专利名称：一种表达蛇毒激肽原酶的高效麦胚无细胞蛋白合成系统的建立及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及ー种高效表达人源蛇毒激肽原酶的麦胚无细胞蛋白合成系统、其构建方法及应用。
背景技术：
激肽原酶是动物体内的ー种蛋白水解酶，存在于许多器官的组织中。人们认识最早、研究最为清楚的是蛇毒中的胰激肽原酶。胰激肽原酶(Pancreatic Kallidinogenase)又称为胰激肽释放酶(Pancreatic Kallikrein)是ー类内切型蛋白水解酶,存在于哺乳动物体内的多种组织，尤以蛇毒中含量最为丰富。在体内作用于激肽原，使其释放出激肽，从 而发挥出一系列的药理作用使微血管扩张，改善外周血液循环；促进前列腺素分泌，扩张小动脉，増加肾血管流量；激活纤溶酶系统，使纤维蛋白水解，降低血液粘度，防止血栓形成，溶解血栓。临床上主要用于微循环障碍引起的肾病变及眼底供血障碍、高血压症、脑动脉硬化和脑动脉血栓、冠心病及其它闭塞性周围血管性疾病的治疗。目前国内临床上所使用的激肽原酶均为从哺乳动物的胰腺中提取，纯度不高，具有一定的抗原性，进入人体后，可能诱发一系列的抗原抗体反应，已有报道注射胰激肽原酶导致固定性药疹及重症多形红斑药疹，且不能实现静脉注射给药，使药物不能最大限度发挥作用。经过多年的临床实践，发现江浙蝮蛇蛇毒类激肽原酶有最好的疗效。然而蛇毒资源是非常有限的，如果通过基因工程来获得产品，则是ー个很有前途的途径。为此，本发明利用基因工程技术，通过反转录克隆了江浙蝮蛇中的蛇毒激肽原酶基因，利用麦胚无细胞蛋白合成系统对其进行表达，使蛇毒激肽原酶的安全生产成为可能，同时为蛇毒激肽原酶的结构和性质研究提供了实验材料。
发明内容
本发明的目的是提供一个能够高效表达重组蛇毒激肽原酶的高效麦胚无细胞蛋白合成系统。本发明的另一目的是提供上述高效麦胚无细胞蛋白合成系统的构建方法。本发明的进ー步目的是提供上述高效麦胚无细胞蛋白合成系统在生产重组蛇毒激肽原酶中的应用。为了实现本发明目的，本发明的ー种含有蛇毒激肽原酶的基因工程菌，其出发菌株为大肠杆菌DH5a。上述基因工程菌的构建方法，其包括步骤1)从江浙蝮蛇组织中提取总RNA，经RT-PCR扩增得到VK基因；2)将步骤I)中得到的VK基因插入到表达载体中；3)将步骤2)中构建的表达载体转入大肠杆菌，筛选阳性克隆，得到重组大肠杆菌工程菌。前述的方法，其中所述表达载体的出发载体为PCS2+。前述的方法，其中所述VK基因具有Seq ID No: I所示的核苷酸序列。
为了获得麦胚无细胞表达载体质粒，本发明通过反转录江浙蝮蛇组织得到VK基因，用PCR方法在5’端加上GGATCC以构成BamHI酶切位点，在BamHI后加入CACCATCATCATCATCAT以构成组氨酸标签，3’端加上CTCGAG以构成XhoI酶切位点，然后经BamHI及XhoI两种酶消化后，即可直接克隆至pCS2+质粒，得到pCS2+/VK质粒。本发明以pCS2+作为表达载体,是由于pCS2+适合于麦胚无细胞表达系统。目的基因被克隆到PCS2+质粒载体上，受SP6转录及翻译(可选择)信号控制；由外源SP6 RNA聚合酶诱导进行转录。该系统适合众多实验应用，如细菌或哺乳动物蛋白的细胞内表达，无细胞表达等。此外在PCS2+质粒载体上所表达的外源蛋白的N端引入His蛋白标签，可以用Ni柱洗脱的方法进行纯化，从而极大地简化了重组蛋白的后续纯化工作，非常适合目的蛋白的收集。本发明以轮选987硬质小麦为原料，先人エ将麦胚分离出来，液氮中磨碎加入抽提物缓冲液，离心取上清得到麦胚抽提物，-80°C保存备用。抽提物缓冲液包括40mM、Hepes - KOH pH7. 6、IOOmM 醋酸钾、5mM 醋酸镁、2mM 氯化钙和 4mM DTT。将上述pCS2+/VK麦胚无细胞表达载体与SP6 RNA聚合酶、NTP以及相应缓冲液混合后37°C反应4h，得到重组蛇毒激肽原酶mRNA。将所得mRNA与麦胚抽提物和翻译缓冲液混合后，用双层法，反应16h得到目的蛋白。翻译缓冲液包括25mM Hepes-KOH pH7. 6、100mM醋酸钾、2. 7mM醋酸镁、I. OmM ATP,O. 25mM GTP、16mM磷酸肌酸、O. 4mM各种氨基酸、O. 4mM亚精胺、5mM DTT。向翻译体系中补充质粒载体和15U SP6 RNA聚合酶，NTP及转录缓冲液适量，随着质粒载体的浓度提高蛋白产量也相应提高，质粒载体浓度超过30ng/y I时蛋白产量趋于稳定，向翻译体系中补充磷酸肌酸，随着磷酸肌酸浓度提高蛋白产量也相应提高，浓度超过25mM时蛋白产量趋于稳定，而向翻译体系中补充Cu2+是在其浓度5mM时，蛋白产量达到最大。为了分离纯化蛇毒激肽原酶蛋白，本发明还提供了由上述工程菌所表达的蛇毒激肽原酶蛋白的纯化方法，包括如下步骤I)收集翻译后的混合液体；2)用His TrapTM FF凝胶柱进行亲和层析；3)通过梯度脱盐。具体地说，本发明中蛇毒激肽原酶蛋白的纯化方法包括如下步骤I)收集翻译反应完成后的混合液体；2)将步骤I)中得到的液体与His TrapTM FF凝胶柱结合，用洗涤缓冲液除去未结合的蛋白，然后用洗脱缓冲液洗脱，得到目的蛋白；所述结合缓冲液含有20mmol/L憐酸钠、40mmol/L咪唑、O. 5mol/LNaCl>8mol/L尿素，pH值为8. O ;所述洗涤缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、100mmol/L咪唑、O. 5mol/L NaCl,8mol/L尿素，pH值为8. O ;所述洗脱缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、500mmol/L咪唑、O. 5mol/L NaCl、8mol/L 尿素，pH 值为 8. O ；本发明的纯化方法，能使VK重组蛋白纯度达到90%。根据蛇毒激肽原酶具有精氨酸酯酶活性，专ー性的水解精氨酸酯类化合物，从而释放精氨酸，使其在253nm处吸光值增加的特性測量重组激肽原酶活性。
底物溶液含N-苯甲酰-L-精氨酸こ酯盐酸盐(BAEE) 17. 7mg, IMTris-HCl pH8. O。本发明得到重组蛋白比活力略小于天然蛋白比活力(I. 736U/mg)为I. 3U/mg。借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果(I)本发明通过RT-PCR方法反转录蛇毒激肽原酶基因，从而将蛇毒激肽原酶基因连接到麦胚无细胞表达载体上，进行体外转录和表达，VK蛋白表达量占总蛋白的50%。(2)使用麦胚无细胞蛋白表达系统，对蛇毒激肽原酶进行体外转录和表达，反应时间短整个过程仅需一天时间，省去了工程菌表达所需要的细胞培养时间，产量达到了O. 74mg/ml能够实现蛇毒激肽原酶基因的高效表达，且蛋白活性仅略低于天然蛋白，为后期临床研究奠定了基础。(3)本发明利用所表达的外源蛋白的N端具有His蛋白标签，可以用Ni柱洗脱的方法进行纯化，极大地简化了重组蛋白的后续纯化工作，纯度高达90%以上，且纯化效率 高、成本低，适合目的蛋白的大規模制备。
图I为本发明的重组表达质粒pCS2+/VK的酶切鉴定电泳图，其中，M为DL2000Marker ；1为双酶切产物。图2为本发明VK重组蛋白体外转录电泳图，其中，M为DL2000Marker ；1转录产物。图3为本发明VK重组蛋白体外表达纯化后的SDS-PAGE和Western blot分析图；其中，A为SDS-PAGE分析图，B为Western blot分析图，其中，I为分子量蛋白Marker ;2为纯化后重组蛋白；3为纯化前重组蛋白；4为未加mRNA的反应混合物。图4为本发明麦胚无细胞表达系统条件优化电泳图；A为磷酸肌酸优化电泳图，I为分子量蛋白Marker ;2、3、4分别向反应混合物中加入25mM，15mM, 5mM的磷酸肌酸铜离子浓度优化电泳图I为分子量蛋白Marker ;2、3、4、5分别向反应混合物中加入IOmM, 5mM, 2mM, OmM Cu2+ ；C为质粒载体浓度优化电泳图I为分子量蛋白Marker ;2、3、4、5分别向反应混合物中加入Ong/ μ I, 5ng/ μ I, 15ng/ μ l,30ng/ μ I质粒载体。图5为本发明重组蛋白酶比活力柱状图，其中I为重组蛋白比活力1.736U/mg;2为天然蛋白去糖链后比活力I. 528U/mg ;3为天然蛋白比活力I. 3U/mg。
具体实施例方式以下步骤用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。步骤I蛇毒激肽原酶基因的扩增从江浙蝮蛇组织中提取总RNA，经RT-PCR扩增得到VK基因。用1%琼脂糖凝胶电泳检测并回收目的条带后通过T4 DNA连接酶于4°C连接过夜至pGEM-T载体，然后转化至大肠杆菌DH5 α ;转化株先经过蓝白斑筛选，再用PCR扩增(扩增的程序为94°C预变性5min ；98°C变性10s，60°C复性15s，72°C延伸lmin，30个循环；72°C延伸lOmin，结束反应)并进行
测序鉴定。步骤2表达载体的构建及大肠杆菌的转化设计上游引物I 5’ -T CATCATCATCATGTCATTGGAGGTGATGAATGTAACA-3’ 上游引物25’-CGCGGATCCATGCACCATCATCATCATCATGTCATTGGAGG-3’ (下划线部分为 BamH I 酶切位点)和下游引物5’ -CCGCTCGAGTCACGGGGGGCATGTCAC-3’(下划线部分为Xho I酶切位点)，用PCR方法扩增得到不含信号肽的VK基因。PCR产物经BamH I和Xho I消化后插入表达载体pCS2+的BamH I和Xho I位点，将此质粒转入大肠杆菌DH5 α，提取转化株质粒经BamH I和Xho I酶切，测序鉴定后(图1)，转入大肠杆菌DH5a。步骤3重组激肽原酶体外转录和翻译(I)制备麦胚抽提物，选取轮 选987硬质小麦为原料，人工提取麦胚，将其在液氮中磨成粉末加入抽提物缓冲液(40mMfepes - KOH pH7. 6、IOOmM醋酸钾、5mM醋酸镁、2mM氯化钙和4mM DTT)离心取上清后，_80°C保存备用。(2)体外转录，提取构建好的pCS2+/VK载体，将其与转录缓冲液(5mM ATP、CTP,GTP、UTP(浓度？)、80mM Hepes-KOH pH7. 6，16mM 醋酸镁、2mM 亚精胺、IOmM DTT、15 单位 SP6RNA聚合酶)混合，37°C反应4h得到激肽原酶mRNA。(图2)(3)体外翻译，将转录得到的激肽原酶mRNA与麦胚抽提物和翻译缓冲液(25mMHepes-KOH ρΗ7· 6、IOOmM 醋酸钾、2. 7mM 醋酸镁、I. OmM ATP,O. 25mM GTP、16mM 磷酸肌酸、0.4mM各种氨基酸、0.4mM亚精胺、5mM DTT)混合，应用双层法反应16h得到目的蛋白。(图3)步骤4麦胚无细胞表达系统的优化(I)二次能源物质磷酸肌酸的优化，向翻译系统中加入肌酸激酶(15U)和不同浓度的磷酸肌酸(25mM，15mM, 5mM)比较蛋白产量。(图4A)(2)铜离子浓度优化，向翻译系统中加入Cu2+ (IOmM, 5mM, 2mM, OmM)比较蛋白产量。(图 4B)(3)质粒载体浓度的优化，向翻译系统中加入适量转录缓冲液和不同浓度的质粒载体(Ong/μ l，5ng/y 1，15ng/μ 1，30ng/μ I)比较蛋白产量。(图 4C)步骤5蛋白的纯化His TrapTM FF凝胶柱用IOmL双蒸水洗涤后用IOmL结合缓冲液平衡，上样使目的蛋白与凝胶柱结合，没有结合的蛋白用洗漆缓冲液(20mmol/L磷酸钠，100mmol/L咪唑，O. 5mol/L NaCl, 8mol/L尿素,ρΗ8· O)除去,最后用洗脱缓冲液(20mmol/L磷酸钠，500mmol/L咪唑，O. 5mol/L NaCl，8mol/L尿素，ρΗ8· O)洗脱，得至Ij目的蛋白，纯度达90%。步骤6重组蛋白的鉴定对步骤5中得到纯化的目的蛋白和步骤I中得到的蛋白进行SDS-PAGE电泳和Weatern bloting分析。(图3)并对步骤5中得到纯化的目的蛋白进行了酶比活力的测定并与天然蛋白进行了比较。(图5)虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作ー些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种表达蛇毒激肽原酶的高效麦胚无细胞蛋白合成系统的建立方法，其特征在于，其包括步骤I)从江浙蝮蛇组织中提取总RNA，经RT-PCR扩增得到蛇毒激肽原酶VK基因；2)以pCS2+作为表达载体，将VK基因插入到表达载体中并引入His标签得到麦胚无细胞表达载体质粒；3)将表达载体转入大肠杆菌，筛选阳性克隆，得到重组大肠杆菌工程菌，建立体外转录、翻译系统。
2.如权利要求I所述的一种表达蛇毒激肽原酶的高效麦胚无细胞蛋白合成系统的建立方法，其特征在于，该系统含有蛇毒激肽原酶(VK)基因的表达载体，所述蛇毒激肽原酶基因具有Seq ID No: I所示的核苷酸序列。
3.如权利要求I或2所述的一种表达蛇毒激肽原酶的高效麦胚无细胞蛋白合成系统的建立方法，其特征在于，建立体外转录系统，提取权利要求4所述工程菌中质粒进行表达包括建立体外转录体系，将提取质粒加入体系中于37°C反应4h，得到的转录产物，所述体外转录体系包括5mM ATP、5mM CTP、5mM GTP、5mM UTP、8OmMH印es - KOH pH7. 6，16mM醋酸镁、2mM亚精胺、IOmM DTT, 15单位SP6RNA聚合酶。·
4.如权利要求I或2所述的一种表达蛇毒激肽原酶的高效麦胚无细胞蛋白合成系统的建立方法，其特征在于，建立体外翻译系统，将权利要求5中得到的转录产物与麦胚抽提物和翻译缓冲液混合26V反应16h，得到目的蛋白并进行纯化，所述翻译缓冲液包括25mMHepesK0H pH7. 6、IOOmM醋酸钾、2. 7mM醋酸镁、I. OmM ATP,O. 25mM GTP、16mM磷酸肌酸、O.4mM各种氛基酸、O. 4mM亚精胺、5mM DTT。
5.如权利要求4所述的一种表达蛇毒激肽原酶的高效麦胚无细胞蛋白合成系统的建立方法，其特征在于，所述目的蛋白的纯化方法，包括如下步骤 O收集含有目的蛋白的反应液； 2)将步骤I)中得到的混合液与His TrapTM FF凝胶柱结合，用洗涤缓冲液除去未结合的蛋白，然后用洗脱缓冲液洗脱，得到目的蛋白；所述洗脱缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、40mmol/L咪唑、O. 5mol/LNaCl、8mol/L尿素，pH值为8. O ;所述洗涤缓冲液含有20mmol/L磷酸钠、100mmol/L咪唑、O. 5mol/L NaCl、8mol/L尿素，pH值为8. O ;所述洗脱缓冲液含有20mmol/L 磷酸钠、500mmol/L 咪唑、O. 5mol/L NaCl、8mol/L 尿素，pH 值为 8. O。
6.如权利要求6所述的一种表达蛇毒激肽原酶的高效麦胚无细胞蛋白合成系统的建立方法，其特征在于，所述体外翻译系统的优化为向转录产物与麦胚抽提物和翻译缓冲液混合液补充质粒载体30ng/l·! 1，SP6RNA聚合酶15U，NTP及转录缓冲液适量，磷酸肌酸25mM以及Cu2+5mM反应16h，可使麦胚无细胞系统表达的VK蛋白产量由O. 13mg/ml提高到O.74mg/ml。
7.麦胚无细胞系统表达的VK蛋白的纯化方法，包括如下步骤 1)蛋白翻译完成后收集翻译混合液体； 2)用HisTrapTM FF凝胶柱进行亲和层析； 3)通过梯度透析，将蛇毒激肽原酶蛋白脱盐。
8 重组蛇毒激肽原酶活性检测，其特征在于，测定方法在253nm波长处，以底物溶液为空白，准确读取I分钟的吸光度Al和3分钟的吸光度A3，ΔΑ{|( Δ A=A3 一 Al)的平均值代入下式计算
全文摘要
本发明建立了一个用来高效表达重组蛇毒激肽原酶的麦胚无细胞蛋白合成系统，其是通过反转录克隆了江浙蝮蛇中的蛇毒激肽原酶基因，构建麦胚无细胞表达质粒pCS2+/VK，制备麦胚抽提物，建立体外转录和翻译体系，对蛇毒激肽原酶进行表达并对系统进行了优化。该表达系统所表达的外源蛋白的N端具有His蛋白标签，通过Ni柱洗脱的方法进行纯化，极大地简化了重组蛋白的后续纯化工作，且纯化效率高、成本低。该外源蛋白还具有生物学活性为下一步临床研究奠定了基础。
文档编号C12N15/70GK102732548SQ20121015357
公开日2012年10月17日 申请日期2012年5月16日 优先权日2012年5月16日
发明者宋梦薇, 张雅楠, 王云鹏, 罗云波, 许文涛, 马骉, 黄昆仑 申请人:中国农业大学, 北京赛升药业股份有限公司