专利名称：分析细胞或含有核酸的其它生物材料的方法
分析细胞或含有核酸的其它生物材料的方法本发明涉及分析细胞或其它生物材料的方法，识别完整的和不完整的细胞的方法、所述方法的检测系统，以及涉及一些新的化合物和包括这些化合物和核酸的荧光复合物。本发明在细胞和其它生物材料的分析中具有广泛应用，尤其但不限于，涉及一种类型的不渗透细胞的荧光染料及其用途。用于测定样本的细胞浓度和活力的方法(包括在非固定的细胞样品中识别细胞完整性，以及在固定的和可渗透的细胞样品中染色核材料)常规用于生命科学和医疗工业中。鉴定与形态学、生物化学和分子变化(其倾向于、优先于以及伴随细胞死亡(例如坏死或凋亡))有关的过程的能力在生命科学具有广泛的关注。分子探针技术(其容易在流式细胞仪和显微镜平台上进行，允许在未接受先前固定的细胞样品中进行所述过程的细胞水平研究)尤其引起关注(Darzynkiewicz, Juan等.1997)。已经开发了多种基于突光染料的染色方案，用于流式细胞和显微分析真核细胞和细菌的活力。活/死细胞分析已经先前探索了完整的或代谢活性的细胞防止比色或荧光染料穿透至一个或多个细胞腔隙的能力。在高等真核生物中，该性质主要涉及质膜的完整性，而在低等真核生物、原核系统和植物中，细胞壁组成和破坏也可影响染料穿透和行为。已经公开了从活细胞状态至死细胞状态的过渡期，但其经常在不同类型的细胞和所涉及的过程的速度和形式之间存在差别。认为活的、完整的或有活力的细胞为如下细胞其同时保留一定程度的代谢功能和质膜完整性，但不必然意味着具有增殖能力。质膜完整性的丧失，而非其它膜重组的过程，是细胞死亡过程中的临界点，并且导致细胞在细胞的内环境与外环境之间显示增强的或自由的分子(根据它们的具体性质)通道的可能。在细胞死亡过程中，膜重组的实例表现为膜联蛋白V分子与细胞表面的结合增强，但是需要与膜联蛋白V与具有破裂的膜的细胞(所述细胞代表了与不渗透细胞的染料的正染色有关的细胞死亡晚期)的结合相区别。显示受损的膜完整性的细胞可以描述为无活力的或不完整的细胞，并且认为包括死的、可渗透的或死亡中的细胞，其显示了膜破裂的特征。该临界转变点可以通过不渗透活细胞的染料的进入增加得以鉴定，提供了细胞死亡的功能性定义和一种分析方法。优选地，所述染料具有结合至残留的细胞内结构的能力，因此优先蓄积在细胞群中的不完整的细胞内。应当理解，在细胞死亡过程中相对长期保留了携带残留核酸的结构，而细胞单位最终分解为多个碎片通常鉴定为残骸(debris)。活体染料也可用于检测和因此选择细胞群。这特别有利于需要保留活的、非受损的细胞的功能的分析。一种方法为通过检测活跃的细胞代谢正面评价活力，所述细胞代谢可以通过渗透细胞的非-荧光底物在细胞内转化为强荧光产物测定，所述强荧光产物优先保留在完整的细胞内(例如通过细胞内非-特异性酯酶活性的醋酸荧光素代谢)，因此正识别有活力的部分。在该情况下，排除具有受损的完整性的细胞用于增强来自所述分析的信息的有效性。另一方面，不渗透活细胞的染料将进入膜受损的细胞中，所述细胞为死细胞 或处于凋亡或细胞死亡的晚期。在不渗透细胞的DNA结合染料的情况下，染料进入和随后与细胞内残留的核酸的相互作用用于报道给定细胞的膜的受损状态。在该情况下，所述细胞内染料与残留的核酸(优选DNA)之间的‘复合物’为报道原理(reporting principle)。在该情况下，所述试剂不再被这些细胞排出，而且现在具有复合物形成的可及性，因此提供了对活力的负染色和对受损的细胞的正染色。应当理解，细胞样品也可使用固定方法处理，以允许细胞特征的分析作为生命科学中所用的大量技术的一部分。所述固定方法和细胞渗透方法可以改变，但经常导致允许不渗透活细胞的染料进入的膜改变。优选通过获取与染料高亲和力结合至细胞内核酸有关的荧光信号指示染料进入，并且常常认为染料进入得到结合后荧光增强协助。不定地结合至核酸的不渗透细胞的(和渗透细胞的)荧光染料为一大类分子探针，其广泛用于生物科学，并可容易地获自商品供应商。这些试剂的所寻求的特征包括核酸选择性、激发和发射特性、量子产率、结合后荧光增强的可能、在水性环境中的性能、从非 受损的细胞排出的程度(对活力提供负染色，并对细胞死亡提供正染色)或对于完整的细胞分析的穿透至完整的细胞的速度。具体染料的选择通常由与掺入分析的其它荧光团的光谱重叠程度以及对选择性或最佳激发方便的光源的可用性来确定。由于细胞死亡的过程常常包括细胞性质随扩展的期间时限(几分钟至几天)连续获得改变，因此有必要确保不渗透细胞的染料具有可忽略的毒性，使得给定染料的连续存在不会影响报道分析中活力的丧失。所述非-毒性的不渗透细胞的染料优选用于连续监测长期分析中的活力的丧失。众所周知，在具有变化的结构完整性水平的细胞中，细胞染色质被渗透和非-渗透染料突光染色的性质的程度复杂且不容易预测(Wlodkowic, Skommer等.2007)。发生细胞死亡过程的细胞(允许其它不渗透细胞的指示剂染料进入细胞)也发生了细胞结构变化(不仅是染色质构象)。经常观察到凋亡的细胞核被吸收阳离子染料深色染色，而对于许多DNA荧光染料凋亡的细胞核常常表现暗淡。目前的理解是，早期的凋亡细胞的染色质对阳离子染料的增强的亲和力与构象松弛而非DNA降解有关(Erenpreisa, Freivalds等.1997)。在晚期的凋亡细胞中，降解的DNA的非常致密的包装促进影响荧光性质的染料进一步聚集(Erenpreisa, Freivalds 等.1997)。靶向核酸的染料对细胞的荧光染色因此是细胞状态、渗透性质、染料结合特异性、染料结合方式以及染料-染料相互作用的复杂模型(complexmatrix)。为了在基于细胞的分析中消除该问题，常规方法已经倾向于高荧光增强和高量子产率的染料。在核酸染色中已经发现了大量不渗透细胞的染料的用途。最常使用的实例为碘化丙啶(PD。强荧光的PI信号具有检测简单和灵敏的优点，但当该荧光染料掺入多色分析中时具有缺点。另外，PI具有在UVA(例如365nm)波长和被蓝光(例如488nm)波长激发的能力，当有差别的激发用于区分荧光分析物或通过荧光探针检测的分析物时，其应用变得复杂。PI不具有用于方便分析细胞染色的比色特征。尤其是，在邻近分析PI的峰发射区域的可见光谱部分收集到的信号中，必须应用补偿，以解决I益出’。此外，PI的荧光发射可能处于以下光谱区域，在该区域中来自荧光分析物或者通过荧光探针检测的分析物的发射可能需要区分。PI提供了一些如同在红外区(red region)和之外区域(例如>620nm波长)发射的不渗透活细胞的染料的光谱优点。
应当理解，结合至DNA的PI的高荧光强度经常需要以对数标度分析从细胞群中获得的荧光信号，其为鉴定细胞亚群提供了广阔的动态范围。US 5，057，413教导了使用渗透细胞的核酸染料LDS-751，其中基于发射出的荧光的量，对DNA的偏好区分了受损的和完整的细胞。在其它实例中，在白细胞标记(CD45)的表达的流式细胞的白血病/淋巴瘤评估中，使用染料7-AAD(具有低的完整细胞渗透性质)能够区分完整的和死的细胞，避免了非-特异性染色的缺陷(Shenkin，Babu等.2007)。在另一实例中，美国专利申请20070082377公开了使用不渗透细胞的DNA染料7-AAD作为多参数分析的组成部分，其也利用了作为膜染料的荧光探针，以及作为渗透细胞的凋亡-检测探针的荧光探针(其结合至活跃的半胱天冬酶)。所述方法允许了区分死的或坏死的细胞(使用活体染料7-AAD检测；当该染料结合或嵌入DNA时，其可例如经过与核酸结合后荧光增强的过程得以检测)和特征在于修饰的半胱天冬酶活性的凋亡的细胞。利用渗透细胞的和不渗透细胞的染料的‘双重染料’分析是已知的(Giao，Wilks等，2009 ；Biggerstaff, Le Puil 等，2006 ；Lehtinen, Nuutila 等 2004 ；fflodkowic and Skommer, 2007a ；fflodkowic and Skommer, 2007b) 常常优化所用染料的个别性能，并有效避免相互作用，使得细胞可以准确报道渗透特性。上面讨论的双重染料阵列分别地具有多种缺点和不利性质，其与应用的精确系统有关。然而，毫无例外地，在双重染料分析中也存在基本问题，即直接结合渗透细胞的核酸染料也将染色具有受损的或破裂的膜的细胞中的核酸。获自如上所述的渗透细胞的和不渗透细胞的染料的信号的动态范围提供了方便的分析方法。此外，存在持续的提高荧光染料分析细胞和其它生物材料的有用性质的需要。在至少一些实施方式中，本发明解决了上述问题和需要。尤其是，在至少一些实施方式中，本发明提供了改进的不渗透细胞的染料，而且提供了能够使用不渗透细胞的和渗透细胞的染料进行活/死细胞识别的改进的系统。在一些实施方式中，本发明提供了在远红外(例如>660nm波长或>690nm波长)具有优选的发射并在橙色/红色光谱区域(例如>530<620nm波长)具有减少的发射的不渗透细胞的染料。根据本发明的第一方面，提供式(I)化合物
+
X, O NR1-A-NR2R3R4
I Il T I (Zm')1/m
火 2 d X1(I)其中A为C2_8亚烷基洱1、! 2、! 3和R4独立地选自氢、Ch烷基、C2_4 二羟基烷基，其中连接至氮原子的碳原子不携带羟基且没有碳原子被两个羟基取代，或R2和R3 —起形成C2_6亚烷基，其与R2和R3连接的氮原子形成杂环；X1' X2 和 X3 独立地选自氢、羟基、NR1-A-NR2R3R4+ (ZmO 1/ηι、卤代氨基(halogenoamino)、C^4烧氧基或C2_8烧酸基氧基；且
(Zn 1/ni为具有m电荷的阴离子；或者其中基团NR1被季铵化的衍生物。优选地，m为I。当用作分析细胞和其它生物材料的染料时，这些化合物的至少一些具有许多优点。所述优点包括·水溶性，用于在与基于细胞的分析常用的等渗缓冲条件相容的一系列浓度范围方便地掺入分析。·化学纯度和稳定性，用于在多重分析内可重现的使用并方便保存。·红色/远红荧光性质，用于方便地掺入多参数分析中，该多参数分析具有很少有 光谱重叠或不具有光谱重叠的可见范围荧光或橙色荧光，以容易与红色荧光一起使用。·高亲和力核酸结合性质，用于需要分析有核细胞的应用。·结合核酸后非-增强的荧光，其确保荧光发射强度与DNA结合程度之间的已知程度的化学计量。 低内源荧光，其提供未结合的染料的背景荧光的相对降低，对比于核结合后增强的信号(归因于结合的分子的集中的浓度)。·不渗透细胞的性质，用于选择性和正性染色具有受损的膜或不能排出染料分子的细胞。·在固定的细胞中识别细胞核的性质，其用作所有有核细胞的直接DNA染料，并且通过成像或流式细胞仪或其它检测平台检测荧光发射。·对完整的细胞的低毒性，其使得染料可以在生物应用期间与细胞共同培养延长的时间，而无有害作用，例如抑制增殖。·上述性质的组合，其允许了时间相关性分析细胞完整性的丧失，所述细胞完整性通过将细胞与不渗透细胞的染料培养不同的时间进行监测，以及允许了不定期取样相同细胞群，用于检测细胞染色。本发明提供了季铵化的氨基烷基氨基蒽醌化合物，其可尤其用作荧光染料。季铵化的氨基烷基氨基取代基存在于至少I位。其它季铵化的氨基烷基氨基取代基可以存在于
4、5或8位，或其组合。国际公布W091/05824和W099/65992 (将它们二者的全部内容在此引入参考)公开了多种类型的氨基烷基氨基蒽醌化合物，其可用作合成本发明化合物的前体。优选地，X1, X2和X3中至少一个为NR1-A-NR2R3R4+ (Zm_) 1/m。在尤其优选的实施方式中，X2 (而非X1和X3)为NR1-A-NR2R3R4+ (Zm_) 1/m，即在1，5位被季铵化的氨基烷基氨基取代的蒽醌。在另一优选的化合物类型中，X1 (而非X2和X3)为NR1-A-NR2R3R4+ (Zm_) 1/m，即在1，4位具有季铵化的氨基烷基氨基取代基的蒽醌。1，8取代的类似物也可能存在。有利地，X1和X3均为羟基。在其它优选的实施方式中，X1和X3均为氢。优选地，R1为氢，尽管可能使用其中在该位置的氨基部分为叔胺的化合物。在这些实施方式中，优选R1为Cy烷基。优选R2、R3和R4为Ch烷基。有利地，R2、R3和R4为甲基。
在优选的实施方式中，A为(CH2)2。在一个特别优选的实施方式中，所述化合物为式(IA)
权利要求
1.式⑴化合物
2.权利要求I的化合物，其中XpX2和X3中至少一个为NR1-A-NR2R3R4+(Zm_)1/m。
3.权利要求2的化合物，其中X2,而非X1和X3,为NR1-A-NR2R3R4+(Zm_) 1/m。
4.上述权利要求中任一项的化合物，其中X1和X3均为羟基。
5.权利要求I至3中任一项的化合物，其中X1和X3均为氢。
6.上述权利要求中任一项的化合物，其中R1为氢。
7.上述权利要求中任一项的化合物，其中R2、R3和R4为Cy烷基。
8.权利要求7的化合物，其中R2、R3和R4为甲基。
9.上述权利要求中任一项的化合物，其中A为(CH2)2。
10.式(IA)化合物
11.式(IB)化合物
12.荧光复合物，其包含核酸和式(I)化合物
13.权利要求12的复合物，其中所述核酸为DNA。
14.权利要求13的复合物，其中所述DNA存在于细胞内。
15.权利要求14的复合物，其中所述DNA存在于不完整的细胞内。
16.一种分析细胞或含有核酸的其它生物材料的样品的方法，所述方法包括以下步骤 a)制备含有式(I)化合物的生物相容的溶液
17.权利要求16的方法，其中所述与式(I)化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质为荧光，且步骤c)包括用电磁辐射激发所述式(I)化合物，并检测放射出的荧光信号。
18.权利要求16的方法，其中所述与式(I)化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质为色度性质。
19.权利要求16至18中任一项的方法，其用于识别细胞样品中的细胞核，其中进行步骤b)以使得细胞核中的核酸被所述式(I)化合物结合，且细胞核的识别至少部分地基于步骤C)中检测的光谱学性质。
20.权利要求16至19中任一项的方法，其中进行步骤b)以将细胞样品用式(I)化合物染色。
21.权利要求20的方法，其中监测到细胞死亡增加，其中在测试期之前或期间进行步骤b)，因此使得在测试期期间连续或频繁地读出细胞死亡增加。
22.权利要求17或从属于权利要求17的权利要求18至21中任一项的方法，其中步骤c)包括通过流式细胞仪检测个体细胞发射出的荧光。
23.权利要求17或从属于权利要求17的权利要求18至21中任一项的方法，其中步骤c)包括通过荧光显微镜进行细胞内定位检测。
24.权利要求16至23中任一项的方法，其用于分析固定的或渗透化处理的细胞，其中所述细胞的样品通过使用固定剂或渗透剂处理而固定。
25.权利要求16至24中任一项的方法，其中步骤b)还包括用至少一种其它荧光染料或发光化合物处理该样品，且步骤c)还包括检测与该荧光染料或发光化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质。
26.权利要求25的方法，其用于识别完整的细胞和不完整的细胞，其中所述式(I)化合物不渗透细胞，步骤b)还包括用渗透细胞的第二荧光染料或发光化合物处理该样品，且步骤c)还包括检测与第二荧光染料或发光化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质，其中所述与式(I)化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质的检测与存在不完整的细胞相关联，且所述与第二荧光染料或发光化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质的检测与存在完整的细胞相关联。
27.权利要求26的方法，其中所述第二荧光染料或发光化合物具有与识别的细胞中的核酸和/或其它大分子材料的结合能力，该结合能力低于式(I)化合物的结合能力，并因此在式(I)化合物的存在下，较不有效地竞争结合识别的细胞中的核酸和/或其它大分子材料，使得所述第二荧光染料或发光化合物基本上排除与不完整的细胞结合或被式(I)化合物掩蔽。
28.权利要求26或权利要求27的方法，其中所述第二荧光染料或发光化合物为式(II)化合物
29.权利要求28的方法，其中X2,而非X1和X3,为NR1-A-NR2R30
30.权利要求26至29中任一项的方法，其中在将细胞样品暴露于为潜在毒性或者能够诱导细胞死亡的试剂后，进行完整的和不完整的细胞的识别，以监测所述试剂对细胞样品的影响。
31.权利要求26至30中任一项的方法，其中步骤b)还包括使用至少第三荧光染料或发光化合物处理该样品，且步骤c)还包括检测与所述至少第三荧光染料或发光化合物吸 收电磁辐射有关的光谱学性质，并将所述光谱学性质与完整的细胞和/或不完整的细胞的特征或性质关联。
32.权利要求31的方法，其中检测的所述第三荧光染料或发光化合物的光谱学性质与检测的所述式(I)化合物的光谱学性质相似，且不同于检测的所述第二荧光染料或发光化合物的光谱学性质，其中检测的所述第三荧光染料或发光化合物的光谱学性质与完整的细胞的特征或性质有关。
33.权利要求31的方法，其中检测的所述第三荧光染料或发光化合物的光谱学性质与检测的所述第二荧光染料或发光化合物的光谱学性质相似，且不同于检测的所述式(I)化合物的光谱学性质，其中检测的所述第三荧光染料或发光化合物的光谱学性质与不完整的细胞的特征或性质相关联。
34.权利要求26至33中任一项的方法，其中步骤c)中检测的光谱学性质为电磁波谱的预定区域中的发射荧光，且步骤c)包括用电磁辐射激发式(I)化合物、所述第二和任选地所述第三和任何其它荧光染料或发光化合物。
35.权利要求34的方法，其中所述式(I)化合物、所述第二和任选地所述第三荧光染料或发光化合物被单一来源的电磁辐射共同激发。
36.权利要求35的方法，当从属于权利要求32时，其中所述第三荧光染料或发光化合物 发射出的荧光位于电磁波谱的预定区域内，其i)与所述式(I)化合物发射出的荧光的区域相似，优选位于红色和/或近IR区域，和ii)不同于所述第二荧光染料或发光化合物发射出的荧光的区域。
37.权利要求35的方法，当从属于权利要求33时，其中所述第三荧光染料或发光化合物发射出的荧光位于电磁波谱的预定区域内，其i)与所述第二荧光染料或发光化合物发射出的荧光的区域相似，优选位于橙色区域，和ii)不同于所述式(I)化合物发射出的荧光的区域。
38.权利要求26至37中任一项的方法，其中步骤c)使用流式细胞仪进行。
39.权利要求26至38中任一项的方法，其中步骤c)还包括测量来自细胞的光散射。
40.一种识别完整的和不完整的细胞的方法，所述方法包括以下步骤 a)制备含有不渗透细胞的荧光染料或发光化合物的生物相容的溶液； b)制备含有渗透细胞的荧光染料或发光化合物的生物相容的溶液，该荧光染料或发光化合物具有与识别的细胞中的核酸和/或其它大分子材料的结合能力，该结合能力低于不渗透细胞的荧光染料或发光化合物的结合能力，并因此在不渗透细胞的荧光染料或发光化合物的存在下，较不有效地竞争结合至识别的细胞中的核酸和/或其它大分子材料，使得所述渗透细胞的荧光染料或发光化合物基本上排除与不完整的细胞结合或被不渗透细胞的荧光染料或发光化合物掩蔽； c)用所述的一种或多种生物相容的溶液处理该细胞样品；和d)检测与不渗透细胞的荧光染料或发光化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质，且将其与不完整的细胞的存在关联，并检测与渗透细胞的荧光染料或发光化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质，且将其与完整的细胞的存在关联。
41.检测系统，其用于权利要求26至40中任一项的方法，所述系统包括 一个或多个电磁辐射源，用于激发所述方法中使用的荧光染料和发光化合物； 多个检测器，用于检测与荧光染料和发光化合物吸收电磁辐射有关的光谱学性质；以及 检测器分析系统，适于将检测的光谱学性质与完整的和不完整的细胞的存在关联，因此识别完整的和不完整的细胞。
42.权利要求41的检测系统，其中所述检测器为荧光检测器。
43.权利要求41或权利要求42的检测系统，其具有单一来源的电磁辐射，用于共同激发所述荧光染料和发光化合物。
44.权利要求41至43中任一项的检测系统，其中所述多个检测器为一对检测器的形式，其检测所有荧光染料和发光化合物的光谱学性质。
45.组合物，其包含权利要求I的化合物与至少一种第二荧光染料或发光化合物的混合物。
46.试剂盒，其用于进行权利要求16至39中任一项的方法，其包括权利要求I的化合物，以及有关的容器和试剂。
47.制备权利要求I的化合物的方法，其包括以下步骤提供式(I)化合物的氨基烷基氨基前体化合物；并季铵化所述氨基烷基氨基前体化合物。
全文摘要
本发明提供式(I)化合物，其中A为C2-8亚烷基；R1、R2、R3和R4独立地选自氢、C1-4烷基、C2-4二羟基烷基，其中连接至氮原子的碳原子不携带羟基且没有碳原子被两个羟基取代，或者R2和R3一起形成C2-6亚烷基，其与R2和R3连接的氮原子形成杂环；X1、X2和X3独立地选自氢、羟基、NR1-A-NR2R3R4+(Zm-)1/m、卤代氨基、C1-4烷氧基或C2-8烷酰基氧基；且(Zm-)1/m为具有m电荷的阴离子；或者其中基团NR1被季铵化的衍生物。
文档编号C12Q1/02GK102947266SQ201180028424
公开日2013年2月27日 申请日期2011年4月8日 优先权日2010年4月9日
发明者P.J.史密斯, R.J.厄林顿, L.H.帕特森 申请人:生物状态有限公司