专利名称：高致病性猪繁殖与呼吸征病毒nasba-elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒NASBA-ELISA检测装置，特别是一种高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒NASBA-ELISA检测试剂盒。
背景技术：
高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒是由变异型猪繁殖与呼吸综合病毒引起猪的一种繁殖障碍和呼吸道疾病的急性高致死性疫病。自2006年下半年以来，由高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的“高热病”，造成了大量的猪群发病死亡，成为影响我国养猪业发展的巨大绊脚石。目前，检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒有多种，如病毒分离、 RT-PCR和实时荧光RT-PCR技术。病毒分离敏感度不高，而且操作烦琐，成本较高，周期较长，对病料的要求较高；目前，广泛应用的常规RT-PCR检测方法简单、方便、快速，但仍存在假阳性和PCR污染的问题；实时荧光RT-PCR ( real-time RT-PCR)技术虽然灵敏度较高，但仪器设备和技术含量都要求较高，不适合基层兽医部门的诊断。依赖核酸序列的扩增(nucleuic acid sequence based amplification , NASBA)是在 PCR 基础上发展起来的一种新技术，该项技术由I对带有T7启动子序列的引物引导的连续、等温、基于酶反应的核酸扩增技术，反应在41°C条件下进行，可在2 h内将模板RNA扩增109倍，比常规PCR 法高103倍，而且不需特殊仪器，是一种快速、简便、特异的扩增技术，具有敏感性高、特异性好、操作简单等特点，很适合基层兽医部门推广应用。当前，虽然梁海霞[1]等报道建立了高致病性猪生殖和呼吸综合征病毒NASBA-ELISA检测方法，但该方法存在以下缺陷1、 方法应用了两种特异性探针，致使方法敏感性不高，仅能检测到101·83TCID5ciAiI的病毒；2、 方法仅限于对高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒的检测，未用于检测临床病料，无法知道其实际的应用效果。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足之处，而提供一种快速、简便、敏感性高、特异性强的能解决基层兽医部门诊断和防控高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒困难的问题， 减少猪群的发病率和死亡率，提闻养殖效益，促进养猪业持续、闻效和健康发展的闻致病性猪繁殖与呼吸征病毒NASBA-ELISA检测试剂盒。一种高致病性猪繁殖与呼吸征病毒NASBA-ELISA检测试剂盒，该试剂盒包括如下组分构成2mMdNTP, 2. 46nM Dig-11-UTP, IOmM Kcl,40mM Tris-Hcl, 12mMMgCl2, 20%DMS0 (二甲基亚砜)，5mM DTT，0. 2mM上下游各引物，8URNA酶H，40URNA聚合酶，12U AMV酶，BSA， 上游引物为 Pl :5、-ACATGACGAGCTGCT-3 ,，下游引物 P2 :5、- CTAATACGACTCACTATAGGGA GAAGGGTCCACATCCACACCATC-3 '，其中“CTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG”为 T7 启动子序列；生物素探针5 ' - biotin-GATGTCGCCGCGGGAGTCT-3 ^，链霉亲和素包被的ELISA板条、由 30%甲酰胺，6XSSC，0. 1%SDS, I Xdenhardt, O. lng/ml变性鲑鱼精DNA构成的杂交液、地高辛抗体-P0D、底物POD、2M硫酸、TBST洗涤液、阳性对照、阴性对照；
所述的阳性对照、阴性对照为以酶标仪测定OD49tol的值，阳性对照OD49tol均值在O. 6以上。当样品OD49tlnm彡2. I*阴性对照的OD49tlnm值时，结果判定为阳性；当样品OD49tol < 2. I* 阴性对照的OD49tlnm值时，结果判定为阴性。以下说明本发明高致病性猪繁殖与呼吸征病毒NASBA-ELISA检测试剂盒组分的选用理由及其具体操作方法
(一)病毒RNA提取RNA的提取按Invitrogen TRIzol Reagent说明书进行。( 二)NASBA反应体系及反应条件的建立
I、反应体系共25μ1 5μ1的RNA产物，20μ1的扩增试剂(包含4mMNTP, 2mMdNTP, 2. 46nM Dig-11-UTP, IOmM Kcl,40mM Tris-Hcl, 12mMMgcl2, DMSO (二甲基亚砜)20%，5mM DTT,0. 2mM 上下游各引物，加入DEPC水处理过的PCR管中，65 °C 5min，42 V冷却5min，快速加上混合酶 5μ1 (包含 8URNA 酶 H，40URNA 聚合酶，12U AMV 酶，2. 6PgBSA)，缓慢混匀，41°C 100 min, -20°C终止反应。2、特异性测定
提取经典 PRRSV-VR2332、高致病性 PRRSV-FJ07A、CSFV, PCV2, PRV 等病毒的 RNA 或 DAN 分别进行NASBA扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察，结果只高致病性PRRSV-FJ07A有扩增出目的条带，其他为阴性。(图I)。3、DMSO浓度优化
DMSO按5%、10%、15%、20%、25%系列浓度加入NASBA反应体系中进行扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测其产物，结果反应体系中最佳的DMSO浓度为20%，该浓度时条带清晰。(图2)
4、Mg2+浓度[D1]
MgCl2按4mM、7mM、IOmM, 12mM浓度加入NASBA反应体系中进行扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测其产物，结果反应的最佳Mg2+浓度为12mM。(图3)。5、反应温度优化
将反应温度分别设置在30°C、35°C、4rC进行扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测其产物，结果反应的最佳温度为41°C (图4)。综上所述建立NASBA检测方法的最佳反应体系和条件是反应体系共25μ1 5μ1 的 RNA 产物，20μ1 的扩增试剂(包含 4mMNTP, 2mMdNTP, 2. 46nM Dig-11-UTP, IOmM Kcl,40mM Tris-Hcl, 12111^%(312，01^0(二甲基亚砜)20%，51111 DTT，0. 2mM 上下游各引物，加入 DEPC 水处理过的PCR管中，650C 5min, 42°C冷却5min，快速加上混合酶5μ1 (包含8URNA酶H，40URNA 聚合酶，12U AMV酶，2. 6PgBSA)，缓慢混匀，41 °C 100 min, _20°C终止反应。(三)建立ELISA检测方法。目的是检测NASBA产物
I、链霉亲和素包被的ELISA板条制备①用含25 Pg/mL链霉亲和素的O. 05mol/ L碳酸盐缓冲液(pH 9.6)包被96孔板，每孔ΙΟΟμΙ，室温孵育过夜。②用含3% BSA的
0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.6)封闭96孔板，每孔ΙΟΟμΙ，37°C孵育2 h，TBST洗涤3 次，一 20°C保存备用。2、NASBA扩增产物ELISA检测(I)在霉亲和素包被的微孔板，每孔加入44μ1杂交液， μ 生物素探针，5μ1 NASBA扩增产物(95°C加热2mim)，共50μ1，轻微振荡混匀，42°C孵育2h。TBST洗板3次。(2)每孔加入ΙΟΟμΙ抗地高辛抗体(I :1000稀释)，37°C作用30min, TBST洗板6次。(3)每孔加入ΙΟΟμΙ P0D，37°C避光显色IOmin后，每孔加入2M硫酸ΙΟΟμΙ终止显色。(4)酶标仪测定OD49tlnm的值。(5)判断标准阳性对照OD49tol均值在0. 6以上。当样品OD49tlnm≥2. I*阴性对照的OD49tol值时，结果判定为阳性；当样品OD49tlnm < 2. I*阴性对照的OD49tol值时，结果判定为阴性。该判定标准是通过检测20份阳性样品和20份阴性样品，采用统计学软件分析得到
O3、特异性测定
利用建立的NASBA方法，对高致病性PRRSV-FJ07A、经典PRRSV VR-2332、CSFV, PRV, PCV2、阳性品及MC-145细胞的RNA或DNA进行NASBA扩增，同时设定水为模板进行NASBA产物为阴性对照，产物采用ELISA检测，结果见表I。结果显示高致性PRRSV-F J07A为阳性， 其他RNA或DNA病毒为阴性，由此表明本试验建立的NASBA-ELISA方法具有很好的特异性。 表I. NASBA-ELISA的特异性试验
权利要求
1.一种高致病性猪繁殖与呼吸征病毒NASBA-ELISA检测试剂盒，该试剂盒包括如下组分构成2mMdNTP, 2. 46nM Dig-11-UTP, IOmM Kcl,40mM Tris-Hcl, 12mMMgCl2, 20%DMS0 (二甲基亚砜)，5mM DTT，0. 2mM上下游各引物，8URNA酶H，40URNA聚合酶，12U AMV酶，BSA，上游引物为 Pl :5、-ACATGACGAGCTGCT-3 ,，下游引物 P2 :5、- CTAATACGACTCACTATAGGGAGA AGGGTCCACATCCACACCATC-3 ^，其中“CTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG”为 T7 启动子序列；生物素探针5 ' - biotin-GATGTCGCCGCGGGAGTCT-3 '，链霉亲和素包被的ELISA板条、由30% 甲酰胺，6XSSC，0. 1%SDS, I Xdenhardt, O. lng/ml变性鲑鱼精DNA构成的杂交液、地高辛抗体-P0D、底物POD、2M硫酸、TBST洗涤液、阳性对照、阴性对照；所述的阳性对照、阴性对照为以酶标仪测定OD49tol的值，阳性对照OD49tol均值在O. 6以上，当样品OD49tlnm ^ 2. I*阴性对照的OD49tol值时，结果判定为阳性；当样品OD49tol < 2. I* 阴性对照的OD49tlnm值时，结果判定为阴性。
全文摘要
本发明公开了一种高致病性猪繁殖与呼吸征病毒NASBA-ELISA检测试剂盒，其包括2mMdNTP,2.46n MDig-11-UTP，10mMKcl，40mMTris-Hcl，12mMMgCl2,20%DMSO(二甲基亚砜)，5mMDTT，0.2mM上下游各引物，8URNA酶H，40URNA聚合酶,12UAMV酶,BSA，上游引物为P15ˋ-ACATGACGAGCTGCT-3ˊ，下游引物P25ˋ–CTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGGTCCACATCCACACCATC-3ˊ，其中“CTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGG”为T7启动子序列；生物素探针5ˋ-biotin-GATGTCGCCGCGGGAGTCT-3ˊ，链霉亲和素包被的ELISA板条、由30%甲酰胺，6×SSC，0.1%SDS，1×denhardt，0.1ng/ml变性鲑鱼精DNA构成的杂交液、地高辛抗体-POD、底物POD、2M硫酸、TBST洗涤液、阳性对照、阴性对照。其提供了一种快速、简便、敏感性高、特异性强的能解决基层兽医部门诊断和防控高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒困难的问题，减少猪群的发病率和死亡率，提高养殖效益，促进养猪业持续、高效和健康发展。
文档编号C12Q1/68GK102586482SQ201210046548
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月27日 优先权日2012年2月27日
发明者吴学敏, 周伦江, 庄向生, 王隆柏, 车勇良, 陈如敬, 魏宏 申请人:吴学敏, 周伦江, 庄向生, 王隆柏, 福建省农业科学院畜牧兽医研究所, 车勇良, 陈如敬, 魏宏