专利名称：基于t7核酸外切酶抑制分析检测有机小分子与结合蛋白相互作用的荧光生物传感方法
技术领域：
发明属于ー种检测有机小分子与结合蛋白相互作用的生物传感技术，其具体是指，中间修饰有机小分子的寡核苷酸DNA链与蛋白的相互作用，抑制位点的选择，17核酸外切酶抑制分析，和基于Taqman探针的实时荧光定量检测方法。
背景技术：
有机小分子与结合蛋白相互作用、药物与化学毒素等有机小分子以及有机小分子结合蛋白的快速筛查与检测对于临床诊断、医学研究、食品与公共安全、药物筛选、环境监测等领域具有极其重要的意义。目前常用的小分子与结合蛋白相互作用的检测技术主要有表面等离子共振、酶互补片断免疫分析以及荧光各向异性分析等。这些检测技术灵敏度不高、可靠性差，且需要精密的仪器，不能满足准确快速检测的需求。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对现有技术存在的不足，提出了一种基于17核酸外切酶抑制分析检测有机小分子与结合蛋白相互作用的生物传感方法，此方法设计简单，对DNA序列没有依赖性，仅需设计一条寡核苷酸DNA链和Taqman探针即可，在其中间抑制位点进行有机小分子标记后即可实现检测，此方法可实现多目标同时检测，并且操作简便、快速、灵敏。本发明的技术方案是，所述基于T7核酸外切酶抑制分析检测有机小分子与结合蛋白相互作用的生物传感方法为利用包含有中间修饰有机小分子的寡核苷酸DNA单链与蛋白相互作用后对T7核酸外切酶抑制，通过Taqman探针的荧光实时变化，定量分析检测有机小分子与蛋白的相互作用以及有机小分子或其结合蛋白。以下对本发明作进ー步说明
所述基于17核酸外切酶抑制分析检测有机小分子与结合蛋白相互作用的荧光生物传感方法包括
(1)包含中间有机小分子修饰的寡核苷酸DNA双链与蛋白的相互作用及T7核酸外切酶抑制分析；
(2)选择17核酸外切酶抑制位点；
(3)采用基于Taqman探针的实时荧光定量方法进行T7核酸外切酶抑制分析的定量检測。以下对本发明做出进ー步说明。所述包含中间有机小分子修饰的寡核苷酸DNA双链与蛋白相互作用的检测及17核酸外切酶抑制分析采用以下步骤实现
对于有机小分子与其结合蛋白的相互作用，检测步骤是取所述有机小分子修饰寡核苷酸DNA单链置于微量管中；再于微量管中加入包含有机小分子结合蛋白的样品溶液；然后17核酸外切酶以及Taqman探针反应，得抑制反应的产物；
对于有机小分子的检测，采用竞争反应检测的步骤是取所述有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链置于微量管中；再加入包含待测有机小分子的样品溶液，混合均匀后加入有机小分子结合蛋白或单克隆抗体溶液；再加入17核酸外切酶以及Taqman探针反应，得抑制反应的产物。
T7核酸外切酶抑制位点选择与Taqman探针5端互补的有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链下游I到3碱基中的任意ー个。所述17核酸外切酶抑制的定量检测可采用标准的Taqman探针突光实时定量检測。本发明中，所述寡核苷酸DNA单链的中间有机小分子的修饰通过现有的交联反应技术实现。例如，对于带有羧基的有机小分子，可以采用I-こ基-3- (3- ニ甲基氨丙基)-碳ニ亚胺与琥珀酰亚胺交联反应技术与中间碱基NH2标记寡核苷酸DNA单链进行交联；对于带氨基的有机小分子，可以采用4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-I-羧酸琥珀酰亚胺酷的交联反应技术与中间标记有巯基的寡核苷酸DNA单链进行交联。交联反应产物可用透析纯化。 进ー步地，本发明中，所述中间有机小分子修饰的寡核苷酸DNA链与蛋白的相互作用的检测及T7核酸外切酶抑制分析采用以下步骤实现
a.对于有机小分子与其结合蛋白的相互作用的检测的步骤是取7yL上述有机小分子修饰寡核苷酸DNA链置于微量管中，加入6 ii L 5X17核酸外切酶反应缓冲溶液(40 mMTris-HCl, 50 mM NaCl, 20 mM MgCl, pH 7. 5@25°C )，然后加入8 y L包含有机小分子结合蛋白的样品溶液，在37°C恒温反应0.5小时，再加入3 ii L 17核酸外切酶和6 ii L Taqman探针，置于37°C反应2h后,升温至75°C反应IOmin进行热灭活以终止酶反应。b.对于有机小分子的检测，采用竞争反应检测的步骤是取7 UL上述有机小分子修饰寡核苷酸DNA链置于微量管中，6 ii L 5X17核酸外切酶反应缓冲溶液(40 mMTris-HCl, 50 mM NaCl, 20 mM MgCl, pH 7. 5@25°C )，然后加入 5 y L 包含待测有机小分子的样品溶液，混合均匀后加入一定浓度的有机小分子的结合蛋白或(鼠源)单克隆抗体溶液3 u L，单克隆抗体终浓度为加入的有机小分子修饰寡核苷酸DNA链浓度的5倍；在37°C恒温反应0.5小时，再加入3 ii L 17核酸外切酶和6 ii L Taqman探针，置于37°C反应2 h后，升温至75°C反应IOmin进行热灭活以终止酶反应。注意，以上反应条件为最优条件，所述溶液体积均可成倍变化不改变最优結果。改变比例或试剂加入顺序可使被酶切的Taqman探针效率在1% 100%内变化。本发明中，所述T7核酸外切酶抑制的定量检测可采用标准的Taqman探针，以下是用Taqman探针对17核酸外切酶抑制定量检测步骤
用 Ix 17 核酸外切酶反应缓冲溶液(40 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 20 mM MgCl pH7. 5i25°C)将反应最终产物稀释到120 u L，转移到微量石英杯中，放入荧光光谱仪，以495nm为激发波长，518nm为发射波长，测其荧光信号強度。本发明提出了一种基于T7核酸外切酶抑制分析的方法，此方法设计简単，仅需设计一条寡核苷酸DNA链和Taqman探针即可，在其中间抑制位点进行有机小分子标记，即可实现检测；它也可直接用于有机小分子结合蛋白的检测，还可通过样品溶液中有机小分子与有机小分子标记的寡核苷酸DNA链竞争与抗体结合间接检测有机小分子，其操作快速简便、灵敏特异，可望为临床诊断、药物研发、药毒物分析、环境监测等提供ー个通用技术平台。
具体实施例方式 实施例I :基于T7核酸外切酶抑制分析检测吲哚こ酸 I)中间氨基标记的寡核苷酸DNA链和吲哚こ酸的交联
称取10 mg的吲哚こ酸溶于2. 5mL磷酸缓冲溶液(0. I M NaH2PO4, pH 7. 4)，再加入Img的I-こ基-3-(3- ニ甲基氨丙基)_碳ニ亚胺(EDC),在室温下搅拌15min,再加入2. 8mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温反应30min。取260 yl活化后的吲哚こ酸溶液加入 到260 u I浓度为10 ii M的中间氨基标记的寡核苷酸DNA单链(TATATATGGTAGTGAGTAGTGAGGTTGTATAGTTT (NH2)AGTTGAGGTAGCGTG)的溶液中，在轻微搅拌下室温反应2h。反应后在混合液中加入3. 6mg盐酸羟胺终止反应。把交联反应产物移到ImL的透析管中，透析管的截留分子量为6000D。把透析管放入500ml磷酸盐缓冲溶液(0. I M NaH2P04, pH 7. 4)中在4°C透析12h，每隔3h更换一次透析液，最后一次用超纯水透析。透析之后的寡核苷酸DNA单链分管保存于_20°C的冰箱中备用。上述的-20°C保存的寡核苷酸DNA单链用灭菌水稀释10倍并保存于4°C冰箱中作为次级储备液备用。2)吲哚こ酸的检测
取7 y L上述吲哚こ酸标记的寡核苷酸DNA单链次级储备液于微量管中，加入6 y L的5X17核酸外切酶反应缓冲溶液(40 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 20 mM MgCl pH 7. 5i25°C)混合均匀，置于37°C反应I h，再加入5 UL待检测的吲哚こ酸样品溶液，混合均匀后加入3uL浓度为640nM的吲哚こ酸单克隆抗体，室温反应15min，反应后加入3 y L T7核酸外切酶(Affymetrix公司产品)和6 y L Taqman探针在37°C酶切2h后，升温至75°C反应IOmin进行热灭活以终止酶反应。加入1x17核酸外切酶反应缓冲溶液(40 mM Tris-HCl, 50 mMNaCl, 20 mM MgCl pH 7. 5@25°C )将反应混合液稀释至120 uL，转移到微量石英杯中，放入荧光光谱仪，以495nm为激发波长，518nm为发射波长，测其荧光信号強度。实施例2 :基于限制性内切酶抑制分析检测叶酸结合蛋白
I)中间氨基标记的寡核苷酸DNA单链和叶酸的交联
称取IOmg的叶酸溶于2. 5mL磷酸缓冲溶液(0. I M NaH2P04, pH 7. 4)，再加入Img的I-こ基-3-(3-ニ甲基氨丙基)-碳ニ亚胺(EDC),在室温下搅拌15min,再加入2. 8mg N-轻基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温反应30min。取260 y L活化后的叶酸溶液加入到260 y L浓度为10 ii M的中间氨基标记的寡核苷酸DNA单链(TATATATGGTAGTGAGTAGTGAGGTTGTATAGTTT (NH2) AGTTGAGGTAGCGTG)的溶液中，在轻微搅拌下室温反应2h。反应后在混合液中加入
3.6mg盐酸羟胺终止反应。把交联反应产物移到ImL的透析管中，透析管的截留分子量为6000D。把透析管放入500ml磷酸盐缓冲溶液(0. I M NaH2P04, pH 7. 4)中在4°C透析12h，每隔3h更换一次透析液，最后一次用超纯水透析。透析之后的寡核苷酸DNA单链分管保存于_20°C的冰箱中备用。上述的-20°C保存的寡核苷酸DNA单链用灭菌水稀释10倍并保存于4°C冰箱中作为次级储备液备用。以上所有的反应均在遮光的条件下进行。
2 )叶酸结合蛋白的检测
取7iU上述叶酸标记的寡核苷酸DNA单链次级储备液于微量管中，加入6 UL的5X17核酸外切酶反应缓冲溶液混合均匀，(40 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 20 mM MgCl pH
7.5i25°C )，置于37で反应I h，再加入5 u L待检测的叶酸结合蛋白样品溶液，室温反应15min，反应后加入L 17核酸外切酶(Affymetrix公司产品)和6 y L Taqman探针在37°C酶切2h后，升温至75°C反应IOmin进行热灭活以终止酶反应。在此微量管中加入1x17核 酸外切酶反应缓冲溶液(40 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 20 mM MgCl pH 7. 5@25°C )，稀释至120 uL，混合均匀。转移到微量石英杯中，放入荧光光谱仪，以495nm为激发波长，518nm为发射波长，测其荧光信号強度。
权利要求
1.ー种17核酸外切酶抑制分析检测有机小分子与结合蛋白相互作用的荧光生物传感方法，包括如下步骤 (1)包含中间有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链与蛋白的相互作用及17核酸外切酶抑制分析； (2)选择17核酸外切酶抑制位点； (3)采用基于Taqman探针的实时荧光定量方法进行T7核酸外切酶抑制分析的定量检測。
2.根据权利要求I所述的生物传感方法，其特征是，所述中间有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链与蛋白的相互作用的检测及T7核酸外切酶抑制分析方法为 对于有机小分子与其结合蛋白的相互作用，检测步骤是取所述有机小分子修饰寡核苷酸DNA单链置于微量管中；再于微量管中加入包含有机小分子结合蛋白的样品溶液；然后加入17核酸外切酶和Taqman探针，得抑制反应的产物； 对于有机小分子的检测，采用竞争反应检测步骤取所述有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链置于微量管中；再加入包含待测小分子的样品溶液，混合均匀后加入有机小分子结合蛋白或单克隆抗体溶液；再加入T7核酸外切酶和Taqman探针，得抑制反应的产物。
3.根据权利要求I所述的生物传感方法，其特征是，所述17核酸外切酶抑制位点选择与Taqman探针5端互补的有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链下游I到3碱基中的任意ー个。
全文摘要
本发明为一种基于T7核酸外切酶抑制分析检测有机小分子与结合蛋白相互作用的荧光生物传感方法，包括中间有机小分子修饰的寡核苷酸DNA单链与蛋白的相互作用、T7核酸外切酶抑制位点选择、基于Taqman探针的实时荧光定量检测技术。它利用寡核苷酸DNA链中间修饰的有机小分子和其结合蛋白或抗体的特异性结合，基于有机小分子与蛋白或抗体相互作用对T7核酸外切酶切的抑制作用，通过对被酶切的Taqman探针荧光实时定量分析来检测有机小分子与蛋白相互作用及有机小分子或其结合蛋白。该方法灵敏度高、操作简便、特异性强，可用于生物医学中信号转导与分子调控机理研究、食品与农产品安全检测、环境毒物检测、药物筛选等。
文档编号C12Q1/68GK102643921SQ20121014152
公开日2012年8月22日 申请日期2012年5月9日 优先权日2012年5月9日
发明者俞汝勤, 唐丽娟, 楚霞, 甄珍, 蒋健晖 申请人:湖南大学