专利名称：用于分泌性蛋白表达的融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及一种新的融合蛋白和一种用于分泌性蛋白表达的方法。
背景技术：
分泌性蛋白表达是宿主细胞中蛋白质的表达，其中该蛋白质输出至细胞膜并且以可溶性方式释放至培养基中或保持与细胞膜连接。分泌性蛋白表达由处在蛋白质N端的信号肽介导，该信号肽指导多肽到达细胞膜。]通常，在原核宿主如大肠杆菌中产生的重组蛋白以胞内方式产生。当蛋白质以这种方式回收时，不得不裂解细胞，这导致重组蛋白被细胞内容物污染。随后不得不从全细胞提取物中以多步骤纯化流程回收蛋白质，这费时并且导致低劣产率。将重组蛋白分泌至培养基中是一项更好的策略，因为从用过的培养基中纯化蛋白质较容易并且与连续培养更相容。然而，现有系统不具有高效的产率。其中蛋白质保持与细胞表面连接的分泌性蛋白表达具有其他用途。这种类型的蛋白质表达的用途的实例包括活疫苗开发、表位定位、生物吸附剂和生物传感器开发和为发现药物而高通量筛选蛋白质和肽文库。在表面展示和分泌中，重组蛋白面临跨过复杂大肠杆菌细胞包膜易位的挑战，该细胞包膜由两个脂质膜(内膜和外膜)组成， 在其间存在凝胶样区室(周质)。已经显示这种易位是十分困难的并且先前使用的方法具有低效力。自转运蛋白是巨大的蛋白质，它们由革兰氏阴性细菌如(大肠杆菌)分泌。自转运蛋白系统在以下意义上是简单的:认为自转运蛋白，如其名称暗示，在蛋白质自身内部携带用于跨周质和外膜易位的全部信息。然而，借以自转运蛋白分泌的机制仍是不完全理解的。自转运蛋白合成为巨大的前体蛋白，该前体蛋白含有3个主要结构域:(i)将蛋白质靶向Sec易位子并启动跨内膜转移的N端信号肽，(ii)包含待分泌的“载货”蛋白的载客结构域和(iii)包含β桶结构的C端成孔结构域(易位蛋白结构域)，其中该β桶结构整合至外膜中并且在载客结构域跨越外膜易位至胞外空间中发挥关键但不清楚的作用。在易位后，载客结构域从易位蛋白结构域中被切下并释放至胞外环境中。在一些情况下，载客结构域保持与细胞表面非共价地连接。可以通过(外部)蛋白酶对位于易位蛋白结构域和载客结构域之间的蛋白酶基序发挥作用来实现切割。可替代地，切割通过易位蛋白结构域和载客结构域之间特定位点处的分子内自催化事件发生。自转运蛋白的载客结构域包含β莖部结构和侧面结构域。β莖部是由延长的β螺旋形成的伸长结构。载客结构域的C端包含已经参与载客结构域折叠和跨外膜易位的自伴侣结构域。Hbp是属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)丝氨酸蛋白酶自转运蛋白(SPATE)亚家族的自转运蛋白。Hbp的载客结构域的晶体结构最近已经测定(Otto等人,2005，J.BiolChem (《生物化学杂志》)280 (17):17339_45)，并且如
图1lA显示。该结构展示这种多肽形成长的右手0_螺旋结构(“0茎部”)。Hbp的载客结构域包含两个较大的侧面结构域:结构域dl和结构域d2，其中dl包含该蛋白质的丝氨酸蛋白酶活并且d2具有未知的功能。还存在3个较小的侧面结构域:结构域3 (d3)、结构域4 (d4)和结构域5 (d5)。还已经显示了其他自转运蛋白如百日咳杆菌粘着素(Emsley等人，1996Nature(《自然》)381:90-92)和IgA蛋白酶(Johnson等人，2009J Mol Biol (《分子生物学杂志》)389 (3) =559-74)的相似β茎部结构域。先前已经尝试使用自转运蛋白用于大肠杆菌中的分泌性蛋白表达，大多使用经工程化用于表面展示目的的奈瑟氏菌IgA蛋白酶(Pyo等人,2009Vaccine (《疫苗》)272030-2036)和内源性大肠杆菌自转运蛋白AIDA-1 (Van Gerven等人，2009Microbiology(《微生物学》)155:468-476)的变体。使用IgA蛋白酶和AIDA-1用于分泌重组蛋白的尝试使用了导致分泌和表面暴露的蛋白质的低劣产率的构建体(Pyo等人，2009Vaccine (《疫苗》)272030-2036 ；Van Gerven等人，2009Microbiology (《微生物学》)155:468-476)。在大多数的这类研究中，完整或几乎完整的内源性载客结构域由重组蛋白替换。迄今，自转运蛋白已经主要用作展示平台，而非用于可溶性形式的异源蛋白质的分泌，其中该蛋白质被分泌至培养基中。IgA蛋白酶需要附属蛋白酶用于加工，而AIDA-1在切割后保持与外膜非共价地连接。因此，这些自转运蛋白可能仅用于表位和蛋白质的表面呈递。先前已经显示了与Hbp载客结构域融合的钙调蛋白的高效展示和分泌(Jong等人,2007Molecular Microbiology (《分子微生物学》)63:1524-1536)。为了最小化对载客结构域的天然β -茎部的扰动，钙调蛋白替换Hbp载客结构域的结构域2。对于某些应用，从细胞表面分泌或展示多于一种感兴趣蛋白(POI)的可能性是十分有用的。这类应用包括疫苗，例如其中两个或更多个表位展示在相同的细胞表面上；酶展示，其中多于一个酶展示在细胞表面上来以一系列步骤实施众多催化反应；肽文库暴露和抑制剂筛选。对于多价疫苗，特别有用的是具有一种系统，其中一个宿主细胞群体可以表达并展示或分泌多种抗原，而非具有细胞群体的混合物，每个群体仅展示或分泌这些抗原之一。仅具有展示或分泌多种抗原的一个细胞群体具有更易生产和更好控制疫苗含量的优点。总之，需要改进的分泌表达系统，这些系统用于展示异源蛋白质以及将异源蛋白质以可溶性形式分泌至培养基中。也需要的一种系统和一种方法，其能够在宿主细胞的细胞表面上使多于一个感兴趣蛋白进行分泌性蛋白表达或分泌多于一种蛋白质至培养基中。
发明目的本发明的一个目的是提供感兴趣多肽(POI)从宿主细胞中的高效分泌。本发明的第二目的是提供POI在宿主细胞表面上的高效展示。本发明的第三目的是提供POI向其中培养宿主细胞的培养基中的高效可溶性分泌。本发明的又一个目的是提供用于多于一种POI的高效分泌(即展示或可溶性分泌)的支架。
发明简述
在本发明的第一方面，提供了能够表达多于一种(如至少两种)POI (感兴趣蛋白)的宿主细胞。这些POI包含于一种融合蛋白中，该融合蛋白还包含载客结构域(其包含来自自转运蛋白的β茎部结构域)、来自自转运蛋白的易位蛋白结构域和能够将该融合蛋白靶向革兰氏阴性细菌内膜的信号肽。该载客结构域的β茎部形成序列是基本上完整的并且这些POI与该载客结构域融合。与其他系统相比，用于分泌性蛋白表达的这种宿主细胞具有几个优点，包括但不限于更高效地分泌多于一种Ρ0Ι。另外，当目标是展示POI时，随着POI将进一步离开细胞表面并且更稳定，β茎部结构域将能够实现更高效的展示。在本发明的宿主细胞的一个实施例中，自转运蛋白的天然形式的载客结构域包含从β茎部结构域突出的至少一个侧面结构域。POI随后可以插入、替代或部分替代这种侧面结构域。在另一个实施例中，自转运蛋白的天然形式的载客结构域包含至少两个侧面结构域。每种POI随后可以插入、替代或部分替代独立的这种侧面结构域，或POI可以插入、替代或部分替代相同的侧面结构域。POI也可以与来自自转运蛋白的独立的载客结构域、易位蛋白结构域和信号肽融
口 ο在本发明的第二方面，提供一种融合蛋白，该融合蛋白包含多于一种(如至少两种)POI (感兴趣蛋白)、载客结构域(其包含来自自转运蛋白的β茎部结构域)、来自自转运蛋白的易位蛋白结构域和任选地，将该融合蛋白靶向革兰氏阴性细菌内膜的信号肽。该载客结构域的β茎部形成序列是基本上完整的并且这些POI与该载客结构域融合。在其天然形式下， 该融合蛋白的载客结构域可以包含从β茎部结构域突出的至少一个侧面结构域，并且这些POI可以插入、替代或部分替代这种侧面结构域。在其天然形式下，该融合蛋白的载客结构域还可以包含至少两个侧面结构域，并且每种POI可以插入、替代或部分替代这类侧面结构域的独立结构域。可替代地，这些POI可以插入、替代或部分替代相同的侧面结构域。在本发明的另一个方面，提供了经安排用于表达融合蛋白的核酸。在一个实施例中，该核酸在框内包含编码该融合蛋白的信号肽的序列，该信号肽能够将该融合蛋白靶向革兰氏阴性细菌的内膜；编码该融合蛋白的载客结构域的序列，该载客结构域包含来自自转运蛋白的β茎部结构域，和编码该融合蛋白的易位蛋白结构域的序列，该易位蛋白结构域源自自转运蛋白。编码该载客结构域的序列包含允许框内地克隆至少两个编码POI (感兴趣蛋白)的DNA序列的至少两段克隆位点序列。这些克隆位点序列如此安排，从而该载客结构域的所编码的β茎部形成蛋白序列是基本上完整的。也可能不使用克隆位点仅通过融合两段DNA，例如通过PCR JfPOI插入一种自转运蛋白中，从而产生一种融合蛋白。编码该自转运蛋白的载客结构域的序列可以在其天然形式下包含至少两段序列，这些序列编码从β茎部结构域突出的侧面结构域。该至少两段克隆位点序列随后可以插入、替代或部分替代独立的编码侧面结构域的这类片段。在另一个实施例中，该核酸在框内包含编码该融合蛋白的信号肽的序列，该信号肽能够将该融合蛋白靶向革兰氏阴性细菌的内膜；编码该融合蛋白的载客结构域的序列，该载客结构域包含来自自转运蛋白的β茎部结构域；编码该融合蛋白的易位蛋白结构域的序列，该易位蛋白结构域源自自转运蛋白；和编码该融合蛋白的至少两种POI的序列。编码这些POI的序列与编码该载客结构域的序列融合并且如此安排，从而该载客结构域的所编码的β茎部形成蛋白序列是基本上完整的。编码该自转运蛋白的载客结构域的序列在其天然形式下可以包含至少两段序列，这些序列编码从β茎部结构域突出的侧面结构域。编码POI的至少两个序列的每一个随后可以插入、替代或部分替代编码侧面结构域的这些片段的每一个。可以如此安排该宿主细胞、融合蛋白或核酸，从而当表达时，该融合蛋白从细胞表面分泌。例如，该融合蛋白可以包含使得该融合蛋白被切割和从表达该融合蛋白的宿主细胞分泌的切割位点。并且，编码该融合蛋白的核酸可以编码这种切割位点。可以如此安排该宿主细胞、融合蛋白或核酸，从而当表达时，该融合蛋白在细胞表面展示。例如，该融合蛋白可以不包含这类切割位点或可以包含破坏的切割位点。类似地，编码该融合蛋白的核酸则不编码这种切割位点或编码破坏的切割位点。可替代地，该融合蛋白和核酸可以包含切割位点并且所得到的融合蛋白经切割，但是保持与细胞表面非共价连接，并且因此在该细胞表面展示。该载客结构域和易位蛋白结构域可以源自SPATE (肠杆菌科丝氨酸蛋白酶自转运蛋白)蛋白，如来自大肠 杆菌的血红蛋白结合蛋白酶(Hbp)、胞外丝氨酸蛋白酶(EspC)或温度敏感性血凝素(Tsh)。在本发明的一个方面，提供了一种包含本发明核酸的载体。在本发明的另一个方面，提供了一种包含本发明核酸或载体的宿主细胞。在一个实施例中，本发明的宿主细胞是革兰氏阴性细菌，该革兰氏阴性细菌可以选自肠杆菌科，如大肠杆菌、沙门氏菌属某些物种(Salmonella spp.)、弧菌属某些物种(Vibrio spp.)、志贺氏菌属某些物种(Shigella spp.)、假单胞菌属某些物种(Pseudomonads spp.)、伯克霍尔德菌属某些物种(Burkholderia spp.)或德特氏菌属某些物种(Bordetella spp.)。在一个方面，提供了展示根据本发明的融合蛋白的外膜小泡。在另一个方面，提供了一种展示根据本发明的融合蛋白的菌影。在一个方面，提供了一种用于融合蛋白的分泌性蛋白表达的方法，该方法包括步骤:提供根据本发明的一种宿主细胞并诱导该融合蛋白的表达。在一个实施例中，该方法包括另外的步骤:抑制该宿主细胞中具有蛋白酶活性的周质酶，如DegP。可以例如通过DegP催化位点中的突变抑制DegP。在另一个实施例中，该方法包括另外的步骤:下调该宿主细胞的周质间隙内催化蛋白质中二硫键形成的至少一种酶，如DsbA或DsbB。该方法能以可溶性方式提供该融合蛋白的分泌。可替代地，它可以提供该融合蛋白在细胞表面上的展示。在一个实施例中，该方法包括另外的步骤:诱导小泡从该宿主细胞(其是革兰氏阴性细菌)的外膜排出，因此形成在它们的表面上展示该融合蛋白的外膜小泡。在另一个实施例中，该方法包括另外的步骤:裂解该革兰氏阴性细菌，因此形成在它们的表面上展示该融合蛋白的菌影。可以通过使用来自噬菌体PhiX174的致死性裂解基因E进行裂解。在一个实施例中，这些POI的至少一种可以包含抗原，例如来自感染性生物的抗原。该抗原例如是来自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的抗原,如ESAT-6、Ag85B、Rv2660c、TB10.4和TB10.3，或与这些蛋白质相似的蛋白质。在一个方面，提供了包含根据本发明的宿主细胞、融合蛋白、外膜小泡或菌影的疫苗。
附图简述本发明现在通过举例方式参考附图进行描述，在这些附图中:图1-10显示在实例中所用的质粒的质粒图。图1lA-D显示Hbp载客结构域的结构的图，其中指出某些结构域。图1lE展示在实例1-15中使用的融合蛋白的多种构建体。图12-33显示来自实例1-19的实验数据。对于细节，参见实例部分。图34显示在实例中所用的质粒的质粒图。
定义如本文所用，供应以下定 义旨在促进对本发明的理解。“自转运蛋白”是属于pfam自转运蛋白家族(‘自转运蛋白’ PF03797)并且还已知或预测形成β茎部基序的蛋白质。用于序列分析的BETAWRAPPR0方法可以用来预测自转运蛋白的载客结构域是否将形成β莖部基序(Junker等人,2006Proc Natl Acad Sci U SA (《美国科学院院刊》)103 (13):4918-23)。“感兴趣多肽”(POI)是本发明的使用者想要宿主细胞以可溶性形式分泌至培养基中或展示在细胞表面上或两者的多肽。典型地，该POI是使用者研究或想要表达的蛋白质，而融合蛋白的其他部分辅助分泌过程。典型地，该POI还相对于与其融合的自转运蛋白结构域是异源的。该POI具有至少4个氨基酸长度、至少10个氨基酸长度或至少20个氨基酸长度。“β茎部形成序列”指形成β茎部结构的自转运蛋白的载客结构域的序列。可以使用晶体结构测定法鉴定载客结构域的β茎部形成序列。如上文所述，可以可替代地使用Μ4Τ同源性建模方法(Rykunov等人,2009J Struct Funct Genomics (《结构与功能基因组学杂志》)10:95-99)或相似的预测方法鉴定β茎部形成序列。“侧面结构域”是一种结构域，它是载客结构域的部分但不是β茎部的部分。典型地，侧面结构域位于载客结构域中两段β茎部形成序列之间。侧面结构域始于居前β链之后的第一氨基酸处并且它止于后随于侧面结构域的β链的起始氨基酸之前的一个氨基酸。侧面结构域也可以位于载客结构域的N端处。自转运蛋白可以具有几个侧面结构域。“相似的蛋白质”、“相似的序列”或“类似的蛋白质”指当两个氨基酸序列比较时，与另一种蛋白质具有高程度同源性的蛋白质。优选地，当两个序列最佳比对时，它至少80%、更优选地多于90%、更优选地多于95%、甚至更优选地多于97%与对比序列同源。使用公众可获得的软件如BLAST，可以轻易地测量序列同源性。“宿主细胞”指已经向其中导入本发明的一个或多个载体或分离和纯化的核酸序列的原核细胞。应当理解本术语不仅指具体的对象细胞，还指这种细胞的子代或潜在子代。因为某些修饰可以因突变或环境影响而出现在后续世代中，所以这类子代实际上可以与亲代细胞不相同，但仍包含于如本文中所用的这个术语范围内。“展示”:分泌性蛋白保持与宿主细胞外膜结合，从而它至少部分地在细胞外部突出时，这种分泌性蛋白展示在分泌性宿主细胞的表面上。该分泌性蛋白可以与细胞膜或存在于其中的组分(如来自自转运蛋白的易位蛋白结构域)以共价或非共价的方式连接。“可溶性分泌”和“以可溶性方式分泌”指蛋白质的分泌，其中该蛋白质分泌入胞外空间中，从而不与宿主细胞结合，这与该蛋白质保持与宿主细胞外膜或整合至宿主细胞外膜中的蛋白质结合时相反。“大约”指示在适用的情况下，偏离该值+/_10%。发明人已经发现，如果自转运蛋白的载客结构域的β茎部形成序列是基本上完整的，则该自转运蛋白可以用于改进的分泌性蛋白表达。尽管实际的β茎部形成序列是最佳分泌必需的，但是自转运蛋白的载客结构域的侧面结构域是用于插入POI的合适位点。这些侧面结构域可以由随后将被分泌的POI替换。可替代地，可以插入该Ρ0Ι，从而以便替代部分的侧面结构域或从而以便与侧面结构域融合。发明人还已经发现，如果自转运蛋白的载客结构域的β茎部形成序列是基本上完整的，则该自转运蛋白可以用于多于一种(如至少两种)Ρ0Ι的改进的分泌性蛋白表达。通过将POI融合，即插入、替换或部分地替换载客结构域的一个或多个侧面结构域，同时保持β茎部结构完整，实现了一种高效和相对易用的用于同时展示或可溶性分泌两种或更多种POI的系统。可以根据本发明被替换的侧面结构域是相对大的，如具有20、30、40、60、80个或
更多个氨基酸残基。因此，自转运蛋白的载客结构域可以视为由非β茎部形成序列连接在一起的几段β茎部形成序列。这些 非β茎部形成序列是用于插入一种或多种POI的合适位点。因此，可以将POI置于β茎部形成序列的两个部分之间。POI也可以与载客结构域的N端融
口 ο用检测自转运蛋白的载客结构域的β茎部形成序列和侧面结构域的合适方法包括生物物理方法如X射线结晶学和生物信息学软件如结构预测工具。X射线结晶学当今是高度高效及自动化并且为本领域技术人员已知的标准方法。载客结构域的高分辨率结构和用于确定自转运蛋白的载客结构域的结构的合适方法的实例存在于(Otto等人，2005J Biol Chem (《生物化学杂志》)280 (17):17339-45 ;Emsley等人，1996Nature (《自然》)381:90-92 Johnson等人，2009J Mol Biol (《分子生物学杂志》)389 (3):559-74)中。适于确定β茎部结构的生物信息学方法的实例是Μ4Τ同源性建模方法(Rykunov等人,2009J Struct Funct Genomics (《结构与功能基因组学杂志》)10:95-99),该方法可在互联网上免费获得。在蛋白质的三维模型用于鉴定β茎部结构域和侧面结构域的情况下，合适的是所获得的模型具有好于4埃的分辨率。侧面结构域随后将作为从β茎部突出的结构域可见到。通过观察自转运蛋白的载客结构域的结构，可以看到，序列的多个部分不是β茎部的部分，但形成从β茎部突出的结构域。这些方法可以用于确定载客结构域的哪些结构域或氨基酸适于插入POI并且哪些应当保持基本上完整。
根据本发明，β茎部形成序列是基本上完整的。因此，应当尽可能少地移除β茎部形成序列。预测的结构域边界有助于确定POI应当在哪里插入。如果除去过多的β茎部形成序列，则分泌将不利地受到影响。β茎部形成序列基本上完整意指与破坏或完全除去β茎部相比时，蛋白质的分泌功能的效率维持在最佳水平。它也意指在分泌后，载客结构域的稳定性得到维持。本领域技术人员可以使用实验性方法来确定具体构建体是否允许高效分泌。适于体外确定分泌效率的方法的实例包括:分析培养基中存在的POI的级分、用生物素或其他标记物标记表面蛋白、细胞分级、使表面蛋白暴露于蛋白酶(如蛋白酶K)和使用针对POI的抗体研究(如点印迹研究、免疫荧光显微术和免疫电子显微术)。适于确定分泌后载客结构域的稳定性的方法的实例包括包括SDS-PAGE、蛋白质印迹法和上文在第76段下的全部方法。因此，通过使用结构信息，本领域技术人员可以预测可在载客结构域中何处插入POI以便维持最佳分泌。可以用体外实验容易地测定实际分泌。根据本发明，POI与载客结构域融合。这意指POI与形成载客结构域的肽融合，从而它们形成一条连续多肽。因为在DNA水平实施融合蛋白的设计，必须小心从事，从而POI的阅读框与载客结构域的阅读框相同。优选地，POI具有小于200kD的分子量。更优选地，这个分子量小于200kD，如100kD、80kD、60kD、40kD、30kD、20kD、10kD 或 5kD。融合蛋白可以包含多于一种Ρ0Ι。因此，融合蛋白可以包含2种、3种或多种感兴趣多肽。融合蛋白可以是这样的，从而它具有至少两种POI，每一种各自替代或部分替代或融合至载客结构域的独立 或单独侧面结构域。可替代地，两种或更多种POI可以融合至、或替代或部分替代相同的侧面结构域。融合蛋白由核酸编码并且在宿主细胞中表达。该核酸可以采用涉及限制性酶、DNA连接酶、PCR、寡核苷酸合成、DNA纯化的标准分子生物学技术和本领域技术人员熟知的其他方法构建。优选地，起点是自转运蛋白的阅读框，其中将编码POI的DNA片段插入该阅读框中，从而这些阅读框匹配。可替代地，融合蛋白的阅读框可以在计算机上设计并且使用多核苷酸合成法合成。编码融合蛋白的阅读框优选地插在用于原核生物表达的表达载体中，该表达载体携带启动子和本领域技术人员熟知的其他元件。融合蛋白包含指导蛋白质分泌的N端信号肽。当宿主细胞是革兰氏阴性细菌时，合适的信号肽是这样的，从而它指导蛋白质跨内膜易位。该信号肽可以源自自转运蛋白，合适地源自衍生载客结构域的相同自转运蛋白。该信号肽可以大致包含SEQ ID NOl的第I至52位氨基酸或相似的序列。融合蛋白适当地包含自伴侣结构域，其适当地来自用来融合POI的自转运蛋白的载客结构域。自伴侣结构域的一个实例大致包含包含SEQ ID NOl的第1002至1100位氨基酸。融合蛋白可以包含来自一个类型自转运蛋白的载客结构域和来自另一个类型自转运蛋白的易位蛋白结构域。本发明中所用的自转运蛋白可以是具有丝氨酸蛋白酶结构域的自转运蛋白，如丝氨酸蛋白酶。该自转运蛋白可以是SPATE蛋白(肠杆菌科的丝氨酸蛋白酶自转运蛋白)。因此，易位蛋白结构域和载客结构域可以来自SPATE蛋白。在一个实施例中，该SPATE蛋白是来自大肠杆菌的血红蛋白结合蛋白酶(Hbp) (SwissProt 088093)和温度敏感性血凝素(Tsh)(SwissProt Q47692)之一。Tsh的序列与Hbp的序列同源。其他SPATE蛋白包括淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的IgA蛋白酶、来自大肠杆菌的EspC、来自大肠杆菌的Pet、来自大肠杆菌的EspP、来自大肠杆菌的Pic、来自大肠杆菌的PicU、来自大肠杆菌的Sat、来自大肠杆菌的Vat、来自大肠杆菌的Esp1、来自大肠杆菌的EaaA、来自大肠杆菌的EaaC、来自大肠杆菌的EatA、来自大肠杆菌的EpeA、来自大肠杆菌的PssA、来自大肠杆菌的AidA_B7A、来自乍得沙门氏菌(Salmonella bongori )的Boa、来自福氏志贺氏菌(Shigella f Iexneri )的SepA、来自福氏志贺氏菌的SigA、来自福氏志贺氏菌的Pic。该SPATE蛋白可以包含SEQ ID NOl的多肽，该多肽是Hbp，或SEQ ID N02的多肽，该多肽是其中易位蛋白结构域和载客结构域之间的切割位点已经遭到破坏的HbP(Hbp Δ -cleav),或与这些序列相似的序列。优选地，与这些序列的同一性多于80%、甚至更优选地多于90%、甚至更优选地多于95%并且最优选地多于97%。
这些SPATE组的蛋白质具有随本发明一起使用的几个优点。首先，它们的结构中一些是已知的，这利于鉴定它们的β茎部和侧面结构域。这种知识也可以用于预测晶体结构未知的相关SPATE的侧面结构域和β茎部结构。另一个优点是它们的切割结构，这种切割结构可以用于高效可溶性分泌并且在SPATE家族内部是保守的。可以预测结构已知的其他自转运蛋白或它们将是已知的，从而它们的β茎部和侧面结构域结构可以确定，也可以随本发明一起使用。该自转运蛋白应当具有β茎部、侧面结构域和可任选地，高效用于可溶性分泌的切割系统。实例包括来自流感嗜血杆菌的自转运蛋白HapS,它不是SPATE家族的成员。最近已经发表HapS的载客结构域的结构(Meng等人，2011Augl2The EMBO Journal (《ΕΜΒ0 杂志》)，do1:10.1038/emboj.2011.279.[电子出版先于印刷版])。这种结构十分接近于HbP的结构，具有一种具有4个侧面结构域的β-茎部(SD1-4)。图1lA显示自转运蛋白Hbp的载客结构域的晶体结构(Otto等人,2005J BiolChem (《生物化学杂志》)280 (17):17339_45)。结构域I (dl)、结构域2 (d2)和自伴侣结构域(ac)为浅灰色。载客结构域的其余部分(包括β茎部结构域)着色为黑色。结构域dl和d2均适于POI的插入。此外，图1lC中所示的结构域d3和图1lD中所示的结构域d4和d5适于POI的替换或插入。结构域dl大致包含作为Hbp序列的SEQ ID NOl的第53至308位氨基酸，d2大致包含第533-608位氨基酸，d3大致包含第657-697位氨基酸，d4大致包含第735至766位氨基酸，并且d5大致包含第898至922位氨基酸。图1lE显示野生型Hbp的结构域组成。此外，显示了在本文中所呈献的实施例中使用的融合蛋白。在野生型Hbp中，显示了包含β茎部(处于黑色)和侧面结构域dl、d2、d3、d4和d5的载客结构域。易位蛋白结构域位于蛋白质的C端部分处并且显示为“ β -结构域”。“Ac”表示自伴侣结构域。信号肽由“ss”指示。数字指示从N端的氨基酸数。
可以使用大致包含SEQ ID NOl第53-1100位氨基酸或相似序列的载客结构域。可以使用大致包含SEQ ID NOl第1101-1377位氨基酸或相似序列的易位蛋白结构域。POI可以是分裂的蛋白质。分裂的蛋白质是一种蛋白质，该蛋白质在其天然形式下包含单条多肽或由二硫桥或其他分子内键连接的几条多肽并且对于本发明而言已经分裂成两个或更多个部分。这类部分的每一个与载客结构域融合，从而它们例如相隔一定距离地形成一种非天然结构。这两个或更多个部分可以例如与不同侧面结构域融合或与相同侧面结构域融合但是相隔一定距离。将这类部分的每一个视为一种Ρ0Ι，从而将分裂的蛋白质视为两种或更多种Ρ0Ι。例如当天然蛋白具有抑制高效分泌的庞大或复杂结构，例如包含二硫桥时，这可能是有利的。使蛋白质分裂可以使分泌更高效。POI可以包含至少一种抗原，例如来自感染性生物(如结核分枝杆菌)的抗原。来自结核分枝杆菌的这类抗原的实例包括ESAT-6样蛋白(例如ESAT-6、TB10.4、TB10.3)、Ag85B样蛋白(例如Ag85B)、和Rv2660c。两种或更多种的这类抗原可以与相同的载客结构域(例如与独立的侧面结构域)融合。ESAT-6 (6kDa早期分泌性抗原靶)是一种IOkDa蛋白质，该蛋白质是有力的T-细胞抗原和重要的毒力因子。Rv2660c是功能未知的1.6kDa胞内蛋白。TB10.3和TB10.4均是具有96个氨基酸的蛋白质。Ag85B是35kDa的分泌性分枝酰转移酶(mycolyltransferase),包含3个半胱氨酸。它也是有力的T-细胞抗原。在其天然形式下，这种相当庞大和包含半胱氨酸的蛋白质对于利用自转运蛋白系统的最佳外膜易位而言太复杂。
在一个实施例中，该抗原如上文定义那样分裂。例如，Ag85B，作为庞大和相当复杂的蛋白质，可以分裂成N’部分(Ag85B (N’))和C’部分(Ag85B (C’))用于更高效的分泌。在一个实施例中，POI包含一种多肽，该多肽具有与作为ESAT-6的序列的SEQ IDN039相似至少80%、更优选90%、更优选95%、最优选97%的序列。在一个实施例中，POI包含SEQ ID N039中定义的多肽。在一个实施例中，POI包含一种多肽，该多肽具有与作为Rv2660c的序列的SEQ IDN041相似至少80%、更优选90%、更优选95%、最优选97%的序列。在一个实施例中，POI包含SEQ ID N041中定义的多肽。在一个实施例中，POI包含一种多肽，该多肽具有与作为TB10.4的序列的SEQ IDN042相似至少80%、更优选90%、更优选95%、最优选97%的序列。在一个实施例中，POI包含SEQ ID N042中定义的多肽。在一个实施例中，POI包含一种多肽，该多肽具有与作为TB10.3的序列的SEQ IDN043相似至少80%、更优选90%、更优选95%、最优选97%的序列。在一个实施例中，POI包含SEQ ID N043中定义的多肽。在一个实施例中，POI包含一种多肽，该多肽具有与作为Ag85B的序列的SEQ IDN040的至少1/4相似至少80%、更优选90%、更优选95%、最优选97%的序列。在一个实施例中，POI包含由SEQ ID N040中的第1-126位或第118-285位氨基酸定义的多肽。POI可以在侧翼分布有一个或多个接头区域。接头区域可以是I至20个或更多个氨基酸的柔性肽。该接头区域可以适当地在POI的C-端和N端处插入。接头的优点在于，它可以允许融合蛋白的多种结构域彼此更独立地移动。接头可以由本领域技术人员容易地设计。合适接头的实例包括SEQ ID N044和45。融合蛋白可以包含在SEQ ID NO: 13-19、SEQ ID NO:22-26 或 SEQ ID N038 的任一者中定义的多肽或这些序列的任一个相似至少80%、更优选90%、更优选95%和最优选97%的多肽。SEQ ID N013是Hbp的序列，其中ESAT6已经替换结构域dl(Hbp(Adl)-ESAT6，又命名为HbpSL-ESAT6)。SEQ ID N014是相同的蛋白质，但是其中易位蛋白结构域和载客结构域之间的切割位点已经遭受破坏(HbpD ( Adl)-ESAT6，又命名为HbpDL-ESAT6)。SEQ IDN015是Hbp的序列，其中ESAT6已经替换结构域d2 (Hbp ( Δ d2)_ESAT6)。SEQ ID N016是Hbp的序列，其中ESAT6已经替换结构域d2 (Hbp ( Λ d2)_ESAT6，又命名为HbpDD2_ESAT6)并且其中易位蛋白结构域和载客结构域之间的切割位点已经遭受破坏。SEQ ID N017是Hbp的序列，其中ESAT6已经替换结构域d3 (Hbp ( Λ d3)-ESAT6)。SEQ ID N018是Hbp的序列，其中ESAT6已经替换结构域d4 (Hbp ( Λ d4)_ESAT6)。SEQ IDN019是Hbp的序列，其中ESAT6 已经替换结构域 d5 (Hbp ( Ad5) -ESAT6)。SEQ ID N022是Hbp的序列，其中Rv2660c已经替换结构域d3 (Hbp(Ad3)-Rv2660c)。SEQ ID N023 是 Hbp 的序列，其中 Rv2660c 已经替换结构域 d4 (Hbp(Ad4)-Rv2660c)。SEQ ID N024 是 Hbp 的序列，其中 Rv2660c 已经替换结构域 d5 (Hbp(Ad5)-Rv2660c)。SEQ IDN025 是 Hbp 的序列，其中 TB10.4 已经替换结构域 dl (Hbp(Adi)-TB10.4)。SEQ ID N026是Hbp的序列，其中TB10.3已经替换结构域d2 (Hbp(Ad2) -TB10.3)。SEQ ID N038 是 EspC 的序列，其中 ESAT6 已经替换结构域 dl(EspC( Adl)-ESAT6)。融合蛋白可以包含具有多于一种POI的多肽，如在SEQ ID NO:28_35的任一者中定义的多肽或这些序列的 任一个相似至少80%、更优选90%、更优选95%和最优选97%的多肽。SEQ ID N028是Hbp的序列，其中Ag85B的残基1-126已经替换结构域dl并且Ag85B的残基118-285已经替换结构域2(Hbp-Ag85B[N+。])。SEQ ID N029是Hbp的序列，其中Ag85B的残基1-126已经替换结构域dl并且Ag85B的残基118-285已经替换结构域2，并且其中易位蛋白结构域和载客结构域之间的切割位点已经遭受破坏(HbpD-Ag85B[N+C])。SEQ ID N030是Hbp的序列，其中Ag85B的残基1-126已经替换结构域d2并且Ag85B的残基118-285已经替换结构域I (Hbp-Ag85BK+N])。SEQ ID N031是Hbp的序列，其中Ag85B的残基1-126已经替换结构域d2并且Ag85B的残基118-285已经替换结构域I，并且其中易位蛋白结构域和载客结构域之间的切割位点已经遭受破坏(HbpD-Ag8 5B [C+N])。SEQ ID N032是Hbp的序列，其中Ag85B的残基1-126已经替换结构域d2，Ag85B的残基118-285已经替换结构域I并且ESAT6已经替换结构域4 (Hbp-Ag85BK+N]_ESAT6)。SEQ ID N033是相同的蛋白质，但是其中易位蛋白结构域和载客结构域之间的切割位点已经遭受破坏(HbpD-Ag85BK+N]-ESAT6)。
SEQ ID N034 是 Hbp 的序列，其中 Ag85B 的残基1-126已经替换结构域d2，Ag85B的残基118-285已经替换结构域1，ESAT6已经替换结构域 4 并且 Rv2660c 已经替换结构域 5 (Hbp-Ag85BK+N]-ESAT6-Rv2660c)。SEQ ID N035是相同的蛋白质，但是其中易位蛋白结构域和载客结构域之间的切割位点已经遭受破坏(HbpD_Ag85B [C+N] -ESAT6-Rv2660c )。优选地，融合蛋白的各结构域的顺序从N端至C端是:信号肽、载客结构域、易位蛋白结构域。在本发明的第二方面，提供一种表达如本文定义的融合蛋白的细胞。该细胞优选地是可以通过本领域技术人员熟知的方法培养和操作并且能够表达异源蛋白质的宿主细胞。优选地，该宿主细胞是革兰氏阴性细菌如大肠杆菌、沙门氏菌属某些物种、弧菌属某些物种、志贺氏菌属某些物种、假单胞菌属某些物种、伯克霍尔德菌属某些物种或德特氏菌属某些物种多种表达系统是本领域技术人可获得和已知的。表达可以是稳定或瞬时性质的。表达系统可以是诱导型或非诱导型的。在一个实施例中，融合蛋白由宿主细胞至少部分地可溶地分泌。当本发明用于产生例如作为商业酶或药品组分的重组蛋白时，可以使用这个实施例。POI随后可以在不破碎宿主细胞的情况下便利地从培养基中收获。破碎宿主细胞造成细胞残片和细胞内容物的污染。当融合蛋白在易位蛋白结构域和载客结构域之间包含蛋白酶切割位点时，可以实现融合蛋白的分泌。在易位蛋白结构域已经整合入外膜时，可以存在于融合蛋白自身内部的蛋白酶活性切割融合蛋白，从而载客结构域被释放至培养基中。可替代地，切割可以借助与蛋白酶活性无关的分子内自催化切割机制发生，如对于来自大肠杆菌的SPATE EspP (Dautin等人，2007EMB0 J26 (7):1942-1952)和来自大肠杆菌的 AIDA-1 (Charbonneau 等人，2009，JBiol Chem (《生物化学杂志》)284 (25):17340-17353)所描述。出于清晰目的，POI可以在一些情况下保持与细胞膜连接，即便多肽已经被切割。这类连接通常将非共价性质的。在一个实施例中，POI保持与易位蛋白结构域共价连接。在自转运蛋白的序列携带切割位点的情况下，可以通过突变易位蛋白结构域和载客结构域之间的切割位点实现这一点，从而切割事件不发生。 因此，宿主细胞在细胞表面上展示融合蛋白的至少一部分，该部分包含至少一种POI。在某些方面，本发明提供在其表面上展示根据本发明的融合蛋白的外膜小泡(OMV)或菌影。在某些条件下，可以诱导革兰氏阴性细菌开始从其外膜排出小泡。这类外膜小泡(OMV)已经显示例如可用作疫苗平台。当携带抗原时，如同源自它们的母体细胞那样，这些小泡能够增强这类抗原的免疫原性。OMV可以容易地源自在其表面上展示本发明融合蛋白的革兰氏阴性细菌。用于产生和分离外膜小泡的方法是本领域已知的(Chen等人，2010PNAS107:3099-3104 ；Bernadac 等人，1998J Bacteriol (《细菌学杂志》)180:4872-4878 ；Kesty 和 Kuehn2004, J.Biol Chem (《生物化学杂志》)279:2069-2076)；Kolling和 Matthews 1999App Env Microbiol (《应用与环境微生物学》)65:1843-1848 ;Kitagawa 等人，2010J Bacteriol (《细菌学杂志》)192:5645_5656)。类似地，菌影是一种非活疫苗平台。菌影是已经通过裂解(例如使用来自噬菌体PhiX174的致死性裂解基因E)清空其细胞质的细菌细胞包膜(Langemann等人，2010BioengBugs (《生物工程与昆虫》)1:326-336 ;Youngl992Microbiol rev (《微生物学综述》)56:430-481 ;Mayr 等人，2005Adv Drug Deliv rev (《高级药物递送综述》)57:1381_1391)。菌影保留母体细胞的全部形态特征、结构特征和抗原性特征并且包含在裂解之前表达并锚定至细胞包膜的蛋白质。可以通过本发明的分泌系统和融合蛋白促进例如抗原性蛋白质的递送。本发明的一个方面是一种包含根据本发明的融合蛋白、细胞、外膜小泡或菌影的疫苗。这种疫苗可以包含在细胞表面展示融合蛋白的宿主细胞，其中该融合蛋白包含至少一种Ρ0Ι。优选地，该POI则是如上文所述的抗原。该宿主细胞可以是减毒的沙门氏菌菌株，如 Curtiss R3rd 等人，2010Crit Rev Immunol (《免疫学关键性综述》)30 (3):255-70中描述的菌株。该疫苗可以包含沙门氏菌活宿主细胞。本发明的一个方面是编码如上文已经描述的根据本发明的融合蛋白的核酸。本发明的又一个方面是携带根据本发明的核酸的载体。可以安排该核酸或载体用于表达多于一种的与相同载客结构域融合的Ρ0Ι。例如，编码载客结构域的序列可以包含允许框内地克隆至少两个编码POI的序列的至少两段克隆位点序列。这促进轻易克隆和表达任何所需的POI。可替代地，该核酸可以包含编码与载客结构域融合的POI的多于一个序列。本发明的一个方面包括一种用于POI的分泌性蛋白表达的方法，该方法包括步骤:在宿主细胞中表达根据本发明的融合蛋白。表达载体是本领域技术人员熟知的。适当地，该载体具有适合于该宿主细胞的启动子，该启动子与编码根据本发明的融合蛋白的核酸可操作地连接。这种方法可以包括步骤:鉴定自转运蛋白上的合适侧面结构域。这可以用上文描述的生物物理方法或生物信息学方法实施。根据本发明的方法的一个方面包括步骤:用POI如此替换自转运蛋白的载客结构域的侧面结构域(或其部分)，以 至于该自转运蛋白的载客结构域的β茎部形成序列是基本上完整的。可替代地，该方法可以包括步骤:将POI如此插入载客结构域中，以至于β茎部形成序列是基本上完整的。该方法包括步骤:在其中编码融合蛋白的核酸翻译成许多融合蛋白分子并且融合蛋白分子进入分泌途径的条件下培养宿主细胞。在一个实施例中，该方法包括另外的步骤:抑制宿主细胞中具有蛋白酶活性的周质酶，如DegP。可以通过缺失、打断或失活宿主细胞染色体上的DegP编码基因来抑制DegP的蛋白酶活性。可以通过在DegP的催化位点导入突变实施失活。抑制蛋白酶具有可以改进产率的优点。在一个实施例中，该方法包括另外的步骤:下调宿主细胞的周质间隙内催化蛋白质中二硫键形成的至少一种酶，如DsbA或DsbB。这具有可以改进产率的优点，尤其对于易于形成二硫桥的蛋白质，如真核来源的蛋白质。在该方法的一个实施例中，POI以可溶性方式分泌。在该方法的一个实施例中，POI保持与细胞表面共价连接。在一个实施例中，该方法包括又一个步骤:诱导小泡从宿主细胞的外膜排出，以产生在它们的表面上展示本发明的融合蛋白的外膜小泡。在另一个实施例中，该方法包括另外的步骤:裂解革兰氏阴性细菌(例如使用来自噬菌体PhiX174的致死性裂解基因E裂解)，因此形成在它们的表面上展示融合蛋白的菌影。本发明的一个最后方面包括根据本发明方法而可获得的融合蛋白。
实例通菌株和培养某先前已经描述过大肠杆菌菌株MC1061 CaraD 139 Δ (araA-leu)7697 ΔlacX74galK16galE15 (GalS) λ el4 mcrA0relAlrpsL150 (strR)spoTImcrBlhsdR2)(Casadaban 和 Cohenl980J Mol Biol (《分子生物学杂志》)138:179_207)。菌株 TOP I OF’从Invitrogen公司获得。在37° C在补充有0.2%葡萄糖的LB培养基中常规培育细胞。在0.4%葡萄糖存在下培育过夜培养物。在适宜的情况下，将细胞在氯霉素(30 μ g/mL)和链霉素(25 μ g/mL)或四环素(6.25 μ g/mL)存在时培育。质粒的构律质粒pEH3_Hbp (图1)携带全长hbp基因，该全长hbp基因的表达处于诱导型LacUV5启动子的控制下。这个质粒的构建已经在(Jong等人,2007 Mol Microbiol (《分子微生物学》)63 (5):1524-1536)中描述。在图1-10中， 易位蛋白结构域称作结构域”。
表1:这项研究中使用的引物
权利要求
1.一种能够表达多于一种POI (感兴趣多肽)的宿主细胞,所述POI包含于一种融合蛋白中，该融合蛋白也包含 1.一种包含来自自转运蛋白的β茎部结构域的载客结构域； i1.一种来自自转运蛋白的易位蛋白结构域；和 ii1.一种能够将该融合蛋白靶向革兰氏阴性细菌内膜的信号肽； 其中该载客结构域的β茎部形成序列是基本上完整的并且这些POI与该载客结构域融合。
2.根据权利要求1所述的宿主细胞，其中该处于其天然形式的自转运蛋白的载客结构域包含该从β茎部结构域突出的至少一个侧面结构域，并且其中这些POI插入、替代或部分替代这种侧面结构域。
3.根据权利要求2所述的宿主细胞，其中该处于其天然形式的自转运蛋白的载客结构域包含至少两个侧面结构域，并且其中至少两种POI插入、替代或部分替代独立的侧面结构域。
4.根据权利要求2所述的宿主细胞，其中这些POI插入、替代或部分替代相同的侧面结构域。
5.根据权利要求1-4所述的宿主细胞，其中这些POI的每一种与独立的载客结构域、易位蛋白结构域和信号肽融合。
6.根据权利要求1-5所述的宿主细胞，其中在表达时，该融合蛋白在该细胞表面展示。
7.根据权利要求1-5所述的宿主细胞，其中在表达时，该融合蛋白从该细胞表面分泌并且释放。
8.根据权利要求1-7所述的宿主细胞，其中i)中的载客结构域和ii)中的易位蛋白结构域源自一种SPATE蛋白(肠杆菌科的丝氨酸蛋白酶自转运蛋白)。
9.根据权利要求所述8的宿主细胞，其中该SPATE蛋白是来自大肠杆菌的血红蛋白结合蛋白酶(Hbp)、胞外丝氨酸蛋白酶(EspC)或温度敏感性血凝素(Tsh)。
10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其中该SPATE蛋白包含一种多肽，该多肽具有与SEQ ID NOl或SEQ ID N02相似至少90%的序列。
11.根据权利要求10所述的宿主细胞，其中SEQID NOl或SEQ ID N02的氨基酸53-308、533-608、657-697、735-766和898-922对应于多个侧面结构域，并且其中这些POI插入、替代或部分替代至少一个或至少两个这类侧面结构域。
12.一种融合蛋白，其包含 1.多于一种POI (感兴趣多肽) .一种包含来自自转运蛋白的β茎部结构域的载客结构域； ii1.一种来自自转运蛋白的易位蛋白结构域；和 iv.可任选地，一种将该融合蛋白靶向革兰氏阴性细菌内膜的信号肽， 其中该载客结构域的β茎部形成序列是基本上完整的并且这些POI与该载客结构域融合。
13.根据权利要求12所述的融合蛋白，其中该处于其天然形式的自转运蛋白的载客结构域包含从该β茎部结构域突出的至少一个侧面结构域，并且其中这些POI替代或部分替代这种侧面结构域。
14.根据权利要求13所述的融合蛋白，其中该处于其天然形式的自转运蛋白的载客结构域包含至少两个侧面结构域，并且其中至少两种POI替代或部分替代独立的侧面结构域。
15.根据权利要求13所述的融合蛋白，其中这些POI插入、替代或部分替代相同的侧面结构域。
16.根据权利要求12-15所述的融合蛋白，其中i)中的载客结构域和ii)中的易位蛋白结构域源自一种SPATE蛋白(肠杆菌科的丝氨酸蛋白酶自转运蛋白)。
17.根据权利要求16所述的融合蛋白，其中该SPATE蛋白是来自大肠杆菌的血红蛋白结合蛋白酶(Hbp)、胞外丝氨酸蛋白酶(EspC)或温度敏感性血凝素(Tsh)。
18.根据权利要求17所述的融合蛋白，其中该SPATE蛋白包含一种多肽，该多肽具有与SEQ ID NOl或SEQ ID N02相似至少90%的序列。
19.根据权利要求18所述的融合蛋白，其中SEQID NOl或SEQ ID N02的氨基酸53-308、533-608、657-697、735-766和898-922对应于多个侧面结构域，并且其中这些POI插入、替代或部分替代至少一个或至少两个这类侧面结构域。
20.一种经安排用于表达融合蛋白的核酸，所述核酸在框内包含: 1.编码所述融合蛋白的信号肽的序列，该信号肽能够将该融合蛋白靶向革兰氏阴性细菌的内膜； .编码所述融合蛋白的载客结构域的序列，该载客结构域包含来自自转运蛋白的β茎部结构域；以及 ii1.编码所述融合蛋白的易位蛋白结构域的序列，该易位蛋白结构域源自自转运蛋白， 其中该编码载客结构域的序列包含允许框内地克隆至少两个编码POI (感兴趣多肽)的DNA序列的至少两段克隆位点序列，所述克隆位点序列如此安排，从而该载客结构域的所编码的β茎部形成蛋白序列是基本上完整的。
21.根据权利要 求20所述的核酸，其中编码该处于其天然形式的自转运蛋白的载客结构域的序列包含至少两段序列，这些序列编码从该β茎部结构域突出的侧面结构域，并且其中该至少两段克隆位点序列的每一个插入、替代或部分替代所述编码侧面结构域的序列段的独立段。
22.—种经安排用于表达融合蛋白的核酸，所述核酸在框内包含: 1.编码所述融合蛋白的信号肽的序列，该信号肽能够将该融合蛋白靶向革兰氏阴性细菌的内膜； .编码所述融合蛋白的载客结构域的序列，该载客结构域包含来自自转运蛋白的β茎部结构域； ii1.编码所述融合蛋白的易位蛋白结构域的序列，该易位蛋白结构域源自自转运蛋白；和 IV.编码所述融合蛋白的多于一种POI (感兴趣多肽)的序列， 其中这些编码POI的序列与该编码载客结构域的序列融合并且如此安排，从而该载客结构域的所编码的β茎部形成蛋白序列是基本上完整的。
23.根据权利要求22所述的核酸，其中该编码处于其天然形式的自转运蛋白的载客结构域的序列包含至少两段序列，这些序列编码从该β茎部结构域突出的侧面结构域，并且其中这些编码POI的序列的每一个插入、替代或部分替代所述编码侧面结构域的序列段的独立段。
24.根据权利要求20-23中任一项所述的核酸，进一步包含编码一种切割位点的序列，该切割位点允许该编码的融合蛋白从携带所述核酸的宿主细胞中分泌。
25.根据权利要求20-23中任一项所述的核酸，不包含编码一种允许分泌的切割位点的序列，或包含一种破坏的切割位点，从而该编码的融合蛋白经安排以展示于携带所述核酸的宿主细胞的细胞表面上。
26.根据权利要求20-25中任一项所述的核酸，其中编码ii)中载客结构域和iii)中易位蛋白结构域的序列源自编码一种SPATE蛋白(肠杆菌科的丝氨酸蛋白酶自转运蛋白)的基因。
27.根据权利要求26所述的核酸，其中该SPATE蛋白是来自大肠杆菌的血红蛋白结合蛋白酶(Hbp)、胞外丝氨酸蛋白酶(EspC)或温度敏感性血凝素(Tsh)。
28.根据权利要求27所述的核酸，其中编码该SPATE蛋白的基因对与SEQID NOl或SEQ ID N02相似至少90%的蛋白质序列进行编码。
29.根据权利要求28所述的核酸，其中SEQID NOl或SEQ ID N02的氨基酸53-308、533-608,657-697,735-766和898-922对应于多个侧面结构域，并且其中安排这些克隆位点或编码POI的序列以替代或部分地替代至少一个或至少两个这类侧面结构域。
30.一种载体，其包含根据权利要求20-29中任一项所述的核酸。
31.一种宿主细胞,其包含根据权利要求20-30中任一项所述的核酸或载体。
32.根据权利要求1-11和31所述的宿主细胞，其是革兰氏阴性细菌。
33.根据权利要求32所述的宿主细胞，其选自肠杆菌科，如大肠杆菌、沙门氏菌属某些物种、弧菌属某些物种、志贺氏菌属某些物种、假单胞菌属某些物种、伯克霍尔德菌属某些物种或德特氏菌属某些物种。
34.一种外膜小泡，在其表面上展示根据权利要求的12-19中任一项所述融合蛋白。
35.一种菌影，在其表面上展示根据权利要求的12-19中任一项所述融合蛋白。
36.一种用于融合蛋白的分泌性蛋白表达的方法，该方法包括步骤 1.提供一种根据权利要求1-11或31-33中任一项所述的宿主细胞； .诱导该融合蛋白的表达。
37.根据权利要求36所述的方法，该方法包括另外的步骤:抑制该宿主细胞中具有蛋白酶活性的周质酶。
38.根据权利要求37所述的方法，其中该酶是DegP。
39.根据权利要求38所述的方法，其中通过DegP催化位点中的突变抑制DegP。
40.根据权利要求35-39中任一项所述的方法，该方法包括另外的步骤:下调该宿主细胞的周质间隙内催化蛋白质中二硫键形成的至少一种酶。
41.根据权利要求40所述的方法，其中该酶是DsbA或DsbB。
42.根据权利要求36-41中任一项所述的方法，其中该融合蛋白以可溶性方式分泌。
43.根据权利要求36-41中任一项所述的方法，其中该融合蛋白展示在该细胞表面上。
44.根据权利要求36-43中任一项所述的方法，其中该宿主细胞是革兰氏阴性细菌并且其中该方法包括另外的步骤:诱导小泡从该革兰氏阴性细菌的外膜排出，因此形成在它们的表面上展示该融合蛋白的外膜小泡。
45.根据权利要求36-43中任一项所述的方法，其中该宿主细胞是革兰氏阴性细菌并且其中该方法包括另外的步骤:裂解该革兰氏阴性细菌以形成在它们的表面上展示该融合蛋白的菌影。
46.根据权利要求45所述的方法，其中通过使用来自噬菌体PhiX174的致死性裂解基因E进行该裂解。
47.根据权利要求1-11或31-33所述的宿主细胞、根据权利要求12-19所述的融合蛋白、根据权利要求20-29所述的核酸、根据权利要求30所述的载体、根据权利要求34所述的外膜小泡、根据权利要求35所述的菌影或根据权利要求36-46所述的方法，其中这些POI的至少一种包含抗原，例如来自感染性生物的抗原。
48.根据权利要求47所述的宿主细胞、核酸、载体、融合蛋白或方法，其中该抗原是来自结核分枝杆菌的抗原。
49.根据权利要求48所述的宿主细胞、核酸、载体、融合蛋白或方法，其中该来自结核分枝杆菌的抗原选自下组，该组由以下各项组成:ESAT-6、Ag85B、Rv2660c、TB10.4和TB10.3或与这些蛋白质相似的蛋白质。
50.根据权利要求49所述的宿主细胞、核酸、载体、融合蛋白或方法，其中该抗原是已经分裂成N’部分(Ag85B(N’))和C’部分(Ag85B(C’ ))的Ag85B，并且其中每个部份与来自自转运蛋白的载客结构域的独立侧面结构域融合。
51.根据权利要求49所述的宿主细胞、核酸、载体、融合蛋白或方法，其中抗原ESAT-6、Ag85B、Rv2660c、TB10.4和TB10.3的至少2种，如2、3或4种，每种以分裂或全序列形式融合至、插入、替代或部分替 代来自自转运蛋白的载客结构域的独立侧面结构域。
52.—种疫苗，包含根据权利要求47-51中任一项所述的宿主细胞、融合蛋白、外膜小泡或菌影。
全文摘要
本发明提供了一种适合于多于一种感兴趣多肽(POI)的分泌的融合蛋白，其包括信号肽、POI、包含来自自转运蛋白的β茎部结构域的载客结构域、以及来自自转运蛋白的易位蛋白结构域，其中该载客结构域的β茎部形成序列是基本上完整的并且该(这些)POI与该β茎部结构域融合。
文档编号C12N15/62GK103228787SQ201180046204
公开日2013年7月31日 申请日期2011年9月28日 优先权日2010年9月28日
发明者约恩·路易林克, 沃特·S·P·钟 申请人:阿贝拉生物科学公司