专利名称：用于检测大豆疫霉的lamp引物组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及用于检测大豆疫霉的LAMP引物组合物及其应用。
背景技术：
大豆疫霉菌Phytophthora sojae Kaufmann&Gerdemann侵染大豆引起的疫霉根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一，也是我国对外公布的一类检疫对象。大豆疫霉根腐病最早于1948年在美国印第安那州被发现[3]，此后，加拿大、巴西、阿根廷等二十多个大豆生产国家相继报道了该病害的发生[2’6]。苏彦纯[1°]等于1993年首次报道了我国的黑龙江大豆主产区发生大豆疫霉根腐病，此后在我国北方的大豆主产区陆续发现大豆疫霉的危害。目前每年给全球大豆生产造成的经济损失超过10亿美元M。为了阻止大豆疫霉传播范围的不断扩大，使大豆疫霉根腐病得到控制，需要对其进行快速、准确地检测。 传统的检测大豆疫霉的方法是进行大豆叶碟诱捕和平板培养或者将二者相结合[ia°]。传统方法在大豆疫霉检测中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉分离、形态学鉴定知识和丰富的经验。随着核酸相关的鉴定方法的发展，基于PCR的方法已经成功用于检测大豆疫霉[7]，虽然PCR法在特异性和敏感性上有较大的提高，但是检测时间仍然比较长，大概4 5h，同时PCR方法依赖精密的温度循环装置。其检测灵敏度比较高，但是检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)是日本的荣研株式会发明的一种新的核酸扩增技术[4]，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60 65°C范围80min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。靶标基因的选择是LAMP检测的重要因素之一。以PCR技术检测大豆疫霉菌是基于核糖体基因序列[7]，但由于核糖体序列没有足够多的位点来区分所有的病原菌，因此开发出新的检测靶标成为检测的热点。
发明内容
本发明的目的是提供用于检测大豆疫霉的LAMP引物组合物。本发明的另一目的是提供该弓丨物组合物的应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现用于检测大豆疫霉的LAMP引物组合物，由序列为SEQ ID No. I所示的正向内引物FIP、序列为SEQ ID No. 2所示的反向内引物BIP、序列为SEQ ID No. 3所示的正向外引物F3、序列为SEQID No. 4所示的反向外引物B3、序列为SEQ ID No. 5所示的反向环引物LB组成。
所述的LAMP引物组合物在制备检测大豆疫霉的检测试剂中的应用。一种检测大豆疫霉的LAMP试剂盒，含有所述的LAMP引物组合物。所述的检测大豆疫霉的LAMP试剂盒优选包含由1.64 1正向内引物？1 、1.6口1反向内引物81卩、
O.2μΜ正向外引物F3、0. 2μΜ反向外引物Β3、0. 2μΜ反向环引物LB、1.4mM dNTPs、20mMpH 8· 8 的 Tris-HCl、10mM KCl、IOmM (NH4)2S04、6mM MgS04、0. I % Triton X_100、8U Bst DNApolymerase 320单位、180mM轻基萘酹蓝,加入超纯水制备成检测溶液。一种检测大豆疫霉的方法，包括提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用权利要求I所述的LAMP引物组合物进行LAMP ;扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光 下检测结果(羟基萘酚蓝不会影响电泳结果)，如果存在特征性梯状条带，则证明所检测样品中存在大豆疫霉；轻基萘酹蓝(hydroxyl naphthol blue,HNB)属于金属离子指示剂的一种。HNB是Mg2+的滴定剂，其颜色随溶液pH变化而改变，因此可以通过监测LAMP反应体系中Mg2+浓度的变化及溶液pH而起到颜色指示剂的作用。反应前将HNB加入到反应液中，反应体系呈紫色，反应过程中Mg2+与LAMP反应的副产物P2 074_结合产生大量沉淀，溶液中Mg2+浓度降低，pH发生变化,从而使HNB的颜色由紫色变为天蓝色。因此,反应结束后通过反应体系的颜色变化，来判断大豆疫霉的有无天蓝色表示检测为阳性，存在大豆疫霉；紫色表示检测结果为阴性，不存在大豆疫霉。所述的检测大豆疫霉的方法，优选提取待检微生物的DNA，取I μ I DNA溶液，加入23 μ I权利要求4所述的检测溶液和I μ I灭菌去离子水进行LAMP，LAMP反应程序为60 O 65。C，55 90min，优选 64°C，80min ；扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果(羟基萘酚蓝不会影响电泳结果)，如果存在特征性梯状条带，则证明所检测的病原为大豆疫霉；或者以羟基萘酚蓝的颜色变化做为结果判定标准，天蓝色表示检测为阳性，存在大豆疫霉；紫色表示检测结果为阴性，不存在大 疫霉。有益效果本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在(I)实用性好。普通PCR反应对产物进行凝胶电泳很容易造成产物扩散，这是实验室污染的一个主要来源；而且溴化乙锭(EB)有巨毒，可累积致癌；长期观察紫外灯也会对实验人员造成一定程度的伤害。而LAMP反应只需在恒温水浴锅中进行，反应结束之后通过HNB的颜色变化便可直接判断结果，从而增加了其在田间的应用价值。(2)实现了恒温扩增，不像PCR法必须要热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖，只要有稳定的热源LAMP反应就可以发生，极大的扩展了 LAMP使用的范围，LAMP之所以能在恒定的热源下发生反应是因为在LAMP反应液中添加了甜菜碱，使双链DNA处于解链的动态平衡中，在Bst DNA聚合酶的作用下实现扩增。(3)准确性高由于传统大豆疫霉检测技术只是根据形态特征来确定检疫对象，无法排除人为因素的干扰，很难区分形态相近种，检测准确性只有60-80% ;而本发明根据大豆疫霉的YPTl基因(Genbank登录号DQ162958. I)的序列，该序列在大豆疫霉中的基因组进化区和保守区轮流间隔，利用Bioedit软件将大豆疫霉的YPTl基因序列和其他疫霉种的序列进行比较，选取大豆疫霉特有的一段序列设计特异性的LAMP引物。LAMP反应通过4条引物(FIP、BIP、F3、B3)特异性识别靶序列上的6个独立区域，其特异性和灵敏度都比较高。此外，反向环引物LB能够提高反应速率，和其他四条引物一起，在确保反应准确性的情况下，使本发明能快速的进行大豆疫霉检测。本发明提供的检测大豆疫霉的LAMP方法克服了现有技术中大豆疫霉的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及PCR检测技术需要热循环仪器，无法快速检测大豆疫霉菌的问题。本发明检测方法在64° C等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到大豆疫霉菌，不需要复杂仪器，能较好满足对大豆疫霉菌的现场检测，为检疫性病害大豆疫霉菌的检测提供了新的技术平台，可用于海关进出境大豆所带大豆疫霉(Phytophthora sojae)的高灵敏度快速检测，同时也可用于田间大豆疫病的早期诊断和病菌的监测。
图ILAMP检测大豆疫霉的特异性(a) LAMP检测大豆疫霉菌的特异性的琼酯糖凝胶电泳图。其中，M为IOObp DNA marke。I :标准大豆疫霉菌株6497 ;2_7 :分别为大豆疫霉生理小种R3、R6、R8、R12、R14、R17 ；8 :阴性对照;9_12 :分别为大豆疫霉生理小种R19、R20、R28、R31 ;13 :阴性对照。(b)颜色判定LAMP检测大豆疫霉菌的特异性显色图。图中显示第I 7管以及第9 12管显天蓝色，呈阳性；第8管和第13管显紫色，呈阴性。其中，I :标准大豆疫霉菌株6497 ;2_7 :分别为大豆疫霉生理小种R3、R6、R8、R12、R14、R17 ；8 :阴性对照；9-12 :分别为大豆疫霉生理小种R19、R20、R28、R31 ；13 :阴性对照。图2通过对大豆疫霉种及其它种的菌株进行LAMP检测大豆疫霉的特异性(a) LAMP检测大豆疫霉菌的特异性的琼酯糖凝胶电泳图。其中，I :标准大 疫霉囷株6497 ；2 :芒麻疫霉；3 :橡树疫霉；4 :掘氏疫霉；5 :恶疫霉；6 :瓜类疫霉；7 :致病疫霉；8 :阴性对照；9 :标准大 疫霉囷株6497 ； 10 :终极腐霉；
11:木贼镰刀菌；12 :平头炭疽菌；13 :稻瘟病菌；14 :立枯丝核菌；15 :大丽轮枝菌；16 :阴性对照。(b)颜色判定LAMP检测大豆疫霉菌的特异性显色图。图中显示第I管以及第9管显天蓝色，呈阳性；其余各管显紫色，呈阴性。其中I :标准大 疫霉囷株6497 ；2 :芒麻疫霉；3 :橡树疫霉；4 :掘氏疫霉；5 :恶疫霉；6 :瓜类疫霉；7 :致病疫霉；8 :阴性对照；9 :标准大 疫霉囷株6497 ； 10 :终极腐霉；11 木贼镰刀菌；12 :平头炭疽菌；13 :稻瘟病菌；14 :立枯丝核菌；15 :大丽轮枝菌；16 :阴性对照。图3LAMP检测大豆疫霉的灵敏度LAMP扩增不同浓度基因组DNA ;从左到右分别为25 μ L的反应体系中分别含有lOOng、10ng、lng、lOOpg、10pg、lpg、lOOfg、IOfg DNA 的扩增结果。(a) LAMP检测大豆疫霉菌灵敏的琼酯糖凝胶电泳图。LAMP反应能从P. so joe菌株中特异地扩增出梯形状的条带。电泳图表明LAMP反应的灵敏度达到10pg。M为IOObp DNAmarker。(b)颜色判定LAMP检测大豆疫霉菌的灵敏度显色图。25 μ L的反应体系中分别含有lOOng、lOng、lng、lOOpg、IOpg大豆疫霉DNA的反应管显天蓝色，呈阳性反应，25 μ L的反应体系中分别含有lpg、lOOfg、IOfg大豆疫霉DNA的反应管显紫色，呈阴性反应。显色结果表明LAMP反应的灵敏度达到10pg。
具体实施例方式实施例I一种用于检测大豆疫霉的LAMP检测试剂盒，由1.6μΜ正向内引物FIP、1.6yM反向内引物ΒΙΡ、0. 2μΜ正向外引物F3、0. 2μΜ反向外引物Β3、0. 2μΜ反向环引物LB、
I.4mM dNTPs、20mM pH 8· 8 的 Tris_HCl、10mM KCl、10mM(NH4)2S04、6mM MgS04、0. I % TritonX_100、8UBst DNA polymerase 320单位 、180mM轻基萘酌·蓝,加入超纯水制备成检测溶液。实施例2大豆疫霉菌LAMP反应的特异性试验一为了验证LAMP方法的特异性，选择标准大豆疫霉菌株6497 (购自ATCC，编号为ATCC 16705，下同)以及与大豆疫霉同一种的不同生理小种R3、R6、R8、R12、R14、R17、R19、R20、R28、R31的DNA作为模板，取I μ I DNA溶液，加入23 μ I实施例I制备的检测溶液和
2μ I灭菌去离子水进行LAMP反应，反应程序为64° C 80min。结果显示用LAMP引物去扩增大豆疫霉的生理小种的DNA模板时，都扩增出条带；而阴性对照没有能够扩增出目的条带。同时基于反应体系颜色反应做为结果判定标准，扩增大豆疫霉标准大豆疫霉菌株6497以及生理小种的DNA模板时，呈现天蓝色；阴性对照呈现紫色。这表明本发明建立的LAMP检测方法具有很好的特异性(图I)。实施例3大豆疫霉菌LAMP反应的特异性试验二为了验证LAMP方法的特异性，选择与大豆疫霉不同种(苎麻疫霉；橡树疫霉；掘氏疫霉；恶疫霉；瓜类疫霉；致病疫霉)和不同属的菌(终极腐霉；木贼镰刀菌；平头炭疽菌；稻瘟病菌；立枯丝核菌；大丽轮枝菌)的DNA作为模板，取I μ I DNA溶液，加入23 μ I实施例I制备的检测溶液和I μ I灭菌去离子水进行LAMP反应，反应程序为64° C 80min。结果显示用LAMP引物去扩增大豆疫霉的DNA模板时，都扩增出条带；而与大豆疫霉不同种、不同属的菌和阴性对照都没有能够扩增出目的条带；。同时基于反应体系颜色反应做为结果判定标准，扩增大豆疫霉的DNA模板时，呈现天蓝色；扩增与大豆疫霉不同种、不同属的菌的DNA模板和阴性对照都呈现紫色(图2)。 实施例4大豆疫霉菌LAMP反应的灵敏度试验为了确定LAMP检测方法的灵敏度，将提取的标准大豆疫霉菌株6497的DNA用分光光度计测定浓度(I μ g/μ I)后用DEPC水进行 ο倍比稀释，-70°c保存作为模板。分别取10倍比稀释后的各浓度DNA稀释液I μ L作为模板，加入23 μ I实施例I制备的检测溶液和I μ I灭菌去离子水进行LAMP反应，反应程序为64° C 80min。取2 μ L扩增产物上样，在2%琼脂糖凝胶上电泳，结果显示LAMP方法可以检测到浓度是IOOpg的大豆疫霉的DNA ；HNB显色反应表明LAMP反应的灵敏度也达到IOOpg (图3)。实施例5从海关进境大豆带菌土样中检测大豆疫霉一种检测大豆疫霉的LAMP试剂盒，包含由1.6“1正向内引物？1 、1.64 11反向内引物ΒΙΡ、0. 2μΜ正向外引物F3、0. 2μΜ反向外引物Β3、0. 2μΜ反向环引物LB、1.4mMdNTPs、20mM pH 8.8 的 Tris_HCl、10mM KCl、IOmM(NH4)2S04、6mM MgS04、0. I % TritonX_100、8UBst DNA polymerase 320单位、180mM轻基萘酌·蓝,加入超纯水制备成检测溶液。用上述大豆疫霉检测试剂盒用于检测大豆疫霉的方法，包括I) 土壤中卵孢子的富集取待检土壤样品20 100克，研碎，先后采用200目筛网去处较大土粒，然后经过400,500,800目筛网过滤，同时用3 10升水反复冲洗，从800目筛网上收集卵孢子，用Iml水悬浮。由于卵孢子不能透过800目筛网，这样处理可以达到使卵孢子富集的效果。
2 )从微量卵孢子中提取DNA 将用无菌水悬浮的卵孢子转移到I. 5mL的离心管中，在12000r. min-1转速下离心5分钟，倒出液体；加入50 μ L CTAB buffer，研磨，再加入 500 μ L CTAB buffer,水浴 30 分钟；加入等体积氯仿抽提,在12000r. min-1转速下离心10分钟,吸取上清；加入I /10体积的3M NaAc，2倍体积的无水冰乙醇，室温沉淀30分钟，12000r.min-1转速下离心10分钟,倒干液体；力口ImL 70% (V/V)乙醇洗漆，12000r. min_l转速下离心10分钟,倒干液体,晾干
至无酒精味；加10 μ L无菌双蒸水溶解，用于LAMP扩增的模板。3)大 疫霉LAMP检测，包括大豆疫霉的LAMP检测取I μ I DNA溶液，加入23 μ I权利要求6所述的检测溶液和I μ I灭菌去离子水，总体积为25 μ I ;反应程序为64° C 80min ;以HNB (羟基萘酚蓝)作为反应指示剂，扩增结束后LAMP反应体系的颜色呈现天蓝色，以此判断从海关进境大豆带菌土样中能够产生阳性反应含有大豆疫霉菌。实施例6感病大豆植物的LAMP检测采用NaOH碱裂解法提取接种大豆疫霉的大豆植株的DNA，将其作为模板用于LAMP扩增。取IuLDNA溶液，按实施例5的方法，进行LAMP反应。结果显示接种大豆疫霉的大豆植株组织中进行LAMP，其颜色反应也呈现阳性天蓝色；而健康植株和阴性对照呈现紫色。参考文献I. Canaday, C. , and Schmitthenner, A. 1982. Isolating Phytophthoramegasperma f. sp. glycinea from soil with a baiting method that minimizes Pythiumcontamination. Soil Biology and Biochemistry 14 :67-68.2. Erwin, D. , Ribeiro, 0. , and Shattock, R. 1996. Phytophthora diseasesworldwide. APS press St Paul, MN, USA.3. Kaufmann, M. J. , and Gerdemann, J. 1957. Root and stem rot of soybeancaused by Phytophthora sojae n. sp. University of Illinois at Urbana-Champaign.4. Notomi, T. , Okayama, H. , Masubuchi, H. , Yonekawa, T. , Watanabe, K. , Amino,N. , and Hase,T. 2000. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic AcidsResearch 28 :e63_e63.5. Qutob, D. , Tedman-Jones, J. , Dong, S. , Kuflu, K. , Pham, H. , Wang, Y.,Dou, D. , Kale, S. , Arredondo, F. , and Tylet, B. 2009. Copy number variation andtranscriptional polymorphisms of Phytophthora sojae RXLR effector genes Avrlaand Avr3a. PLoS One 4 :5066.6. Schmitthenner, A. 1985. Problems and progress in control ofPhytophthora root rot of soybean. Plant disease69 362.7. Wang, Y.，Zhang, W.，and Zheng, X. 2006. Rapid and sensitive detection ofPhytophthora sojae in soil and infected soybeans by species-specific polymerasechain reaction assays. Phytopathology 96 :1315-1321.8. Wrather, J.，Stienstra, W.，and Koenning，S. 2001. Soybean disease lossestimates for the United States froml996 to 1998.Canadian Journal of PlantPathology 23 :122-131. 9.朱振东，王化波，王晓鸣，常汝镇，and武小菲.2003.中国大豆疫霉菌分布及毒力多样性研究.中国农业科学36 :793-799.10.苏彦纯，and沈崇尧.1993.大豆疫霉病菌在中国的发现及其生物学特性的研究.植物病理学报。
权利要求
1.用于检测大豆疫霉的LAMP引物组合物，其特征在于由序列为SEQID No. I所示的正向内引物FIP、序列为SEQ ID No. 2所示的反向内引物BIP、序列为SEQ ID No. 3所示的正向外引物F3、序列为SEQ ID No. 4所示的反向外引物B3、序列为SEQ ID No. 5所示的反向环引物LB组成。
2.权利要求I所述的LAMP引物组合物在制备检测大豆疫霉的检测试剂中的应用。
3.—种检测大豆疫霉的LAMP试剂盒，其特征在于含有权利要求I所述的LAMP引物组合物。
4.根据权利要求3所述的检测大豆疫霉的LAMP试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包含由1.6“] 正向内引物？1 、1.64]\1反向内引物81 、0.24]\1正向外引物？3、0.24]\1反向外引物 Β3、0. 2μΜ 反向环引物 LB、1.4mM dNTPs、20mM pH 8· 8 的 Tris-HCl、IOmM KCl,10mM(NH4)2S04、6mM MgS04、0. 1% Triton X_100、8U Bst DNA polymerase 320 单位、180mM羟基萘酚蓝，加入超纯水制备成检测溶液。
5.一种检测大豆疫霉的方法，其特征在于提取待检微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用权利要求I所述的LAMP引物组合物进行LAMP ； 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果，如果存在特征性梯状条带，则证明所检测的病原为大豆疫霉； 或者以LAMP反应体系的颜色变化做为结果判定标准，天蓝色表示检测为阳性，存在大豆疫霉；紫色表示检测结果为阴性，不存在大豆疫霉。
6.根据权利要求5所述的检测大豆疫霉的方法，其特征在于提取待检微生物的DNA，取Iμ I DNA溶液，加入23 μ I权利要求4所述的检测溶液和I μ I灭菌去离子水进行LAMP，LAMP 反应程序为60°C 65。C，55 90min，优选 64°C，80min ； 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果，如果存在特征性梯状条带，则证明存在大 疫霉； 或者以LAMP反应体系的颜色变化做为结果判定标准，天蓝色表示检测为阳性，存在大豆疫霉；紫色表示检测结果为阴性，不存在大豆疫霉。
全文摘要
本发明属于基因工程领域，涉及用于检测大豆疫霉的LAMP引物组合物及其应用。所述的引物组合物由序列为SEQ ID No.1所示的正向内引物FIP、序列为SEQ ID No.2所示的反向内引物BIP、序列为SEQ ID No.3所示的正向外引物F3、序列为SEQ ID No.4所示的反向外引物B3、序列为SEQ ID No.5所示的反向环引物LB组成。所述的LAMP引物组合物可在检测或鉴定大豆疫霉中应用。本发明LAMP引物组合物用于检测大豆疫霉具有良好的特异性灵敏度，扩增快速、高效，且鉴定简便的优点。
文档编号C12R1/845GK102643925SQ201210153469
公开日2012年8月22日 申请日期2012年5月16日 优先权日2012年5月16日
发明者戴婷婷, 王源超, 董莎萌, 郑小波 申请人:南京农业大学