专利名称：无毛nod scid小鼠的制作方法
技术领域：
本公开内容概括而言涉及生物医学研究。更具体地，本公开内容涉及具有用于生物医学研究的遗传优势的小鼠。 背景和简述
在小鼠和大鼠中有数以百计的病理学突变体，其中的许多是为了生物医学研究的目的。突变小鼠通常用于专门的研究和开发项目。突变小鼠可用远交或近交遗传背景维持，其性质赋予遗传优势或劣势。例如,远交HsdCpb:NMRI背景下的无胸腺裸基因产生相对强壮的动物，而在具有BALB/cOlaHsd背景下的小鼠中相同突变产生不太强壮的动物。Prkdcscid为编码DNA活化蛋白激酶(Prkdc)催化亚基的基因的突变，导致重度联合免疫缺陷(scid)(综述见Bosma和Carroll，1991)。其为常染色体隐性突变，由于产生B和T细胞受体所必需的可变、多样和连接的(VDJ)重组酶系统缺陷使B细胞和T细胞祖细胞分化中断。Prkdc突变的小鼠缺乏Thy-I阳性树突表皮细胞。与裸鼠不同的是，
突变小鼠具有胸腺和淋巴结。非肥胖糖尿病(NOD)小鼠为I型糖尿病动物模型，其显示对自身免疫性T细胞介导的胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)自发发生的易感性。NOD品系和相关品系由Makino及其同事在日本Aburahi的Shionogi研究实验室开发，并且在1980年首次报道(Makino等，1980)。此外，NOD品系通常特征在于自然杀伤(NK)细胞功能缺陷、骨髓发育和功能以及抗原呈递细胞(APC)分化和功能缺陷、抑制溶血补体的经典和替代途径的C5缺陷(Greiner等，1998)。携带/突变的小鼠品系虽然显示B和T细胞功能缺乏，但表现出正常水平的NK细胞、溶血补体和骨髓功能。此外，随小鼠变老各种背景品系的突变体产生低水平的免疫球蛋白和功能性T细胞，这一现象被称为“渗漏(leakiness)”。这些先天免疫性质对某些研究应用，特别是人肿瘤细胞系的移入是不利的。Prkdcscid突变已经由C. B-17背景转移至糖尿病易感的非肥胖性糖尿病(NOD)背景，被称为NOD scid.与通常的NOD小鼠不同的是，自身免疫性糖尿病并非由于T细胞功能缺乏而发生。NOD scid小鼠的特征进一步在于NK细胞功能缺陷、巨噬细胞缺陷和可检测的溶血补体缺乏(Greiner等，1998)。此外，与多种遗传背景下的其它scid小鼠相比，由VDJ重组酶活性的不完全阻断(其导致残留B和T细胞活性)引起的纯合scid小鼠的“渗漏”表型在本模型中被抑制。这些特征对涉及移植细胞的长期生长的研究是有利的。例如，人细胞系例如PC-3、DU145以及⑶-34阳性干细胞可在NOD scid小鼠中有效地长期生长，但在NK细胞功能、巨噬细胞和循环补体(其可影响肿瘤生长或人干细胞移入)正常的其它scid小鼠中不能。NOD scid小鼠的免疫概况使其可用于肿瘤学、免疫学、血液学、HIV病理学和其它领域的生物医学研究。尽管适合多数应用，但NOD scid小鼠显示的一些特征可对某些研究目的不利。例如，NOD scid小鼠具有白化毛的完全皮毛，因此在接种细胞前须将毛刮去，随后的肿瘤显示和成像比无毛模型困难。此外，甚至在刮去有 毛小鼠的毛后，也残留毛囊，这可产生自身荧光，干扰使用生物发光和荧光报告物的成像研究。与裸鼠不同，无毛纯合突变体缺乏毛囊(Lyon等，1996)，因此消除了其它异种移植模型中出现的毛囊自身荧光。本文描述了 NOD SCid小鼠的改进，其如下进行JfNOD scid小鼠与携带无毛基因(Nr)突变的小鼠杂交并与NOD scid遗传背景回交得到无毛NOD scid小鼠品系。本文公开的无毛NOD scid小鼠对异种移植、自发性肿瘤、癌细胞肿瘤发生、肿瘤血管发生、肿瘤转移潜能、肿瘤抑制治疗、致癌调控、肿瘤成像和人干细胞移入的研究尤其有利。考虑下述多个实施方案
I)非肥胖糖尿病(NOD)背景下具有B细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞和补体缺陷的无毛、免疫缺陷小鼠。2)条款I的小鼠，其中所述小鼠为等位基因纯合的。3)条款2的小鼠,其中所述/ 士/c等位基因为(Prkdccld) 04)条款1-3中任一项的小鼠，其中所述小鼠为I等位基因纯合的。5)条款4的小鼠，其中所述汝等位基因为Ar (Jirhr)06)条款1-5中任一项的小鼠，其中所述非肥胖糖尿病背景为NOD. QMl-Prkdcscid。7)条款1-5中任一项的小鼠，其中非肥胖糖尿病背景为NOD. Cmi-Prkdcscid/NCrHsd08)条款1-7中任一项的无毛小鼠，进一步具有树突细胞缺陷，其中所述树突细胞缺陷为与相同背景的非无毛免疫缺陷小鼠相比树突细胞的数目减少。9)生产非肥胖糖尿病(NOD)背景下无毛、免疫缺陷小鼠的方法，所述方法包括
(a)将等位基因纯合的NODscid小鼠品系与/Zr等位基因纯合的第二小鼠品系杂交，以产生I等位基因和等位基因均杂合的子代；
(b)将步骤(a)产生的杂合子代与NODscid小鼠互交；
(c)选择步骤(b)中等位基因纯合并具有更类似于NODscid的基因型的后代；
(d)将步骤(c)中选择的后代与/Zr等位基因纯合或杂合的小鼠杂交。10)条款9的方法,其中所述等位基因为(Prkdcscld)。11)条款9-10中任一项的方法，其中所述I等位基因为Ar Qlrhr)。12)条款9-11中任一项的方法，其中使用以下方法对步骤(a)产生的子代进行基因型分析
单核苷酸多态性等位基因鉴别(discrimination)、聚合酶链反应和单核苷酸多态性概况分析(profiling)。13)条款9-12中任一项的方法，其中步骤(a)和(b)的NOD scid小鼠为N0D.CBHtdTMcsW 小鼠。14)条款9-12中任一项的方法，其中步骤(a)和(b)的NOD scid小鼠为N0D.CB17-Prkdcscid/}\CrWsd-PrkcIcSCId 小鼠。
15)条款9-14中任一项的方法，其中步骤(a)的第二小鼠品系为MF_l_Ar小鼠。附图简述
图I显示雄性和雌性NOD scid和Hr NOD scid小鼠的肠系膜淋巴结(上部)和脾(下部)的组织切片。图2显示⑶49b的流式细胞术(FACS)结果的点图。象限中的数字为平均百分比。图3显示⑶Ilc的流式细胞术(FACS)结果的点图。象限中的数字为平均百分比。图4显示⑶3e和⑶49b的流式细胞术(FACS)结果的点图。象限中的数字为平均百分比。图5显示⑶3e和⑶49b的流式细胞术(FACS)结果的点图。象限中的数字为平均百分比。图6显示⑶3e和⑶8 α的流式细胞术(FACS)结果的点图。象限中的数字为平均百分比。图7显示⑶49b的流式细胞术(FACS)结果的点图。象限中的数字为平均百分比。图8显示⑶49b的流式细胞术(FACS)结果的点图。象限中的数字为平均百分比。图9显示从异种移植入Hr NOD scid小鼠中的人套细胞淋巴瘤细胞系JEK0-1的肿瘤发生。
图10显示从异种移植入无胸腺裸鼠中的人套细胞淋巴瘤细胞系JEK0-1的肿瘤发 生。图11显示从异种移植入无全身照射的Hr NOD scid小鼠中的人大细胞淋巴瘤细胞系KARPAS-299的肿瘤发生。发明详述
尽管本发明可以有各种修饰和替代形式，但本文将详细描述特定实施方案。然而，应理解的是，其无意将本发明限制在所描述的特定形式，恰恰相反，意图是涵盖落入本发明范围的所有修饰、等同物和替代方案。说明书全文中使用的以下术语意欲具有下列含义
如本文所使用的，短语“更类似于NOD scid”指在特定的世代中具有比同代其它小鼠更类似NOD scid品系的基因型的小鼠。其可例如，通过单核苷酸多态性分析定量。本文公开了无毛NOD scid小鼠的生产。无毛NOD scid小鼠对于利用异种移植、自发性肿瘤、癌细胞肿瘤发生、肿瘤血管发生、肿瘤转移潜能、肿瘤抑制治疗、致癌调控、肿瘤成像和人干细胞移入的生物医学研究和开发实验尤其有利。NOD scid 小鼠
突变已经从C.B-17背景转移至糖尿病易感的非肥胖糖尿病(NOD)背景，被称为NOD scid。NOD scid突变小鼠由国家癌症研究所(National Cancer Institute),Frederick, Maryland 于 2004 从国立卫生研究院(National Institutes of Health),Bethesda, Maryland接收。NOD scid具有影响T细胞和B细胞发育的重度联合免疫缺陷(scid).与典型NOD小鼠不同的是，自身免疫性糖尿病不因为T细胞功能缺乏而发生。NODscid小鼠的特征进一步在于具有NK细胞功能缺陷、巨噬细胞缺陷以及无循环补体。NODscid小鼠对机会致病菌易感，并且具有随年龄增加的胸腺淋巴瘤发病率。无毛(Hr)小鼠纯合的Qir/hr)小鼠具有正常的皮毛，直至约10天龄，此时开始脱毛。尽管稀疏的毛生长以每月一次的间隔出现，但小鼠在5-6周龄时基本为无毛的。完整的毛从毛囊消失(Crew和Mirskaia，1931)。触须重复脱落，并且随年龄增长变得更加异常。无毛基因为甲状腺激素应答基因和甲状腺激素受体的辅阻遏物，介导甲状腺激素在脑和皮肤的作用(Potter等，2001)。这些小鼠的趾甲往往长而弯曲。一般而言，维持无毛小鼠不需要特殊的饲养程序。除了偶尔的皮肤脓肿，其对感染的易感性通常不增加。然而，无毛小鼠确实有轻度免疫缺陷，可能是由于T-辅助细胞缺陷(Reske-Kunz等，1979)。与A/>々小鼠相比,Ar/fer具有高白血病发病率(Heiniger等，1974)并伴随免疫缺陷和受损的移植物抗宿主(GVH)反应(L’Anson和Gasser，1973)。无毛小鼠中缺陷的免疫功能与淋巴瘤发生的关联可由于该突变体对同源淋巴瘤细胞和纯化小鼠白血病病毒(MuLV)的免疫反应降低(Johnson和Meier，1981)。此外，已证明该突变体的脾T细胞对I区同种异体抗原的增殖反应降低(Morrissey等，1980)。此夕卜，已经发现在脾中Ly-I+和Ly-123+ T细胞的正常比例反转(Reske-Kunz等，1979)。·从组织病理学上看，从约14天开始无毛小鼠毛管上部的复层上皮角化过度。杵状毛(Hair club)形成是异常的，且内部根鞘在毛干末端部分周围聚结，使毛鞘下部不能随杵状毛上升而上升，进而滞留在真皮。胞囊从两个源头发育，即角化过度的毛管上部和滞留在真皮的异常毛囊的鞘(Fraser，1946 ;Mann，1971)。Fukui等，1975描述了无毛小鼠中的肾小球变化。无毛小鼠可生育，但大多数雌性不能很好地哺乳其幼仔。最有效的繁育系统使用纯合的突变体雄性和杂合的雌性(ILAR，1989)。NK细胞、巨噬细胞和补体功能的存在可影响肿瘤细胞植入后的初期肿瘤生长和转移扩散。各种造血癌细胞系在不同动物模型中的肿瘤生长速率的比较研究显示在B细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞和补体缺陷的模型中获得较好的生长速率，如在无毛NOD scid小鼠模型中出现的。此外，相对于其它原位小鼠模型，无毛NOD scid小鼠具有高转移潜能。无毛NOD scid小鼠是异种移植和人源化研究的有用模型，并且与其它遗传背景的scid突变体相比具有遗传和表型优势。在一个实施方案中，公开了非肥胖糖尿病(NOD)背景的无毛、免疫缺陷小鼠。该无毛免疫缺陷小鼠具有B细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞和补体缺陷。此外，该无毛免疫缺陷小鼠出人意料地具有树突细胞缺陷，其中与有毛的NOD scid小鼠相比，无毛NOD scid小鼠的树突细胞数目减少。树突细胞的减少导致更大程度的免疫缺陷，其对于涉及异种移植、自发性肿瘤、癌细胞肿瘤发生、肿瘤血管发生、肿瘤转移潜能、肿瘤抑制治疗、致癌调控、肿瘤成像和人干细胞移入的实验可为有利的。
实施例实施例选择育种以生产无毛NOD scid小鼠
按照表I所示繁育小鼠。概括来说，其步骤如下(突变等位基因的存在用符号+表示)步骤⑴用纯合的NOD scid {Prkdc +/+)小鼠繁育纯合的无毛(/Zr勹小鼠。优选/Zr小鼠为雄性，这是因为Hr雌性可显示较差的母性特征。步骤I产生的Fl小鼠全部为杂合的-,Hr+/_。步骤(2):选择NOD scid杂合雄性，将其与NOD scid Prkdc +/+纯合雌性回交。N2小鼠为基因型的混合。通过PCR检测后代中/Zr基因的存在情况，通过单核苷酸多态性等位基因鉴别检测后代中基因的存在情况，通过单核苷酸多态性概况分析检测后代中NOD scid遗传背景。步骤(3):选择具有至少80. 8% NOD scid遗传背景并且纯合(Prkdc +/+)和 杂合(Jlr +/1的雄性和雌性，相应地用NOD scid雄性或雌性繁育它们。步骤⑷通过PCR检测后代中汝基因的存在情况，通过单核苷酸多态性概况分析检测后代中NOD scid遗传背景。选择具有至少94% NOD scid遗传背景并且/^知/c纯合(PrAdc +/+)和杂合Qir +/1的雄性和雌性，相应地用NOD scid雄性或雌性繁育它们。步骤(5):通过PCR检测后代中I基因的存在情况，通过单核苷酸多态性概况分析检测后代中NOD scid遗传背景。选择具有至少99% NOD scid遗传背景并且/^知/c纯合 (PrAdc +/+)和杂合Qir +/1的雄性和雌性，相应地用NOD scid雄性或雌性繁育它们。步骤(6):通过PCR检测后代中I基因的存在情况，通过单核苷酸多态性概况分析检测后代中NOD scid遗传背景。选择具有基本上100% NOD scid遗传背景并且纯合{Prkdc +/+)和杂合Qlr +勺的雄性和雌性，相应地用NOD scid雄性或雌性繁育它们。步骤(7):繁育步骤6得到的小鼠以建立无毛NOD scid群体。Prkdc叛令(Prkdc+/+)和汝纯合(Jlr +/+)的雄性可用纯合(Prkdc +/+)和汝纯合Qir +/+)或杂合Qir+/1的雌性繁育。表I :生产无毛NOD scid小鼠的繁育图解
权利要求
1.非肥胖糖尿病(NOD)背景下的无毛、免疫缺陷小鼠，其具有B细胞、T细胞、NK细胞、巨 噬细胞和补体缺陷。
2.权利要求I的小鼠，其中所述小鼠为等位基因纯合的。
3.权利要求2的小鼠，其中所述等位基因为scid(Prkdccld)。
4.权利要求1-3中任一项的小鼠，其中所述小鼠为/Zr等位基因纯合的。
5.权利要求4的小鼠，其中所述I等位基因为ArQirhr).
6.权利要求1-5中任一项的小鼠，其中所述非肥胖糖尿病背景为NOD.QMl-Prkdcscid。
7.权利要求1-6中任一项的无毛小鼠，进一步具有树突细胞缺陷，其中所述树突细胞缺陷为与相同背景而非无毛的免疫缺陷小鼠相比树突细胞的数目减少。
8.生产非肥胖糖尿病(NOD)背景下的无毛、免疫缺陷小鼠的方法，所述方法包括 (a)将等位基因纯合的NODscid小鼠品系与/Zr等位基因纯合的第二小鼠品系杂交，以产生I等位基因和等位基因均杂合的子代； (b)将步骤(a)产生的杂合子代与NODscid小鼠互交；(c)选择步骤(b)中等位基因纯合并具有更类似于NODscid的基因型的后代； (d)将步骤(c)中选择的后代与/Zr等位基因纯合或杂合的小鼠杂交。
9.权利要求8的方法，其中所述等位基因为scid(Prkdcscld)。
10.权利要求8-9中任一项的方法，其中所述I等位基因为ArQirhr)。
11.权利要求8-10中任一项的方法，其中使用选自以下的方法对步骤(a)产生的子代进行基因型分析 单核苷酸多态性等位基因鉴别、聚合酶链反应和单核苷酸多态性概况分析。
12.权利要求8-11中任一项的方法，其中步骤(a)和(b)的NODscid小鼠为N0D.CBHtdTMcsW 小鼠。
13.权利要求8-12中任一项的方法，其中步骤(a)的第二小鼠品系为MF-I-Ar小鼠。
全文摘要
本文公开了非肥胖糖尿病(NOD)背景下的无毛、免疫缺陷小鼠及其生产方法。所述小鼠为无毛的，并且具有多重免疫缺陷，包括B细胞和T细胞缺陷，以及受损的巨噬细胞和补体功能。所述小鼠还在免疫系统的自然杀伤细胞和树突细胞中具有进一步的缺陷。所述小鼠可用于生物医学研究，例如涉及异种移植、自发性肿瘤、癌细胞肿瘤发生、肿瘤血管发生、肿瘤转移潜能、肿瘤抑制治疗、致癌调控和肿瘤成像的研究。
文档编号C12N15/00GK102971420SQ201180029157
公开日2013年3月13日 申请日期2011年4月14日 优先权日2010年4月14日
发明者S.维尔德特 申请人:哈伦实验室有限公司