专利名称：山羊传染性胸膜肺炎病原检测双重pcr诊断试剂盒及制备、使用方法
技术领域：
本发明涉及一种山羊传染性胸膜肺炎病原检测双重PCR诊断试剂盒及制备方法。
背景技术：
山羊传染性胸膜肺炎(ContagiousCaprine Plneuropneumonia, CCPP),又称烂肺病，是山羊一种高度接触性传染病，我国农业部将其列为二类传染病，临床呈现纤维性肺炎及胸膜炎，发病后死亡率较高。丝状支原体簇(Mycoplasma mycoides cluster)成员中山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp. capripneumoniae, Mccp)、丝状支原体丝状亚种 LC 型(Mycoplasma mycoides subsp. mycoides LC, Mmm LC)与丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp. capri, Mmc)均可使山羊患CCPP,绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, Mo)也可感染山羊。目前，国内外对于CCPP的诊断主要依靠病原分离鉴定、血清学试验以及分子生物学技术。对比三种诊断方法，传统的分离鉴定由于支原体生长条件要求较高、生长速度缓慢的特点，因此诊断成本高且难度大、耗时长，无法立即解决快速诊断问题；血清学试验主要为间接血凝试验、补体结合试验与竞争ELISA，三者敏感性差或特异性差，且不能作为病原诊断方法；分子生物学技术具有快速、准确、灵敏、特异等优点，尤其是多重PCR方法可对不同病原同时进行诊断。因此，本发明设计了分别针对Mycoplasma mycoides cluster与Mycoplasma ovipneumoniae 16S rRNA基因的特异性引物,通过优化反应条件及体系，建立一种快速、灵敏、特异且能同时检测出Mycoplasma mycoides cluster与Mycoplasmaovipneumoniae的CCPP病原的诊断方法,为山羊CCPP防控提供了一定的技术支持。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，提供一种有效、快速、灵敏、特异的山羊传染性胸膜肺炎病原检测双重PCR诊断试剂盒及制备、使用方法，以避免临床对于CCPP疑似病例的病原检测盲目性与繁琐性，为CCPP防治提供技术支持，克服现有技术存在的诊断成本高且难度大、耗时长，无法立即解决快速诊断问题等不足。本发明的山羊传染性胸膜肺炎病原检测双重PCR诊断试剂盒，其原料配方为1000^2000 u L PCR 反应液，10(T200ii L Taq DNA 聚合酶，50 100 y L 阳性对照、50 100 y L阴性对照、lmL-2 mL超纯水。所述PCR反应液包括引物I混合液、引物2混合液、PCR反应缓冲液和dNTP，四种液体于PCR反应液中体积比为2:2:5:1。所述引物I为针对Mycoplasma mycoides cluster 16S rRNA基因通用引物Ps与Pa，引物浓度为IOiimol/ L，引物序列见表I。表I引物I (Ps与Pa)序列权利要求
1.一种山羊传染性胸膜肺炎病原检测双重PCR诊断试剂盒，其特征在于本试剂盒的原料配方为1000 200011 L PCR反应液，10(T200i! L 7 DNA聚合酶，50 100 y L阳性对照、5(Tl00iiL阴性对照和lmL 2 mL超纯水。
2.根据权利要求I所述的山羊传染性胸膜肺炎病原检测双重PCR诊断试剂盒，其特征在于PCR反应液包括引物I混合液、引物2混合液、PCR反应缓冲液和dNTP，四种液体于PCR反应液中体积比为2:2:5: I。
3.根据权利要求2所述的山羊传染性胸膜肺炎病原检测双重PCR诊断试剂盒，其特征在于弓丨物I为针对Mycoplasma mycoides cluster 16S rRNA基因通用引物Ps与Pa,引物浓度为IOiimol/ L，引物序列见表I : 表I引物I (Ps与Pa)序列引物I序列(5，一3’)'Ps_GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT_Pa Icagcgtcaataacaagccagtaag —O
4.根据权利要求2所述的山羊传染性胸膜肺炎病原检测双重PCR诊断试剂盒，其特征在于引物2为针对Mycoplasma ovipneumoniae 16S rRNA基因特异性引物Ms与Ma，引物浓度为lOumol/ L，引物序列见表2: 表2引物2 (Ms与Ma)序列 引物I序列(5，一3’)Ms_AAACTATGTGCCAGCAGCGTAAGMa Icaccatctgtcatctcgttagcc —O
5.根据权利要求2所述的山羊传染性胸膜肺炎病原检测双重PCR诊断试剂盒，其特征在于PCR反应缓冲液为IOXT^ Buffer并含Mg2+，该PCR反应缓冲液包括200mmol/LTris-HCl、pH8. 4，200mmol/L KCl, 100mmol/L- (NH4) 2S04 和 15mmol/L MgCl20
6.根据权利要求2所述的山羊传染性胸膜肺炎病原检测双重PCR诊断试剂盒，其特征在于dNTP为dATP、dGTP、dTTP、dCTP和dUTP在内等量混合游离核苷酸，其浓度为IOmmol/L0
7.根据权利要求I所述的山羊传染性胸膜肺炎病原检测双重PCR诊断试剂盒，其特征在于'Taq DNA聚合酶，其浓度为2. 5U/ U L/U L0
8.根据权利要求I所述的山羊传染性胸膜肺炎病原检测双重PCR诊断试剂盒，其特征在于阳性对照为丝状支原体簇与绵羊肺炎支原体16S rRNA基因部分序列克隆质粒混合物，其浓度为 I. OX IO5Copies/u L0
9.根据权利要求I所述的山羊传染性胸膜肺炎病原检测双重PCR诊断试剂盒，其特征在于阴性对照为不含丝状支原体簇与绵羊肺炎支原体16S rRNA基因部分序列的pMD18-T空载体质粒。
10.一种山羊传染性胸膜肺炎病原检测双重PCR诊断试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下内容第一，最佳反应退火温度的确定；第二，特异性检测；第三，敏感性检测；第四，临床应用性检测；第五，试剂盒包装。
11.根据权利要求10所述的山羊传染性胸膜肺炎病原检测双重PCR诊断试剂盒的制备方法，其特征在于最佳反应退火温度的确定过程如下取6支PCR反应管，每管中均加A PCR反应液10. OuL, TaqMk聚合酶I. 0 y L，阳性对照2. 0 y L，超纯水37. 0 y L ;以94°C预变性4min ;94°C变性40s，50°C 60°C退火40s，72°C延伸I. 5min，共34个循环后72°C延伸IOmin进行退火温度的梯度扩增，I. 0%琼脂糖凝胶电泳分析以确定最佳退火温度。
12.根据权利要求10所述的山羊传染性胸膜肺炎病原检测双重PCR诊断试剂盒的制备方法，其特征在于特异性检测过程如下取8支PCR反应管，每管中均加入PCR反应液10.0 ii L与Taqmk聚合酶I. 0 y L后，从第I管至第8管依次加入丝状支原体山羊亚种、绵羊肺炎支原体、大肠杆菌、链球菌、产气荚膜梭菌、沙门氏菌、巴氏杆菌及山羊痘病毒的基因组DNA各2. 0 ii L进行PCR扩增，I. 0%琼脂糖凝胶电泳分析以检测试剂盒特异性。
13.根据权利要求10所述的山羊传染性胸膜肺炎病原检测双重PCR诊断试剂盒的制备方法，其特征在于敏感性检测过程如下取6支PCR反应管，每管中均加入PCR反应液10. 0 il L与ragDNA聚合酶I. 0 y L后,从第I管至第6管依次加入浓度为I. OX IO7Copies/U L "I. OX IO2Copies/ u L的阳性对照2. 0 y L进行PCR扩增，I. 0%琼脂糖凝胶电泳分析以检测试剂盒敏感性。
14.根据权利要求10所述的山羊传染性胸膜肺炎病原检测双重PCR诊断试剂盒的制备方法，其特征在于临床应用性检测过程如下以所建双重PCR方法分别对不同份疑似CCPP病死山羊病变肺组织、胸腔积液及鼻腔分泌物进行检测，并与传统支原体分离及生化鉴定结果进行比较，以检测方法的临床应用性。
15.根据权利要求10所述的山羊传染性胸膜肺炎病原检测双重PCR诊断试剂盒的制备方法，其特征在于试剂盒包装过程如下将试剂原料按类别分别装入平底聚丙烯管内，贴标签后以全封闭式焊头封闭各管管口 ；将已装原料各管正面放置于泡沫试剂托盘上并装入试剂盒内；于试剂盒内放入使用说明书后胶封试剂盒；将包装好的试剂盒置_20°C保存。
16.一种山羊传染性胸膜肺炎病原检测双重PCR诊断试剂盒的使用方法，其特征在于包括以下过程①取出试剂盒内所装试剂置冰上彻底溶解取无菌PCR反应管，向内依次加入所述试剂将已加50. 0 ii L反应体系的PCR反应管置热循环PCR仪中，按以下反应程序进行PCR扩增94°C预变性4min ;94°C变性40s，54°C退火40s，72°C延伸I. 5min，共34个循环后72°C延伸IOmin ;④取8 y L扩增产物以I. 0%琼脂糖凝胶电泳检测结果，结果判定阴性对照无条带出现，阳性对照应出现两条412bp与534bp两条条带；若待检扩增模板仅出现大小约412bp特异性片段，则判定待检样本丝状支原体感染阳性；若待检扩增模板仅出现大小约534bp特异性片段，则判定待检样本绵羊肺炎支原体感染阳性；若待检扩增模板同时出现大小约534bp与412bp两条特异性片段，则判定待检样本丝状支原体与绵羊肺炎支原体感染阳性；若待检扩增模板无任何条带出现，则判定待检样本阴性。
全文摘要
本发明公开了一种山羊传染性胸膜肺炎病原检测双重PCR诊断试剂盒的原料配方及制备、使用方法。原料配方为1000~2000μLPCR反应液，100~200μLTaqDNA聚合酶，50~100μL阳性对照、50~100μL阴性对照、1mL-2mL超纯水。PCR反应液包括引物1混合液、引物2混合液、PCR反应缓冲液和dNTP，四种液体于PCR反应液中体积比为2:2:5:1。制备方法包括最佳反应退火温度的确定；特异性检测；敏感性检测；临床应用性检测和试剂盒包装。本发明对山羊养殖场疑似山羊传染性胸膜肺炎病羊病原、疑似病例的快速、确定性诊断提供了有效方法，为山羊传染性胸膜肺炎防控提供技术支持。
文档编号C12Q1/68GK102634601SQ20121014244
公开日2012年8月15日 申请日期2012年5月10日 优先权日2012年5月10日
发明者周碧君, 张双翔, 文明, 王开功, 程振涛 申请人:贵州大学