专利名称：一种免抽提虹彩病毒pcr检测方法
—种免抽提虹彩病毒PCR检测方法技术领域
本发明属于生物技术领域，是一种快捷方便的鱼虹彩病毒的检测方法。
背景技术：
本发明是一种快捷方便的虹彩病毒PCR检测方法。虹彩病毒是造成渔业生产中巨大损失的一种致病病毒，致死率高达60%以上。及早发现并确诊虹彩病毒，可以预防并有的放矢的治疗鱼虹彩病毒感染疾病。这在渔业生产中具有非常大的意义。
虹彩病毒主要感染无脊椎动物和低等脊椎动物，是大型20面体状DNA病毒， 分为虹彩病毒属(Iridovirus),绿虹彩病毒属(Chloriridovirus),淋巴囊肿病毒属 (Lymphocystivirus),娃病毒属(Ranavirus)和细胞肿大病毒属(Megalocytivirus)。在水产业中造成巨大损失的虹彩病毒有红鲷鱼虹彩病毒(red sea bream iridovirus)、台湾石斑鱼虹彩病毒(Taiwan Grouper iridovirus)、传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus)、大黄鱼虹彩病毒(Large yellow croaker iridovirus)和大菱鲆红体病虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus)。
病毒类疾病没有有效的药物来控制，在目前阶段，早预防早发现尽早采取隔离和消毒手段是唯一有效的处理措施。
本发明是一种快捷简便的虹彩病毒检测方法。相关PCR试剂为上海七海复泰生物科技有限公司产品。病理组织不用经过提取DNA处理，直接PCR检测，半个小时即可得到检测结果。发明内容
本发明的目的是建立一种新的DNA病毒检测方法。该方法能够经济、快速地检测出鱼类虹彩病毒。
本发明建立的新的PCR检测方法，包括以下内容a)PCR扩增目的片段;b)琼脂糖DNA电泳检测目的片段；c)或者在PCR反应体系中添加荧光染料SYBRGREE，用于实时定量PCR。
该虹彩病毒PCR检测方法与其他检测方法相比具有如下优点a)简便，不需要处理病理组织，不需要抽提DNA；b)快捷，30-60分钟便可得到结果；c)经济，节省了样本制备的费用；d)便于大规模样本筛查。
以下结合
本发明的特征和有益效果。
图1 1. 2%琼脂糖电泳图。泳道I是DNA Marker DL2000，泳道2是空白对照，泳道3是扩增的PCR产物。
图2 RT-PCR图。图A是空白对照，图B是扩增的目的片段。
具体实施例方式实施例1 :基于琼脂糖电泳的检测方法O. 2mL PCR管中，加12. 5uL 2X PCR预混液(上海七海复泰生物科技有限公司生产)， 各加入 O. 75 uL 正反向引物(sense primer: GGCCATGCCAATTTCGG, antisense primer: TGCTGCCGGGCATCAT,扩增的目的片段是虹彩病毒主要衣壳蛋白上的一段序列)，补加IluL 双蒸水，用平头灭菌牙签刮取病理组织，将牙签在PCR管中搅动混合。PCR管置于PCR仪上进行扩增，扩增程序为94°C 5min预变性，94°C IOs ；60°C IOs ；72°C,10s ;扩增35个循环。 取IOuL扩增产物进行1. 2%的琼脂糖凝胶电泳，电压200V，10分钟后，紫外凝胶成像系统下观测PCR产物(图1 )。泳道I是DNA Marker DL2000,泳道2是空白对照，泳道3是扩增的 PCR产物。
实施例2 :实时定量PCR检测方法O. 2mL PCR管中，加12.5uL 2X qPCR预混液(上海七海复泰生物科技有限公司)， 各加 O. 75 uL 正反向引物(sense primer: GGCCATGCCAATTTCGG, antisense primer: TGCTGCCGGGCATCAT,扩增的目的片段是虹彩病毒主要衣壳蛋白上的一段序列。)，补加IluL ddH20，用平头灭菌牙签刮取病理组织，将牙签在PCR管中搅动混合。PCR管置于荧光定量 PCR仪上进行扩增，扩增程序为94°C 5min预变性，94°C IOs ；60°C IOs ;72°C，IOs ;扩增 35个循环。分析扩增曲线(图2)。图A是空白对照，图B是扩增的目的片段。
权利要求
1.一种免抽提虹彩病毒PCR检测方法，其特征在于 a)病理组织样品不用处理； b)不用抽提病毒DNA。
2.如权利I所描述的虹彩病毒的PCR检测方法，扩增的目的片段可以是虹彩病毒基因组上的任一片段，也可以同时检测2个或者2个以上的目的片段，以长度在150bp到250bp的保守区域的序列为佳，如主要衣壳蛋白上的序列、ATPase上的序列等。
3.如权利I和2所描述的虹彩病毒PCR检测方法，其结果分析可以是琼脂糖凝胶电泳，也可以是荧光定量PCR。
4.如权利1、2和3所描述的检测方法，其PCR反应体系可以是任意体积，以25uL体系为佳。
全文摘要
本发明为一种免抽提虹彩病毒PCR检测方法。2XPCRMix为上海七海复泰生物科技有限公司产品。0.2mlPCR管中，加12.5ul2XPCRMix(或qPCRMix)，各加0.75ul引物(10mM)，补加11ul超纯水。扩增35个循环后，检测目的条带(图1)。
文档编号C12Q1/70GK103045757SQ201210153590
公开日2013年4月17日 申请日期2012年5月17日 优先权日2012年5月17日
发明者李琦, 滕以刚 申请人:上海七海复泰生物科技有限公司