专利名称：大豆疫霉的检测靶标序列A3apro及其特异性LAMP引物组合物和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及大豆疫霉的检测靶标序列A3apix)及其特异性LAMP引物组合物和应用。
背景技术：
大豆疫霉菌(Phytophthorasojae Kaufmann&Gerdemann)侵染大豆引起的疫霉根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一，也是我国对外公布的ー类检疫对象。大豆疫霉根腐病最早于1948年在美国印第安那州被发现[3]，此后，加拿大、巴西、阿根廷等二十多个大豆生产国家相继报道了该病害的发生[2’6]。苏彦纯[1°]等于1993年首次报道了我国的黑龙江大豆主产区发生大豆疫霉根腐病,此后在我国北方的大豆主产区陆续发现大豆疫霉的危 害。目前每年给全球大豆生产造成的经济损失超过10亿美元[8]。为了阻止大豆疫霉传播范围的不断扩大，使大豆疫霉根腐病得到控制，需要对其进行快速、准确地检測。传统的检测大豆疫霉的方法是进行大豆叶碟诱捕和平板培养或者将二者相结合[ia°]。传统方法在大豆疫霉检测中发挥了重要作用，但是费时费カ而且要求操作者具备专业的疫霉分离、形态学鉴定知识和丰富的经验。随着核酸相关的鉴定方法的发展，基于PCR的方法已经成功用于检测大豆疫霉[7]，虽然PCR法在特异性和敏感性上有较大的提高，但是检测时间仍然比较长，大概4 5h，同时PCR方法依赖精密的温度循环装置。其检测灵敏度比较高，但是检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)是日本的荣研株式会发明的一种新的核酸扩增技术[4]，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技木。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60 65°C范围60min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。靶标基因的选择是LAMP检测的重要因素之一。以PCR技术检测大豆疫霉菌是基于核糖体基因序列[7]，但由于核糖体序列没有足够多的位点来区分所有的病原菌，因此开发出新的检测靶标成为检测的热点。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种大豆疫霉的检测靶标序列A3apix)。本发明的另ー目的是提供该大豆疫霉的检测靶标序列A3apix)的其特异性LAMP引物组合物。本发明的又一目的是提供该大豆疫霉的检测靶标序列A3apix)及其LAMP引物组合物的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现大豆疫霉的检测靶标序列A3apro，核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。所述的大 疫霉的检测祀标序列A3apro在检测或鉴定大 疫霉中的应用。针对所述的大豆疫霉的检测靶标序列A3apro设计的特异性的LAMP引物组合物，分别为正向内引物FIP :SEQ ID NO. 2，反向内引物BIP :SEQ ID NO. 3，正向外引物F3 :SEQID NO. 4，反向外引物 B3 :SEQ ID NO. 5。所述的针对所述的大豆疫霉的检测靶标序列A3apro设计的特异性的LAMP引物组合物在检测或鉴定大 疫霉中的应用。ー种用于检测大豆疫霉的LAMP检测试剂盒，包含所述的特异性的LAMP引物组合物。
所述的用于检测大豆疫霉的LAMP检测试剂盒，包含由1.6口11正向内引物？1卩、
I.6μΜ反向内引物ΒΙΡ、0. 2μΜ正向外引物F3、0. 2μΜ反向外引物B3、l. 4mM dNTPs、20mMpH 8.8 的 Tris-HClUOmM KCl、IOmM(NH4)2S04、6mM MgS04、0. I % Triton X_100、8U BstDNApolymerase 320单位、180mM羟基萘酚蓝，加入超纯水制备成检测溶液。一种检测大豆疫霉的方法，提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用所述的特异性的LAMP引物组合物进行LAMP ;扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果(羟基萘酚蓝不会影响电泳結果)，如果存在特征性梯状条带，则证明所检测的病原为大豆疫霉；轻基萘酹蓝(hydroxyl naphthol blue, HNB)属于金属离子指示剂的ー种。HNB是Mg2+的滴定剂，其颜色随溶液pH变化而改变，因此可以通过监测LAMP反应体系中Mg2+浓度的变化及溶液pH而起到颜色指示剂的作用。反应前将HNB加入到反应液中，反应体系呈紫色，反应过程中Mg2+与LAMP反应的副产物P2O74-结合产生大量沉淀，随着环介导等温扩增反行的进行，溶液中Mg2+浓度降低，pH发生变化，从而使HNB的顔色由紫色变为天蓝色。因此，反应结束后通过反应体系的颜色变化，来判断大豆疫霉的有无天蓝色表示检测为阳性，存在大 疫霉；紫色表检测结果为阴性，不存在大 疫霉。所述的检测大豆疫霉的方法优选提取待检微生物的DNA，取1μ I DNA溶液，カロ入23 μ I所述的检测溶液和2μ I灭菌去离子水进行LAMP，LAMP反应程序为60°C 65。C，55 90min,优选 64°C，80min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果(羟基萘酚蓝不会影响电泳結果)，如果存在特征性梯状条带，则证明所检测的病原为大豆疫霉；或者以LAMP反应体系的颜色变化做为结果判定标准，天蓝色表示检测为阳性，存在大豆疫霉；紫色表示检测结果为阴性，不存在大 疫霉。有益效果大豆疫霉的Avr3a无毒基因是Signal peptide-RXLR结构的效应分子[5]。发明人对大豆疫霉Avr3a进行精确定位和克隆的过程中，发现Avr3a座落于ー个疫霉属非常保守的区域中。在Avr3aATG上游的I. 5kb范围内有I个300bp的缺失突变(图I)，将该序列命名为A3apro。将缺失的A3apro的核酸序列(SEQ ID NO. I)进行BLAST比对，发现了其在P. infestans, P. ramorum 和 Hylaperonospora parasitica 的基因组数据库中的同源性序列，但其序列的同源性较低，适合作为大豆疫霉菌的检测靶标。本发明分析了大豆疫霉菌的检测靶标序列A3apro和其他疫霉菌在序列上的差异，设计了四条特异性的LAMP引物，在此基础上建立了检测大豆疫霉的LAMP体系。本发明提供的检测大豆疫霉的LAMP方法克服了现有技术中大豆疫霉的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及PCR检测技术需要热循环仪器，无法快速检测大豆疫霉菌的问题。本发明检测方法在64° C等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到大豆疫霉菌，不需要复杂仪器，能较好满足对大豆疫霉菌的现场检測，为检疫性病害大豆疫霉菌的检测提供了新的技术平台，能较好满足目前对大豆疫病的现场检测的迫切需要，用于进出口检疫、田间检疫等的现场检测，易于大范围推广应用。
图I大豆疫霉类转座子序列示意图。图2实施例3LAMP检测大豆疫霉的特异性结果图 (a) LAMP检测大豆疫霉菌的特异性的琼酯糖凝胶电泳图。其中，M为IOObp DNA marke。I :标准大豆疫霉菌株P6497 ;2_7 :分别为大豆疫霉生理小种R3、R6、R8、R12、R14、R17 ；8 :阴性对照;9_12 :分别为大豆疫霉生理小种R19、R20、R28、R31 ；13 :阴性对照。(b)顔色判定LAMP检测大豆疫霉菌的特异性显色图。图中显示第I 7管以及第9 12管显天蓝色，呈阳性；第8管和第13管显紫色，呈阴性。其中，I :标准大豆疫霉菌株6497 ;2_7 :分别为大豆疫霉生理小种R3、R6、R8、R12、R14、R17 ；8 :阴性对照；9-12 :分别为大豆疫霉生理小种R19、R20、R28、R31 ；13 :阴性对照。图3实施例4基于颜色判定通过对疫霉种及其它种的菌株进行LAMP检测大豆疫霉的特异性。图中显示第I管以及第9管显天蓝色，呈阳性；其余各管显紫色，呈阴性。I :标准大 疫霉囷株6497 ；2 :芒麻疫霉；3 :橡树疫霉；4 :掘氏疫霉；5 :恶疫霉；6 :瓜类疫霉；7 :致病疫霉；8 :阴性对照；9 :标准大豆疫霉菌株6497 ；10 :终极腐霉；11 :木贼铼刀菌；12 :平头炭疽菌；13 :稻瘟病菌；14 :立枯丝核菌；15 :大丽轮枝菌；16 :阴性对照。图4实施例5LAMP检测大豆疫霉的灵敏度结果图LAMP扩增不同浓度基因组DNA ;从左到右分别为25 μ L的反应体系中分别含有100ng、10ng、lng、100pg、10pg、lpg、100fg、10fg 大豆疫霉 DNA 的扩增结果。(a) LAMP检测大豆疫霉菌灵敏的琼酯糖凝胶电泳图。LAMP反应能从P. sojae菌株中特异地扩增出梯形状的条带。电泳图表明LAMP反应的灵敏度达到10pg。M为IOObp DNAma rker。(b)颜色判定LAMP检测大豆疫霉菌的灵敏度显色图。25 μ L的反应体系中分别含有lOOng、10ng、lng、100pg、IOpg大豆疫霉DNA的反应管显天蓝色，呈阳性反应，25 μ L的反应体系中分别含有lpg、IOOfgUOfg大豆疫霉DNA的反应管显紫色，呈阴性反应。显色结果表明LAMP反应的灵敏度达到10pg。图5顔色判定从海关进境大豆带菌土样中检测大豆疫霉1-7为海关进境大豆带菌土样中大豆疫霉的扩增結果，显天蓝色，表明存在大豆疫霉菌；8为阴性对照，显紫色，表明不存在大豆疫霉菌。
具体实施例方式实施例I通过全基因测序结果显示大豆疫霉生理小种R7的Avr3a启动子区有ー个约300bp的片段缺失和两个小片段的插入。在大豆疫霉的JGI基因组数据库中，300bp的缺失序列在大豆疫霉全基因范围内居然有超过200条的记录，彼此之间非常保守并且分布在基因组的各个区域。判断该300bp的片段(SEQ ID NO. I)为转座子序列，并将其命名为A3apro。通过A3apro (SEQ IDNO. I)作为模板序列使用在线LAMP引物设计软件primerExplorer V4(http://primerexplorer. jp/elamp4. O. 0/index, html)设计引物。将模板序列上传后，由系统软件计算获得初歩的LAMP引物组合，再通过软件提供的引物相应的3’端或5’端稳定性及引物ニ聚体等參数对设计出的多对引物进行比较选择，最終选取ー组最合适的引物，正向内引物FIP:SEQ ID NO. 2，反向内引物BIP :SEQ ID NO. 3，正向外引物F3 :SEQ ID NO. 4,反向外引物B3 =SEQID NO. 5。
实施例2ー种用于检测大豆疫霉的LAMP检测试剂盒，包含由1.6口]\1正向内引物？1卩、1.6“] 反向内引物81 、0.24]\1正向外引物？3、0.24]\1反向外引物83、1.41111 dNTPs、20mMpH 8· 8 的 Tris-HClUOmM KCl、IOmM(ΝΗ4) 2S04、6mM MgS04、0. I % Triton X_100、8U BstDNApolymerase 320单位、180mM羟基萘酚蓝，加入超纯水制备成检测溶液。实施例3大豆疫霉菌LAMP反应的特异性试验ー为了验证LAMP方法的特异性，选择标准大豆疫霉菌株6497 (购自ATCC，编号为ATCC 16705，下同)以及与大豆疫霉同一种的不同生理小种R3、R6、R8、R12、R14、R17、R19、R20、R28、R31的DNA作为模板，取I μ I DNA溶液，加入23 μ I实施例2所述的检测溶液和
2μ I灭菌去离子水进行LAMP反应，反应程序为64° C 60min。结果显示用LAMP引物去扩增大豆疫霉的生理小种的DNA模板吋，都扩增出条带；而阴性对照没有能够扩增出目的条帯。特异性LAMP反应能从供试的大豆疫霉菌株中特异地扩增出梯形状的条带，表明该引物组合物具有种的特异性。同时基于反应体系顔色反应判定扩增大豆疫霉的生理小种的DNA模板时，呈现天蓝色；阴性对照呈现紫色。这表明本发明建立的LAMP检测方法具有很好的特异性(图2)。实施例4大豆疫霉菌LAMP反应的特异性试验ニ为了验证LAMP方法的特异性，选择与大豆疫霉不同种(苎麻疫霉；橡树疫霉；掘氏疫霉；恶疫霉；瓜类疫霉；致病疫霉)和不同属的菌(终极腐霉；木贼铼刀菌；平头炭疽菌；稻瘟病菌；立枯丝核菌；大丽轮枝菌)的DNA作为模板，取I μ I DNA溶液，加入23 μ I实施例2所述的检测溶液和2 μ I灭菌去离子水进行LAMP反应，反应程序为64° C 60min。结果显示基于颜色反应判定扩增大豆疫霉的DNA模板时，呈现天蓝色；与大豆疫霉不同种、不同属的菌和阴性对照都呈现紫色(图3)。实施例5大豆疫霉菌LAMP反应的灵敏度试验为了确定LAMP检测方法的灵敏度，将提取的标准大豆疫霉菌株6497DNA用分光光度计测定浓度(I μ g/μ I)后用DEPC水进行10倍比稀释，-70°C保存作为模板。分别取10倍比稀释后的各浓度DNA稀释液I μ L作为模板，加入23 μ I实施例2所述的检测溶液和
2μ I灭菌去离子水进行LAMP反应，反应程序为64° C 60min。取2 μ L扩增产物上样，在2%琼脂糖凝胶上电泳，结果显示LAMP方法可以检测到浓度是IOpg的大豆疫霉的DNA。HNB显色反应表明LAMP反应的灵敏度也达到IOpg (图4)。实施例6从海关进境大豆带菌土样中检测大豆疫霉I) 土壤中卵孢子的富集取待检土壤样品20 100克，研碎，先后采用200目筛网去处较大土粒，然后经过400,500,800目筛网过滤，同时用3 10升水反复冲洗，从800目筛网上收集卵孢子，用Iml水悬浮。由于卵孢子不能透过800目筛网，这样处理可以达到使卵孢子富集的效果。
2 )从微量卵孢子中提取DNA 将用无菌水悬浮的卵孢子转移到I. 5mL的离心管中，在12000r. min-1转速下离心5分钟，倒出液体；加入50 μ L CTAB buffer，研磨，再加入 500 μ L CTAB buffer，水浴 30 分钟；加入等体积氯仿抽提，在12000r. min-1转速下离心10分钟，吸取上清；加入I /10体积的3M NaAc，2倍体积的无水冰こ醇，室温沉淀30分钟，12000r.min-1转速下离心10分钟,倒干液体；カロImL 70% (V/V)こ醇洗漆，12000r. min_l转速下离心10分钟,倒干液体,晾干
至无酒精味；加10 μ L无菌双蒸水溶解，用于LAMP扩增的模板。3 )大豆疫霉LAMP检测，包括取I μ I DNA溶液，加入23 μ I实施例2所述的检测溶液和2 μ I灭菌去离子水，总体积为25 μ I ;反应程序为64° C 60min ;以HNB (轻基萘酹蓝)作为反应指示剂，扩增结束后LAMP反应体系的颜色呈现天蓝色，以此判断从海关进境大豆带菌土样中能够产生阳性反应含有大豆疫霉菌(图5)。实施例7感病大豆植物的LAMP检测采用NaOH碱裂解法提取接种大豆疫霉的大豆植株的DNA，将其作为模板用于LAMP扩增。取IuLDNA溶液，按实施例6的方法，进行LAMP反应。结果显示接种大豆疫霉的大豆植株组织中进行LAMP，其顔色反应也呈现阳性天蓝色；而健康植株和阴性对照呈现紫色。參考文献I. Canaday, C.，and Schmitthenner, A. 1982. Isolating Phytophthoramegasperma f. sp. giycinea from soil with a baiting method that minimizes Pythiumcontamination.Soil Biology and Biochemistry 14 :67-68.2. Erwin, D.，Ribeiro, 0.，and Shattock，R. 1996. Phytophthora diseasesworldwide. APS press St Paul，MN，USA.3. Kaufmann, M. J.，and Gerdemann, J. 1957. Root and stem rot of soybeancaused by Phytophthora sojae n.sp.University of Illinois at Urbana-しhampaign.4. Notomi，T.，Okayama, H.，Masubuchi，H.，Yonekawa，T.，Watanabe，K.，Amino,N. , and Hase,T. 2000. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic AcidsResearch 28 :e63_e63.5. Qutob，D.，Tedman-Jones，J.，Dong, S.，Kuflu，K.，Pham, H.，Wang, Y.，Dou，D.，Kale，S.，Arredondo，F.，and Tyler, B. 2009. Copy number variation andtranscriptional polymorphisms of Phytophthora sojae RXLR effector genes Avrlaand Avr3a. PLoS One 4 :5066.6. Schmitthenner, A. 1985. Problems and progress in control ofPhytophthora root rot of soybean. Plant disease69 362.7. Wang, Y.，Zhang, W.，and Zheng, X. 2006. Rapid and sensitive detection ofPhytophthora sojae in soil and infected soybeans by species-specific polymerasechain reaction assays. Phytopathology 96 :1315-1321.8. Wrather, J.，Stienstra, W.，and Koenning，S. 2001. Soybean disease lossestimates for the United States froml996 to 1998.Canadian Journal of PlantPathology 23 :122-131. 9.朱振东，王化波，王晓鸣，常汝镇，and武小菲.2003.中国大豆疫霉菌分布及毒力多样性研究.中国农业科学36 :793-799.10.苏彦纯，and沈崇尧.1993.大豆疫霉病菌在中国的发现及其生物学特性的研究.植物病理学报。
权利要求
1.大豆疫霉的检测靶标序列A3apix)，其特征在于核苷酸序列如SEQID NO. I所示。
2.权利要求I所述的大ii疫霉的检测祀标序列A3apro在检测或鉴定大ii疫霉中的应用。
3.针对权利要求I所述的大豆疫霉的检测靶标序列A3apro设计的特异性的LAMP引物组合物，其特征在于包含正向内引物FIP :SEQ ID NO. 2，反向内引物BIP :SEQ ID NO. 3，正向外引物F3:SEQ ID NO. 4，反向外引物B3 :SEQ ID NO. 5。
4.权利要求3所述的针对权利要求I所述的大豆疫霉的检测靶标序列A3apro设计的特异性的LAMP引物组合物在检测或鉴定大豆疫霉中的应用。
5.一种用于检测大豆疫霉的LAMP检测试剂盒，其特征在于包含权利要求3所述的特异性的LAMP引物组合物。
6.根据权利要求5所述的用于检测大豆疫霉的LAMP检测试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包含由1.611|1正向内引物？1 、1.611|1反向内引物81 、0.211|1正向外引物？3、0.2iiM 反向外引物 B3、l. 4mM dNTPs、20mM pH 8. 8 的 Tris-HCl、IOmM KCl、IOmM(NH4)2S04、6mM MgS04、0. 1% Triton X_100、8U Bst DNA polymerase 320 单位、180mM 羟基萘酚蓝，力口入超纯水制备成检测溶液。
7.—种检测大豆疫霉的方法，其特征在于提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用权利要求3所述的特异性的LAMP引物组合物进行LAMP ； 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果，如果存在特征性梯状条带，则证明存在大疫霉； 或者以LAMP反应体系的颜色变化做为结果判定标准，天蓝色表示检测为阳性，存在大豆疫霉；紫色表示检测结果为阴性，不存在大豆疫霉。
8.根据权利要求7所述的检测大豆疫霉的方法，其特征在于提取待检微生物的DNA，取Iul DNA溶液，加入23 u I权利要求6所述的检测溶液和2 u I灭菌去离子水进行LAMP，LAMP 反应程序为60°C 65。C，55 90min，优选 64°C，80min ； 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果，如果存在特征性梯状条带，则证明存在大疫霉； 或者以LAMP反应体系的颜色变化做为结果判定标准，天蓝色表示检测为阳性，存在大豆疫霉；紫色表示检测结果为阴性，不存在大豆疫霉。
全文摘要
本发明属于基因工程领域，涉及大豆疫霉的检测靶标序列A3apro及其特异性LAMP引物组合物和应用。大豆疫霉的检测靶标序列A3apro，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。针对A3apro设计的特异性的LAMP引物组合物，包括正向内引物FIPSEQ ID NO.2，反向内引物BIPSEQ ID NO.3，正向外引物F3SEQ ID NO.4，反向外引物B3SEQ ID NO.5。所述的特异性的LAMP引物组合物可在检测或鉴定大豆疫霉中应用。本发明LAMP引物组合物用于检测大豆疫霉具有良好的特异性灵敏度，扩增快速、高效，且鉴定简便的优点。
文档编号C12Q1/68GK102676511SQ201210153468
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月16日 优先权日2012年5月16日
发明者戴婷婷, 王源超, 董莎萌, 郑小波 申请人:南京农业大学