专利名称：柑橘溃疡病的pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及一种柑橘溃疡病的检测方法，尤指一种检测柑橘溃疡病(Xanthomonasaxonopodis pv. citri)的PCR(聚合酶链式反应)方法。
背景技术：
柑橘溃瘍病(CirtusBacterial Canker Disease, CBCD)是一种在部分柑橘栽培地区严重发生的由地毪草黄单胞柑橘致病变种[Xanthomonas axonopodi spv. citrri (Hasse)Dye]所引起的检疫性细菌病害。在自然条件下，该病菌可随风雨传播、扩散，主要侵染途径为气孔、皮孔或伤口，可侵染植物的叶片、叶茎、枝条以及果实，导致植物体的衰弱和枯死，严重的情况下能造成植株大量落叶、落果，甚至全株死亡；染病果实即使未脱落，也会在其表皮形成开裂、结疤状溃疡斑，大大降低果实的外观、品相，对其销售和出口造成不良影响。且该病菌传播能力强，一旦在新区发生，则需要大量的人力物力进行防治，造成很大的经济损失。目前，该病菌已经被列为我国进境和国内检疫性有害生物。美国、巴西、阿根廷、土耳其、伊朗、西班牙、意大利等全球30多个许多国家和地区，都将其列为检疫性有害生物，对柑橘溃疡病菌实施检疫，并禁止其出口和输入。商业化生产中，柑橘溃疡病近距离和中距离传播的主要途径是风雨、虫害产生的伤口和植株之间的相互摩擦。此外，在果园管理维护中的嫁接、修剪、喷灌等人为活动也有利于柑橘溃疡病在植株间的传播。其远距离传播则主要通过种苗、接穗、砧木的运输交易来实现，含细菌的包装物、集装箱、园艺工具也有一定的传播可能。因此，建立快速、高效的柑橘溃疡病菌检测技术，是防治柑橘溃疡病的重要基础。目前，通过PCR技术检测柑橘溃疡病，主要是利用王中康等人根据柑橘溃疡病菌全基因组中独有的保守蛋白基因序列而筛选到特异引物(YF5 :5，-TTC GGC GTC AAC AAC CTG-3，JYR5 :5，-AAC TCC AGC ACA TACGGG TC-3’)。王中康等人建立的柑橘溃疡病菌检测方法虽然具有较高的灵敏度，但有时会扩增到3条大小不同的片段，影响了该引物的适用性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种能准确鉴定柑橘溃疡病的PCR检测方法。该方法所使用的一对引物是基于柑橘溃疡病菌的促旋酶B亚单位基因(gyrase subunit B)的核苷酸序列,本检测方法所使用的这对引物有别于其它检测技术。为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是一种柑橘溃疡病的PCR检测方法，该方法是以柑橘溃疡病菌的特异性引物对待测样品进行PCR扩增，最后电泳鉴定。该特异性引物为正向引物(XCGlF):5，-CCCTGCTGCTGACCTTCTTCT-3’ (如 SEQID No 1 所示)，反向引物(XCG2R):5，-GGTTGACCGTGGTTTCCCATA-3’ (如 SEQID No 2 所示)。
上述特异性引物的设计是基于柑橘溃疡病菌的促旋酶B亚单位基因(gyrasesubunit B)的核苷酸序列，PCR产物大小为750bp。对本发明方法详细叙述如下一、引物设计本发明人利用原核生物进化过程中核酸序列的保守性，从NCBI搜索并下载柑橘溃瘍病菌(Xanthomonas axonopodis pv. citri strain ICMP 10022)的促旋酶 B 亚单位基因(gyrase subunit B)的核苷酸序列(序列号为EU499045),运用Premier软件得到一些候选引物，最后通过筛选，设计出一对引物 引物I(XCGlF) :5，-CCCTGCTGCTGACCTTCTTCT-3，引物2 (XCG2R) 5，-GGTTGACCGTGGTTTCCCATA-3，。将引物I和引物2分别经BLAST检索，见下表I及表2，结果表明，与引物I和引物2的序列100%覆盖且100%相同的全部是柑橘溃疡病菌的核苷酸序列。表I柑橘溃疡病菌引物I (XCGlF)的BLAST结果
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权利要求
1.一种柑橘溃疡病的PCR检测方法，其特征在于该方法是以柑橘溃疡病菌特异性引物对待测样品进行PCR扩增，最后电泳鉴定；该特异性引物为 正向引物5’ - CCCTGCTGCTGACCTTCTTCT -3’ 反向引物5’ - GGTTGACCGTGGTTTCCCATA -3’。
2.如权利要求I所述的柑橘溃疡病的PCR检测方法，其特征在于所述特异性引物的设计是基于柑橘溃疡病菌的促旋酶B亚单位基因的核苷酸序列，PCR产物大小为750bp。
全文摘要
一种柑橘溃疡病的PCR检测方法，是以柑橘溃疡病菌特异性引物对待测样品进行PCR扩增，最后电泳鉴定；该特异性引物是基于柑橘溃疡病菌的促旋酶B亚单位基因(gyrase subunit B )的核苷酸序列设计的。本检测方法所使用的这对引物有别于其它检测方法，可以用于快速检测出柑橘溃疡病。
文档编号C12R1/64GK102634603SQ20121014336
公开日2012年8月15日 申请日期2012年5月10日 优先权日2012年5月10日
发明者戴良英, 易图永, 杨泓威, 肖启明 申请人:湖南农业大学