估VLP。将VLP样品置于碳格网上，在水中简单洗涤并用乙酸铀酰负染并使其干燥。用Tecnai G2Spirit BioTffIN TEM观察格网并成像。以下在实施例7中提供了替代性JCV VPl-VLP纯化方法。实施例2 HPVLP杭体测定针对抗JCV抗体的灵敏测定采用本文所述的HPVLP开发并且在本文各个实施方案中称为HPVLP测定。在一个测定实例中，通过加入含有浓度为I μ g/ml的HPVLP的溶液并且在4°C下培育板过夜来制备96孔微量滴定板。将孔用稀释缓冲液冲洗，然后在室温下用酪蛋白封闭缓冲液封闭lh，并用稀释缓冲液冲洗。将测定对照和血清或血浆样品按I : 200·稀释于测定稀释剂中。将稀释样品和对照加入孔中并在室温下培育lh，并且用稀释缓冲液洗涤。使用其加入孔中并在室温下培育Ih的驴抗人HRP抗体(IgG)进行检测。然后洗涤板并加入 TMB (3，3' ,5,5'-四甲基联苯氨)缓冲液(Chromagen, Inc. , San Diego, CA)。在显色适于允许颜色显现的时间(约20min)后，用IN H2SO4终止反应，并且读取在450nm下的吸光度。样品中的抗JCV抗体水平以OD单位表示。如以下所述使用OD单位说明测定以确定水平。在二次试验中，如果未知样品对溶液中的HPVLP的结合产生40%以上的竞争性抑制，则认为样品为JCV+CJCV阳性)，其中< 40%的抑制被评分为JCV-CJCV阴性)。最初，将OD值大于切点OD (平均阴性对照ODX I. 23)的样品定义为对JCV抗体的存在呈阳性，而将OD值等于或小于切点OD的样品定义为阴性。用于测定的对照基于目标OD和特异性(如针对特性的二次确认测定(以下所述)中所确定)选择并且包括阳性对照1，其为在测定中具有高反应性(定义为目标OD值为约
I.O并且对于特异性而言，与JCV的竞争> 80% )的混合供体血清；阳性对照2，其含有在测定中具有较低反应性(定义为在测定中的目标OD值为约O. 25 ;并且对于特异性而言，与JCV的竞争> 80% )的混合供体血清；和阴性对照，其为在测定中反应性与缓冲液对照相似，目标OD值为约O. 07的混合供体血清(注意测定缓冲液的O. D.值为约O. 045)。在一些情况下，进行滴定测定，其中在多种稀释度下测试阳性样品，并且将产生大于切点OD的OD值的最高稀释倍数定义为JCV IgG滴度。已从特异性、精确性、基体干扰、强度和试剂稳定性的角度对测定进行了验证。实施例3 :二次确认测定在一些情况下，除以上描述的试验外还进行了二次确认测定(二次测定)。在确认测定中，在用于测定之前，在室温下用HPVLP (最终VLP浓度=I μ g/mL ;最终样品稀释倍数=1 200)培育样品(血浆或血清)lh。并将对照样品在测定缓冲液中并且在不存在HPVLP的情况下培育。然后如以上所述进行测定。nOD45(l抑制百分比这样计算抑制％ =100X [1-(平均nOD45Q) (JCV MAD-IVLP预培育样品)+ (平均nOD45(l)(缓冲液培育样品)]。如果用缓冲液预培育后测定结果与初步测定相同(即，O. D.大致相同)，则说明样品对JCV特异性抗体的存在呈阴性。如果用HPVLP预培育后测定结果较低(即，在二次测定中)，则说明样品含有JCV特异性抗体。_6] 实施例4 :筛杳/确认测定切点算法将血清学试验(JCV抗体试验)设计为两步法测定筛查ELISA和补充确认ELISA (二次测定)。为比较测定板、测定操作和分析员之间的结果，将样品结果归一化为板上阳性对照的光密度(OD45tl)值并报道为如以下所述的归一化0D·。为实现HPVLP测定的效用，使用Weibull三组分混合物分布模型获得切点。在这
些确定中，使用以下定义平均(样品_Ο _复制样品)
筛查测定归一化OD (HOD；,=平均(PC1M复抽样样品、例如平均(样品_0D_复制样品)=O. 60平均(阳性对照1_0D_重复抽样样品)=I. 20归一化OD = O. 60/1. 20 = O. 50。对于确认测定而言，
确认测定抑制％=100%x[l- 竟争-样品_01>_
非竞争―样品—OD补充确认ELISA中，在筛查ELISA中评估样品之前，使用可溶性HPVLP预吸附抗JCV的高亲和性抗体。用HPVLP预吸附样品后，将结果计算为抑制百分比以确定筛查ELISA中反应性的降低[抑制％ = 100X [1_(平均nOD45QHPVLP预培育样品)+ (平均nOD45(l缓冲液培育样品)]。假阳性和假阴性率定义如下。假阴性率为通过测定确定为抗体阴性的真JC病毒阳性样品的比例。血清阳性率为经确定为血清阳性(即，使用抗JCV筛查/确认切点算法确定具有JCV抗体)的样品的比例。使用SAS v9分析数据。通过曼-惠特尼U检验分析未显示正态分布的数据。根据样品的大小，使用Pearson x 2检验或Fisher精确检验分析分类数据。使用Pearson相关系数评定nOD45(l和尿JCV DNA水平之间的关系。在O. 05的α水平下所有试验均为双侧试验。使用10，000自助法通过自助百分位数法(6)获得血清阳性率和假阴性率的置信限度。实施例4(a):对JCV的血清反应性进行研究以确立检测MS患者体内抗JCV抗体的测定并且对PML风险分级测定的潜在临床效用进行初步评估。为表征人体内抗体对感染性试剂的反应，具有来自感染和非感染固体的参考血清至关重要。虽然JCV感染的无症状特性使得不可能鉴定“真”阴性个体，但申请人能够通过测量“尿阳性”个体的尿中的JCV DNA来鉴定“真”阳性个体群体。通过定量实时聚合酶链式反应(q-PCR)测定(ViraCor Laboratories, Lee ' sSummit, MO)来确定尿JCV DNA水平(在STRATA (再次开始那他珠单抗给药)临床试验方案中收集)，定量限值为500拷贝数/毫升，检验限值为50拷贝数/毫升。对于筛查ELISA中的抗JCV抗体而言，首先评估包括来自204名JCV尿阳性患者的样品的831份MS患者血清样品的抗JCV抗体状态，以确定血清学反应的分布。尿DNA状态的测定结果显示存在两个重叠但不同的JCV IgG反应性群体(图I)。JCV DNA尿阳性MS患者反应性的中值水平(nOD450 = O. 895)显著高于JCV DNA尿阴性MS患者(nOD450 = O. 131 ；P < O. 001)，并且无尿阳性患者表现出低于O. 10的nOD45(l测定反应性。因此，确定较低测定切点为nOD5(lO. 10，其中阴性区中经验性假阴性率为0%。尿中无可检测JCV DNA (尿阴性)的许多患者的血清反应性与尿阳性患者相似。这些结果与尿JCV DNA试验很可能不能检测出所有JCV感染个体的假设一致。实施例4(b):尿TCV DNA载量和血清学活件为确定有关具有低病毒复制水平的JCV感染患者可能具有血清学测定中未检测出的低血清抗体水平(潜在假阴性)的可能性，检查了病毒水平和抗体反应性之间的相关性。图2示出了来自204名JCVDNA尿阳性STRATA患者的数据，并且说明在nOD45(l低于O. 60的样品中尿JCV DNA水平和抗JCV抗体水平之间无可检测关系(Pearson相关系数=
O.048,P = O. 751)。即使在相同STRATA研究时间点收集尿和血清，该结果也适用(Pearson 相关系数=O. 002,P = O. 993)。在nOD450 > O. 60时，在来自个体的更高比例的血清样品中观察到更强的相关性，其中高JCV DNA拷贝数/毫升表现出较高的nOD45(l值，这与文献报道一致(例如，Egli等，J. Infect. Dis. 199 =837-846,2009)。这些数据表明血清阴性结果很可能是由于不存在JCV感染，而非极低的病毒水平。实施例4 (c) =RKV-ICV交叉反应性的评估对将的假阴性率控制在0%的单个保守切点的评估不太可能排除检测与其它常见多瘤病毒交叉反应(假阳性)的抗体，例如与VPl衣壳蛋白中的JCV共有高度一致性的抗BKV抗体。另外，当将HPVLP直接涂覆至ELISA板上时，这种抗体交叉反应性可通过接触保守病毒表位出现。因为可能在人体中出现受BKV和JCV的双重感染，并且不能可靠鉴定受BKV而不受JCV感染的患者，检查免子(受BKV或JCV的自然感染不可能同时出现的物种)中的交叉反应性组织。通过皮下注射不含佐剂的磷酸盐缓冲盐水中的蛋白质来用BKV免疫免子，然后加强注射3个月的时间。通过ELISA测定血清样品与JCV或BKV的直接结合。来自BKV免疫兔子的抗血清以高亲和性(EC50 = I 100, 000)结合BKV VLP并且以较低亲和性(EC50=1 5，000)与HPVLP交叉反应。免疫前的血清未显示反应性。来自一只免子的代表性数据示于图3中。因为BKV抗体与JCV交叉反应，从而在抗JCV测定中产生假阳性信号(图3)，人体内对JCV的低水平反应性可代表与JCV交叉反应以产生假阳性信号的低亲和性抗BKV抗体。实施例4(d):测量TCV特异件抗体反应(补充确认ELISA)为区分具有JCV特异性抗体的患者和具有潜在低亲和性交叉反应性抗体的患者，使用可溶性HPVLP ( 二次测定)研究竞争ELISA。预期JCV特异性、较高亲和性抗体被可溶性抗原更有效地竞争，而较低亲和性抗体可能与溶液中的JCV抗原形成的复合物分离并且与涂覆于ELISA板上的JCV VLP结合。从自尿阳性(η = 204)和尿阴性(η = 311)患者全身性地并且不按比例地采集515份血清样品子集，以在用可溶性JCV VLP或测定缓冲液预吸附后于ELISA中进行评估。在图4Α和4Β中，并排示出了筛查和确认测定中来自尿阴性或尿阳性患者的血清样品的反应性。通过用可溶性JCV预吸附抗体高度抑制了具有强JCV反应性的样品，而具有低水平JCV抗体的样品显示出差异竞争性。在大多数尿阳性患者体内反应的抗体受激烈竞争(图4B)。这些结果支持这样的观点，即对JCV的低血清反应性的显著比例可能是由于对JCV不具特异性的抗体的交叉反应性。确认ELISA中血清反应的分布由两个明确的峰组成，其在与尿阳性样品反应分布的第5个下百分位数(图5B)大致相对应的40%抑制(图5A)下最佳分离。因此，选择40%的抑制水平作为确认ELISA的切点。实施例4(e):最终确定的两步法抗JCV血■清学测定通过结合筛查和确认测定，大大增加了检测具有“真” JCV特异性抗体的样品的几率。在最终分析中，筛查ELISA中nOD·值< O. 10的样品被认为对JCV抗体呈阴性，并且筛查ELISA中nOD45(l值> O. 25的样品被认为对JCV抗体呈阳性。在确认ELISA中进一步测试反应性nOD值介于O. 10至O. 25之间的样品。在确认ELISA中，将所有表现出> 40%
抑制的样品分类为阳性(图4)。在nOD45(l值>0.25时，观察到>40%抑制的可能性为约95%。实施例4(f) :STRATA群纟目的TCV血清阳件和假阴件率基于以上算法，估计STRATA群体中血清阳性率为53.6%，自助法确定的95%的置信限度的范围为49. 9%至57. 3% [O. 536 = 0.451(筛查ELISA nOD45(l > O. 25的概率)+0. 085 (筛查nOD450落在O. 10至O. 25之间和补充确认ELISA% -抑制>40%的概率)]。这种血清阳性率计算假设确认相同比例的来自尿阳性和尿阴性受试者的样品的抗JCV抗体在介于O. 10至O. 25之间的nOD区中(抑制百分比> 40% );这种假设受双侧Fisher精确检验支持，P值为O. 702。在204名尿阳性患者中，5名患者的nOD45Q介于O. 10和O. 25之间并且未确认为具有抗JCV特异性抗体(抑制百分比< 40% ;图4B)。实施例5 :测定验证由Focus Diagnostics, Inc. (Cypress, CA)进行测定验证,其中证实了性能参数，包括测定试剂和对照的测定间和测定内的精确度、特异性、灵敏性和稳定性。证实了测定性能参数，包括测定试剂和对照的测定间和测定内的精确度、特异性、灵敏性和稳定性。由3位独立分析员在4个不同的日期使用测定对照的独立制剂估计血浆和血清中的精确度参数。为证实测定特异性，用测定缓冲液或溶液中具有确定浓度的HPVLP或BKV VLP预培育来自健康志愿者或MS患者(天然TYSABRI (那他珠单抗))的10份单独血清和血浆样品。通过改变样品培育时间的上限和下限，缀合和基底添加步骤估计稳健性，并且估计不同的HPVLP涂覆试剂批次来证实一致性测定对照性能。通过确定以预定浓度的抗JCV抗体标记的样品的回收百分比和用不同浓度的非相关人单克隆抗体标记含有JCV特异性抗体的样品估计基体干扰。实施例6 :确定PML患者体内的TCV抗体状杰从来自TYSABRI重新给药和治疗安全性(STRATA)研究的总计831名患者获得血浆和血清样品(从连续收集随机选择的单个时间点)。STRATA为开放标签、单组(single-arm)、多国研究(北美、欧洲、澳大利亚和新西兰)，其中所有患者通过静脉输液每4周接受300mg那他珠单抗，持续48周。分析根据STRATA方法收集的尿样JCV中DNA的存在。自2006年6月至2010年2月9日TYSABRI 取得上市许可以来，报道了 35个有关那他珠单抗治疗的PML病例。另外，在预批准那他珠单抗临床试验中有3个PML病例(10,13,25)。从尽可能多的来自PML诊断(预PML)之前的时间点的PML病例获得储存样品。仅可由11名用那他珠单抗治疗的PML患者(10名MS患者和I名克罗恩氏病患者表I)获得血浆或血清样品。测试在PML诊断前I至3年获得的血清样品。几乎所有这些样品均从参与登记或临床研究的患者获得并且储存在_70°C下直至进行分析。值得注意的是，通过如以上所述血清状态筛查ELISA和补充确认ELISA (图6A和6B)的组合在11名患者(100%)体内检测到抗JCV抗体。使用单样品Fisher精确检验，该结果显著不同于预期比例(53.6% )，p值为 0.002。这些数据表明本发明的测定可用于确定受试者体内JCV抗体的存在或缺乏，作为整体评估缩减PML的风险的一部分。表I.来自11名经那他珠单抗治疗、诊断之前具有可用血样的PML患者的样品
权利要求
1.一种方法，所述方法包括 a.从受试者获得生物样品； b.在适于所述样品中的JCV抗体与HPVLP结合的条件下使所述样品接触高度纯化的VPl 颗粒(HPVLP)； c.检测所述样品中与HPVLP结合的JCV抗体的水平；和 d.使所述检测水平与参考集相互关联，其中所述参考集被选择为指示不大于3%的假阴性率。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述假阴性率不大于I%。
3.根据权利要求I所述的方法，其中至少20%的所述HPVLP中每个HPVLP包含5个以上的VPl多肽。
4.根据权利要求I所述的方法，其中至少70%的所述HPVLP中每个HPVLP包含5个以上的VPl多肽。
5.根据权利要求I所述的方法，其中所述HPVLP固定在固体基底上。
6.根据权利要求I所述的方法，其中HPVLP基本上由VPl多肽组成。
7.根据权利要求I所述的方法，其中HPVLP进一步包含VP2或VP3的至少一种。
8.根据权利要求I所述的方法,其中所述HPVL中的VPl为重组VPl。
9.根据权利要求I所述的方法，其中所述HPVL中的至少一个VPl为突变VPl。
10.根据权利要求I所述的方法,其中所述生物样品为血清。
11.根据权利要求I所述的方法，其中所述样品来自开有免疫调节剂处方的受试者、考虑采用免疫调节剂的受试者或怀疑患有进行性多灶性白质脑病(PML)的受试者。
12.根据权利要求I所述的方法，其中对与所述HPVLP结合的JCV抗体的检测表明所述受试者罹患PML的风险增加。
13.根据权利要求I所述的方法，其中对与所述HPVLP结合的JCV抗体的检测表明所述受试者不为接受用免疫调节剂进行治疗的候选者。
14.根据权利要求I所述的方法，其中检测与HPVLP结合的JCV抗体失败表明所述受试者为接受用免疫调节剂进行治疗的候选者。
15.根据权利要求I所述的方法，其中对与所述HPVLP结合的JCV抗体的检测表明所述受试者为接受用免疫调节剂进行治疗以及在用所述免疫调节剂进行治疗时接受对不良症状的加强监测的候选者。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述不良症状表明PML在发展。
17.根据权利要求14所述的方法，其中对鉴定为接受用所述免疫调节剂进行治疗的所述受试者进一步施用所述免疫调节剂。
18.根据权利要求I所述的方法，其中对初次试验中确定生物样品不具有JCV抗体的受试者在所述初次试验后至少每年再测试一次JCV抗体的存在。
19.根据权利要求I所述的方法，其中经确定生物样品中具有JCV抗体的受试者随后在日后确定为不具有JCV抗体。
20.根据权利要求19所述的方法，其中将所述受试者确定为接受用免疫调节剂进行治疗的候选者。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述受试者在用所述免疫调节剂进行治疗时接受对不良症状的加强监测。
22.根据权利要求11或13至15所述的方法，其中所述免疫调节剂为那他珠单抗。
23.根据权利要求11所述的方法，其中先前尚未向开有免疫调节剂处方或考虑采用免疫调节剂的受试者施用所述免疫调节剂。
24.根据权利要求11所述的方法，其中所述受试者先前已接受一个或多个剂量的所述免疫调节剂。
25.根据权利要求I所述的方法，所述方法进一步包括 e.在步骤(b)之前使来自所述受试者的生物样品的一部分与溶液中的HPVLP接触，并且其中将步骤(b)的HPVLP附着在固体基底上，从而提供二次样品； f.在与(b)相同的条件下使所述二次样品与HPVLP接触； g.检测所述二次样品中与HPVLP接触的JCV抗体的水平；和 h.将所述二次样品中的JCV抗体的检测水平和用不含HPVLP的溶液培育时所述生物样品中的结合水平进行比较，其中所述用HPVLP预培育的样品中的检测水平与所述溶液培育的样品相比降低表明所述样品对JCV抗体呈阳性，所述检测水平无变化表明所述样品中不存在JCV抗体。
26.根据权利要求25所述的方法，经证实可用于MS和⑶患者。
27.一种试剂盒，所述试剂盒包含HPVLP和至少一种用于进行鉴定JCV抗体水平测定的试剂。
28.一种溶液，其包含VPl颗粒，所述VPl颗粒基本上由包含尺寸大于VPl五聚体的VPl颗粒组成。
29.一种制备VPl颗粒溶液的方法，所述方法包括从所述溶液中去除与VPl五聚体尺寸相同或更小的VPl颗粒。
30.一种鉴定处于发展PML的风险的受试者的方法，所述方法包括 a.从所述受试者获得生物样品； b.在适于所述样品中的JC病毒(JCV)抗体与HPVLP结合的条件下使所述生物样品接触高度纯化的VPl颗粒(HPVLP)； c.检测所述样品中与HPVLP结合的JCV抗体的水平；和 d.使所述检测水平与参考集相互关联，其中如果检测到JCV抗体结合，则所述受试者罹患PML的风险增加。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述参考集被选择为指示不大于3%的假阴性率。
32.一种鉴定受试者的PML风险的方法，所述方法包括 a.确定来自所述受试者的样品中抗JCV抗体的水平；和 b.根据所述样品中抗JCV抗体的水平测定所述受试者的风险水平。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述受试者在接受抗VLA4治疗或者是接受抗VLA4治疗的候选者。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述抗VLA4治疗为那他珠单抗。
35.根据权利要求32所述的方法，其中所述受试者已被诊断为患有多发性硬化或克罗恩氏病。
36.根据权利要求32所述的方法，其中使用一步法测定或两步法测定确定所述抗JCV抗体的水平。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述一步法测定或两步法测定包括ELISA测定。
38.根据权利要求32所述的方法，进一步包括 c.确定步骤(a)的初始样品的次日样品中所述受试者体内的抗JCV抗体的水平； d.比较所述次日样品中抗JCV抗体的水平和来自步骤(a)的初始样品的样品中的水平；和 e.确定与在步骤(a)的初始样品时间相比所述受试者在次日罹患PML的风险是否增加。
39.一种监测受试者PML风险的方法，所述方法包括 a.使用第一天的样品确定所述受试者体内抗JCV抗体的水平； b.在第一天时基于所述受试者体内抗JCV抗体的水平指定PML的风险； c.使用第二天的样品确定确定所述受试者体内抗JCV抗体的水平； d.在第二天时基于所述受试者体内抗JCV抗体的水平指定PML的风险。
40.一种制备包含HPVLP的制剂的方法，所述方法包括 a.提供包含VPl核酸的细胞； b.在表达VPl的条件下培养所述细胞； c.溶解所述细胞； d.用核酸酶处理所述细胞溶解产物； e.从所述溶解产物中沉淀细胞碎片； f.通过盐沉淀去除污染蛋白质； g.浓缩含有VPl的上清液； h.渗滤所述浓缩的含有VPl的上清液；和 i.通过离子交换纯化来纯化所述含VPl的溶液，从而制备包含HPVLP的制剂。
全文摘要
本公开涉及分析样品中JC病毒抗体的存在的方法和试剂。公开了一种方法，所述方法包括从受试者获得生物样品(例如，血浆、血清、血液、尿或脑脊髓液)，在适于所述样品中的JCV抗体与HPVLP结合的条件下使所述样品接触高度纯化的病毒样颗粒(HPVLP)，和检测所述样品中与HPVLP结合的JCV抗体的水平。在一个实施方案中，确定所述受试者样品中的JCV抗体的水平提供了鉴定受试者的PML风险的方法。
文档编号C12Q1/70GK102906278SQ201180013386
公开日2013年1月30日 申请日期2011年1月11日 优先权日2010年1月11日
发明者L.戈雷利克, K.J.西蒙, M.萨布拉曼亚姆, M.M.卢舍 申请人:比奥根艾迪克Ma公司