专利名称：一种可同时抑制t、b淋巴细胞功能的免疫融合蛋白、其制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可同时抑制T、B淋巴细胞功能的免疫融合蛋白、其制备方法及其应用，属于生物工程技术领域。
背景技术：
自身免疫性疾病(autoimmunity diseases)是机体免疫系统对自身成分发生免疫应答的疾病状态，往往是由于T淋巴细胞和B淋巴细胞免疫功能亢进而导致的一类疾病。自身免疫性疾病在人群中的发病率约为3% 5%。自身免疫疾病种类很多，包括类风湿关节炎(RA)、银屑病、系统性红斑狼疮(SLE)、硬皮病、I型糖尿病(Type I diabetes)等一类疾病。T淋巴细胞和B淋巴细胞是人体免疫系统的两种最为重要的功能细胞，在机体免疫应答和免疫反应中扮演重要角色。T淋巴细胞介导细胞免疫，B淋巴细胞介导体液免疫， 二者既相互区别又相互联系。T细胞激活时需要其细胞膜上的抗原识别受体(TCR)识别抗原提呈细胞(APC)表面的主要组织相容性复合体(MHC)沟槽中特异抗原肽，构成T淋巴细胞免疫活化的第一信号。T淋巴细胞和抗原提呈细胞(APC)表面众多的协同刺激分子 (costimulatory molecules)和相应受体(costimulatory molecules receptor, CMR)构成活化的第二刺激信号，例如CD4与MHC II类分子配对；CD8与MHC I类分子配对；CD28与 B7 (CD80)配对；LFA2(CD2)与LFA3 (CD58)配对；LFA1与ICAMl配对等均可作为第二信号， 其中以⑶28与B7(⑶80)相互作用在T淋巴细胞活化时最为重要。同样地，B淋巴细胞对胸腺依赖抗原(TDAg)的刺激反应中需要与T淋巴细胞相互作用，B淋巴细胞才能活化。首先 B淋巴细胞通过胞膜上的抗原识别受体(BCR)与抗原结合，抗原内化后，经胞内溶酶体等加工处理成顺序决定簇抗原，顺序决定簇抗原与MHC II类分子结合表达于细胞膜表面，B淋巴细胞作为抗原提呈细胞(APC)将抗原递呈给辅助性T淋巴(T h)细胞，Th细胞活化并表达膜分子和分泌多种淋巴因子(IL-2，IL-4，IL-6等)，在这些分子作用下B淋巴细胞表达高亲和力的BCR和丰富的MHCII类分子。在B淋巴细胞活化中⑶40分子与⑶40L的结合， B淋巴细胞活化因子(BlyS)分别与其三种受体即B细胞成熟抗原(BCMA)、穿膜蛋白活化物 (TACI)和B细胞活化因子受体(BAFF-R)的结合，为B细胞活化的第二刺激信号。综上所述，T淋巴细胞和B淋巴细胞活化中共刺激信号(第二刺激信号)扮演着重要的角色，没有共刺激信号T淋巴细胞和B淋巴细胞将不能活化。鉴于自身免疫性疾病往往是由于T淋巴细胞和B淋巴细胞过度活化，功能亢进而导致的一类疾病。所以，阻断T 淋巴细胞和B淋巴细胞活化共刺激信号可以降低免疫反应，达到治疗自身免疫性疾病的目的，是目前治疗自身免疫性疾病的措施之一。下表是全球已上市和在研临床III期以上阻断共刺激信号抗体类药物的品种列表。表I上市和在研临床III期以上阻断共刺激信号抗体类药物的品种列表序号尚品名英文名研发公司类型作用靶点适应症上市国家及时间IAmevivealefaceptAstellasLFA3/IgGl 融合蛋白CD2银屑病2003 年美国2OrenciaabataceptBMSCTLA4/IgGl 融合蛋白CD28类风湿2006 美国3BenlystabelimumabHuman Genome Sciences人源抗体B淋巴细胞活化因子(BlyS)系统性红斑狼疮2011 年美国4YervoyipilimumabMedarex人源抗体CTLA4黑色素瘤、前列腺癌2011 年美国5NulojixbelataceptBMSCTLA4/IgGl 融合蛋白(局亲和)CD28抗移植排斥2011 年美国6ataciceptZymoGeneti CSTACI/ IgGl 融合蛋白B淋巴细胞活化因子(BlyS)狼疮肾炎，红斑狼疮Phase III表中alefacept、abatacept、belatacept 和 atacicept 的结构均为受体-Fe 融合蛋白。该类结构已经被证实是除了抗体药物以外，能清除体内多余配体分子的一种有效手段。目前上市的有 etanercept (1998)、alefacept (2003)、abatacept (2006)、 riIonacept (2008)和belatacept (2011)均为此结构，其中不乏“重磅炸弹”级药物， etanercept在2009年和2010年全球销售额达80亿和84亿美元。受体-Fe融合蛋白中受体结构域在融合蛋白中执行结合配体的功能，而Fe部分(包括轻链恒定区)具有多种作用易检测，可使用通用的抗人二抗进ELISA检测；易纯化，通过与protein A的结合而使用亲和层析方便地纯化；增加半衰期，IgG重链恒定区约有氨基酸残基330个，轻链恒定区约有氨基酸残基110个，组合成4肽链后分子量超过IOOkDa,大大延长药物在体内的半衰期； 可提供额外的生物学效应如补体激活、ADCC效应等免疫调节活性。此外，与抗体药物相比受体-Fe融合蛋白不必进行繁琐的抗体筛选和人源化过程，具有亲和力高、免疫源性低等优点。⑶28 CTLA-4/B7 (⑶80)为T淋巴细胞重要的共刺激信号(第二刺激信号)。细胞毒性T细胞相关抗原4(CTLA-4/CD152)和CD28同为免疫球蛋白超基因家族成员，二者具有 70%的同源性，均为表达于T细胞表面的跨膜受体。⑶28和CTLA-4是一对具有正负调节功能的重要共刺激分子，二者竞争性结合B7分子，但CTLA4与其配体B7分子亲和力较CD28 大20倍。⑶28与APC上的B7-1和B7-2的结合后能够传递共刺激信号给T淋巴细胞，增强 ⑶3/TCR复合体或⑶2分子的作用，诱导T淋巴细胞活化和分泌多种细胞因子。CTLA-4则抑制T淋巴细胞的增殖、活化，诱导活化的T淋巴细胞凋亡，是机体免疫系统维持的关键环节。 ⑶28和CTLA-4的天然配体为存在于APC表面的B7分子家族，包括B7-1 (⑶80)、B7_2 (⑶86) 和B7-3。B7-1和B7-2表达于激活的单核细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞，B7-3 主要在角质细胞上表达。
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B淋巴细胞活化因子(BlyS)与其受体则为B淋巴细胞的重要活化信号。B淋巴细胞活化因子(B lymphocyte stimulator, Blys)又被称为 THANK(TNF homologue that activates apotosis, nuclear factor-κ B, and c-JUN NH2_terminal kinase), TALLl(TNF and apoptosis ligand-related leukocyte expressed ligand-I), BAFF(B cell activating faetors belonging to the TNF family), zTNF4 及 TNF 13B,是 1999 年发现的肿瘤坏死因子(TNF)配体超家族成员。作为B细胞的共刺激因子，Blys的主要作用是刺激B淋巴细胞增殖、分化和分泌抗体，其正常表达维持依赖和不依赖T细胞抗原刺激的B细胞活化和增殖至关重要。Blys还参与T细胞介导的免疫功能。Blys受体分别为 B 细胞成熟抗原(B cell maturation antigen, BCMA)、穿膜蛋白活化物(transmembrane activator and CAML interacter, TACI)和 BAFF-R,这三种受体与 Blys 的亲和力都达到 Sub-nanomolar级，其中BCMA及TACI均为BLyS与肿瘤坏死因子家族另一成员APRIL(a proliferation-inducing ligand, 一种诱发增殖的配体)的共受体，BAFF-R是BLyS的特异性受体。Blys的过量表达或缺陷均能引起机体的免疫失衡进而诱发各种自身免疫性疾病。 B淋巴细胞活化因子(Blys)是目前治疗自身免疫性疾病良好的靶标。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种可同时抑制T、B淋巴细胞功能的免疫融合蛋白、其制备方法及其应用。本发明的可同时抑制T、B淋巴细胞功能的免疫融合蛋白，所述的免疫融合蛋白包括两部分一部分为序列如SEQ ID. I所示的氨基酸序列组成的多肽链；另一部分为序列如 SEQ ID. 2所示的氨基酸序列组成的多肽链。本发明的可同时抑制T、B淋巴细胞功能的免疫融合蛋白的制备方法，包括以下步骤I)将B淋巴细胞活化因子(BlyS)三种受体之一的穿膜蛋白活化物(TACI)胞外功能结构域和人免疫球蛋白κ轻链恒定区Ck编码基因通过重叠PCR方法连接，得到核苷酸序列如SEQ ID. 3所示的TACI/C κ编码基因；2)同样将 CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4)胞外功能结构域与人的IgG4重链恒定区Fc(CHl、CH2和CH3)编码基因连接，得到核苷酸序列如SEQ ID. 4所示的CTLA-4/IgG4Fc编码基因；其中IgG4Fc恒定区有两个氨基酸突变，第228位的 S突变为P，第235位的L突变为E ；3)将克隆得到的上述扩增产物经限制性内切酶酶切后克隆至真核细胞表达载体；4)真核细胞表达载体转染至工程细胞(CH0、293或NSO细胞)中，在上述细胞中组装成同抗体类似的4肽链结构，得到Ultra-T/B免疫融合蛋白。Ultra_T/B免疫融合蛋白为一种受体-Fe (Fragment cristallizable)融合蛋白。本发明的可同时抑制T、B淋巴细胞功能的免疫融合蛋白，具有用于制备治疗由于 T淋巴细胞和B淋巴细胞免疫功能亢进而导致自身免疫性疾病的药物的用途。本发明中，一方面为使Ultra-T/B免疫融合蛋白在真核细胞，特别是CHO细胞中高表达，对融合蛋白的编码基因进行了优化，使其更适于在CHO细胞中表达；另一方面为进一步降低免疫融合蛋白可能具有与效应细胞(T淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞)Fe YR 的结合能力和提高IgG4的稳定性，对IgG4铰链区和CH2恒定区的氨基酸残基S228P， L235E (Fe氨基酸残基编号按Kabat数据库)进行了突变。在IgG四种亚类中本发明之所以选择IgG4是由于IgG4与Clq的结合能力最弱，不能经经典途径激活补体，产生补体介导的细胞毒作用(CDC效应)，也不能结合单核巨噬细胞，不能介导抗体依赖的细胞毒作用(ADCC 效应)；但IgG4分子的缺点是形成的二聚体不够稳定以及有一定的结合中性粒细胞Fe Y R 的能力，本发明中通过铰链区和CH2恒定区氨基酸的突变的可以克服IgG4分子的上述缺陷。因此本发明的Ultra-T/B免疫融合蛋白可作为一种未来治疗自身免疫性疾病反复使用药物，可降低未来用于患者体内后由此产生的毒副作用。经ELISA方法检测 Ultra-T/B免疫融合蛋白(或免疫融合蛋白305)在体外可以很好的结合可溶性CD80 (B7) 和B淋巴细胞活化因子(Blys)这两种T淋巴细胞和B淋巴细胞活化分子，将来用于体内可同时抑制T淋巴细胞和B淋巴细胞的活化作用，未来可用于类风湿关节炎(RA)、银屑病、系统性红斑狼疮(SLE)、硬皮病、I型糖尿病(Type I diabetes)等自身免疫性疾病的治疗。说明书附Ia为TACI/C κ表达载体的构建过程中PCR扩增C κ和TACI的电泳图，其中， LC κ扩增产物；2，TACI扩增产物；3，分子量标准；图Ib为TACI/C κ表达载体的构建过程中重叠PCR扩增TACI/C κ的电泳图，其中，1，TACI/C K扩增产物；2，分子量标准；图Ic为TACI/C κ表达载体的构建过程中双酶切鉴定PHG_TACI/C κ载体的电泳图，其中，I，pHG-TACI/C κ载体；3，分子量标准；图2a为CTLA_4/IgG4表达载体的构建过程中PCR扩增IgG4和CTLA-4的电泳图， 其中，1，IgG4扩增产物；2，分子量标准；3，CTLA-4扩增产物；图2b为CTLA-4/IgG4表达载体的构建过程中重叠PCR扩增CTLA_4/IgG4的电泳图，其中，1，CTLA-4/IgG4回收产物；2，分子量标准；图2c为CTLA-4/IgG4表达载体的构建过程中双酶切鉴定pLG-CTLA_4/IgG4的电泳图，其中，1，pLG-CTLA-4/载体；2，分子量标准；图3为双酶切鉴定Ultra-T/B免疫融合蛋白表达载体的电泳图，其中，1，分子量标准；2，Ultra-T/B免疫融合蛋白表达载体；图4为Ultra-T/B免疫融合蛋白结构图；图5为Ultra-T/B免疫融合蛋白与CD80 (B7)的结合结果示意图；图6为Ultra-T/B免疫融合蛋白与Blys的结合结果示意图；图7为Ultra-T/B免疫融合蛋白纯化产物SDS-PAGE结果示意图，其中1，蛋白质 Marker ;2，纯化产物I (非还原);3，纯化产物2 (非还原);4，蛋白质Marker ;5，纯化产物 1(还原)；6，纯化产物2(还原)。
具体实施例方式实施例I构建Ultra-T/B免疫融合蛋白包括以下步骤
一、Ultra-T/B免疫融合蛋白基因的克隆I、基因的合成委托上海捷瑞生物工程有限公司合成TACI编码基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID. 5所示；同样，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成CTLA-4编码基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID. 6所示。2、表达载体的构建 材料含Ck和IgG4Fc恒定区(IgG4)氨基酸残基，其中IgG4Fc恒定区有两个氨基酸突变，第228位的S突变为P，第235位的L突变为E，(Fe氨基酸残基编号按Kaba数据库)，由本单位构建。引物设计
权利要求
1.一种可同时抑制T、B淋巴细胞功能的免疫融合蛋白，其特征在于，所述的免疫融合蛋白包括两部分一部分为序列如SEQ ID. I所示的氨基酸序列组成的多肽链；另一部分为序列如SEQ ID. 2所示的氨基酸序列组成的多肽链。
2.制备如权利要求I中所述的可同时抑制T、B淋巴细胞功能的免疫融合蛋白的构建方法，其特征在于，包括如下步骤1)将TACI和Ck编码基因连接，得到核苷酸序列如SEQID. 3所示的TACI/Ck编码基因;2)将CTLA-4和IgG4Fc恒定区的编码基因连接，得到核苷酸序列如SEQID. 4所示的 CTLA-4/IgG4 Fe编码基因；其中IgG4 Fe恒定区有两个氨基酸突变，第228位的S突变为 P，第235位的L突变为E ;3)将克隆得到的上述扩增产物经限制性内切酶酶切后克隆至真核细胞表达载体；4)真核细胞表达载体转染至工程细胞中，在上述细胞中组装成同抗体类似的4肽链结构，得到可同时抑制T、B淋巴细胞功能的免疫融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所说的工程细胞选自CH0、293或NSO 细胞。
4.如权利要求I中所述的可同时抑制T、B淋巴细胞功能的免疫融合蛋白，具有用于制备治疗由于T淋巴细胞和B淋巴细胞免疫功能亢进而导致自身免疫性疾病的药物的用途。
全文摘要
本发明提供了一种可同时抑制T、B淋巴细胞功能的免疫融合蛋白、其制备方法及其应用。本发明的融合蛋白具有细胞毒性T细胞相关抗原4(cytotoxicT-lymphocyte-associatedprotein4，CTLA-4)和穿膜蛋白活化物(transmembraneactivatorandCAMLinteracter，TACI)胞外功能结构域的功能区，能与抗原提呈细胞表面分子B7(CD80)和B淋巴细胞活化因子(BlyS)特异地、高亲和性结合，具有抑制T淋巴细胞和B淋巴细胞活化的能力。由于自身免疫性疾病(autoimmunitydiseases)是T淋巴细胞和B淋巴细胞免疫功能亢进而导致的一类疾病，因此Ultra-T/B免疫融合蛋白具有治疗类风湿关节炎(RA)、银屑病、系统性红斑狼疮(SLE)、硬皮病、I型糖尿病(TypeIdiabetes)等一类疾病的潜力。
文档编号C12N15/85GK102585016SQ20121005765
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月6日 优先权日2012年3月6日
发明者万露, 杨思仪, 王星恒, 王星源, 耿达天, 胡品良, 陈宏 , 高晓雨 申请人:江苏健德生物药业有限公司