专利名称：一种微载体悬浮培养细胞接种禽流感病毒的方法
技术领域：
本发明涉及禽流感疫苗技术领域，具体地，涉及一种微载体悬浮培养细胞接种禽流感病毒的方法。
背景技术：
过去我国一直通过鸡胚培养生产流感疫苗。由于鸡胚生产流感疫苗需要消耗大量鸡胚，生产周期长，易污染，不易于控制，而且每只受精鸡蛋一次只能注射一个病毒菌株，因此这种生产方法效率很低，不利于应对大规模的流感爆发。我国禽流感在不同地区流行情况不同，并且禽流感在不同地区之间的扩散快；用鸡胚生产禽流感疫苗，生产多少疫苗必须提前做出精确计划，但一般来说禽流感爆发，人们很难在短时间内购置生产疫苗所需的数百万只鸡蛋。为此，世界卫生组织、美国政府等都鼓励发展细胞培养技术替代目前的鸡胚培养技术来生产流感疫苗。以哺乳动物细胞为基质制备疫苗具有无外源因子污染、易于规模化生产、能较好的维持病毒抗原稳定等优点。但是，仅仅依靠动物细胞培养生产病毒的量有限，因此将载体培养技术应用于禽流感疫苗的生产，无疑将既保持细胞培养的优势又克服了其生产产量有限的缺点。目前常使用的有两种载体，一种是片状载体，另外一种是球状载体。由于多数禽流感病毒入侵细胞过程中需要使用少量胰酶。而血清中含有胰酶抑制物，因此在接种和繁殖禽流感病毒过程中不能添加血清。而载体培养细胞过程中需要添加血清。如果使用片状载体培养细胞，其片状载体是固定在生物反应器中，在接种和繁殖禽流感病毒时，去除培养基中的血清就非常容易，只需要使用PBS或者不含血清的培养基清洗就行了。而使用微载体培养细胞时，在接种和繁殖禽流感病毒就出现下面情况1)由于球形微载体小(100微米左右)，质量轻，在更换培养基或者使用PBS清洗的过程中微载体随着溶液丢失的现象比较严重；2)细胞在微载体上长满后，由于细胞与细胞之间的相互作用，多个微载体很容易连接在一起；3)在病毒接种过程中，由于为了使病毒接种液与载体均匀混合，但生物反应器搅拌的速度又不能过快，否则影响病毒入侵细胞。这样经常容易造成部分微载体沉淀在生物反应器底部，而引起接毒不均匀甚至根本没有接上病毒的现象。但是微载体培养细胞繁殖禽流感病毒具有下列优势1)容易扩大；2)容易收集细胞。
发明内容
为了解决微载体培养细胞繁殖禽流感病毒过程中出现的一系列问题，本发明提供了一种微载体悬浮培养细胞接种禽流感病毒的方法。该方法解决微载体培养细胞繁殖禽流感病毒过程出现的载体丢失、血清清洗不干净、接毒不均匀甚至接不上禽流感病毒等问题。
本发明的技术方案如下微载体悬浮培养细胞接种禽流感病毒的方法，包括如下具体步骤
1:选择导入载体所需要的种细胞MDCK或者Veix)；
2:转瓶繁殖细胞传代的方法首先复苏步骤I所选择的种细胞到T225的细胞瓶中，生长48h左右，按照I :4的比例进行传代；然后把4个长满细胞的T225细胞瓶中的细胞传到I个15L转瓶进行培养；48小时左右按照I :4或I :3的比例进行细胞传代培养；
3:收获转瓶中的细胞将步骤2所得细胞用PBS洗涤2-3次，然后加入胰酶-EDTA溶液消化；15L转瓶加入100-150ml胰酶-EDTA溶液 ，其它类型的转瓶按照类似比例添加胰酶-EDTA溶液消化，然后收集细胞；
4:收获的细胞计数后,按照每个微载体添加5-20个细胞的比例进行细胞接种；每升培养基中加入2-10克微载体；
5:生物反应器培养接种细胞
生物反应器投放载体的量为2-10克/升；生物反应器培养细胞的培养基为MEM(Hyclone);血清使用浓度为7_10% ；C02通气量为5-10% ;溶氧量为40-60%的溶液饱和溶氧量；温度为37°C ;搅拌速度为30-55转/分，pH为6. 8-7. 4 ；90-95%以上的微载体在细胞接种后48-72h期间能够达到接种禽流感病毒的要求；
6:步骤5培养的细胞达到接种禽流感病毒的要求后，进行下述步骤在搅拌的状态下，通过虹吸的原理，把生物反应器中的培养基连带微载体一起转移到放置有150-250目不锈钢筛网的容器中，该容器顶部含有三通孔，能够控温37°C，容器下部装有与容器紧密固定在一起的不锈钢筛网，该容器的底部含有一个排液出口 ；容器中的培养基通过排液出口排掉；然后用PBS洗涤收集在容器中的微载体，并通过容器的底部排液出口排出PBS ；
7:然后关闭排液出口，把禽流感病毒-胰酶接种液加入到步骤6所得收集有微载体的容器中，同时连通容器的底部阀门和顶部三通管的一个孔，并且使用蠕动泵缓慢的泵禽流感病毒-胰酶接种液使其在长满细胞的微载体上慢慢的循环流动，以便病毒均匀接种，从而避免了在生物反应器中直接接种病毒造成病毒接种不均一；另外，在生物反应器中接种时，如果搅拌速度过慢，不少微载体沉淀在生物反应器底部，造成病毒接种不均一；
8:细胞接种病毒后，向步骤7所得装有微载体的容器加入不含血清的MEM培养基，并利用虹吸的原理通过虹吸使微载体连同培养基一起加入到生物反应器中，然后进行病毒繁殖，病毒在生物反应器中繁殖的条件为培养基为MEM (Hyclone)； CO2通气量为5-10% ;溶氧量为40-60%的溶液饱和溶氧量；温度为37°C。搅拌速度为30-45转/分，pH为6. 5-7. 2 ；
9:收集禽流感病毒液。较佳地，步骤6中，通过150-250目不锈钢筛网收集已经长满细胞的微载体避免在使用PBS洗涤微载体的过程中，载体的丢失。较佳地，步骤6中，PBS洗涤收集在容器中的微载体重复2-3次；
较佳地，步骤7中，病毒繁殖过程中，当病毒繁殖培养基pH低于6. 5或者禽流感病毒HA价高于9. 0,就更换部分溶液。所述微载体为Cytodex I 或 hyclone。本发明的有益效果为本发明所述微载体悬浮培养细胞接种禽流感病毒的方法，能够很好的在微载体培养的细胞上接种禽流感病毒，并且获得较高效价的禽流感病毒液，其HA大于9. O，并且微载体损失量非常小，是一个值得推广应用的方法。
图I、细胞接种在微载体上12h后的生长状况；
图2、细胞接种在微载体上24h后的生长状况；
图3、细胞接种在微载体上48h后的生长状况；
图4、细胞接种在微载体上72h后的生长状况。
具体实施例方式实施例I :微载体生物反应器悬浮培养繁殖H5亚型禽流感灭活疫苗
1:选择导入载体所需要的种细胞MDCK ；
2:转瓶繁殖细胞传代的方法首先复苏步骤I所选择的种细胞MDCK到T225的细胞瓶中，生长48h左右，按照I :4的比例进行传代；然后把4个长满细胞的T225细胞瓶中的细胞传到I个15L转瓶进行培养；48小时左右按照I :4的比例进行细胞传代培养；该过程中使用的培养基为MEM，血清为胎牛血清，使用量为7% ；
3:收获转瓶中的细胞将步骤2所得细胞用PBS洗涤3次，然后加入浓度为0. 25%胰酶-EDTA溶液125ml消化，收集细胞；
4:收获的细胞计数后,选用的微载体为Cytodex I，按照每个微载体添加20个细胞的比例进行细胞接种；每升培养基中加入4克微载体；细胞接种后在12h、24h、48h、72h取样观察细胞在微载体上的生长状况，如图1-4所示。5 :生物反应器培养细胞的条件为
选用7. 5L的NBS生物反应器，其工作体积为5L，培养细胞的培养基为MEM (Hyclone)；血清使用浓度为7% ；C02通气量为10% ;溶氧量为60%的溶液饱和溶氧量；温度为37°C ;搅拌速度为40转/分，pH为7. 4 ;培养时间为60h ；
6:步骤5培养的细胞达到接种禽流感病毒的要求后，进行下述步骤在搅拌的状态下，通过虹吸的原理，把生物反应器中的培养基连带微载体一起转移到放置有150目不锈钢筛网的容器中，该容器顶部含有三通孔，能够控温37°C，容器下部装有与容器紧密固定在一起的不锈钢筛网，该容器的底部含有一个排液出口 ；容器中的培养基通过排液出口排掉；然后用PBS洗涤收集在容器中的微载体，并通过容器的底部排液出口排出PBS ；
7:然后关闭排液出口，把H5亚型禽流感病毒-胰酶接种液加入到步骤6所得收集有微载体的容器中，同时连通容器的底部阀门和顶部三通管的一个孔，并且使用蠕动泵缓慢的泵H5亚型禽流感病毒-胰酶接种液使其在长满细胞的微载体上慢慢的循环流动，以便病毒均匀接种；
8:细胞接种病毒后，向步骤7所得装有微载体的容器加入不含血清的MEM培养基，并利用虹吸的原理通过虹吸使微载体连同培养基一起加入到生物反应器中，然后进行病毒繁殖，H5亚型禽流感病毒在生物反应器中繁殖的条件为培养基为MEM (Hyclone)； CO2通气量为5-10% ;溶氧量为40%的溶液饱和溶氧量；温度为37°C。搅拌速度为40转/分，pH为7. 2 ；
9:收集H5亚型禽流感病毒。其H5亚型禽流感病毒液收获量为10L，HA价大于9. O。
实施例2 :微载体悬浮培养繁殖H9亚型禽流感病毒
1:选择导入载体所需要的种细胞MDCK ；
2:转瓶繁殖细胞传代的方法首先复苏步骤I所选择的种细胞MDCK到T225的细胞瓶中，生长48h左右，按照I :4的比例进行传代；然后把4个长满细胞的T225细胞瓶中的细胞传到I个15L转瓶进行培养；48小时左右按照I :3的比例进行细胞传代培养；该过程中使用的培养基为MEM，血清为胎牛血清，使用量为10% ；
3:收获转瓶中的细胞将步骤2所得细胞用PBS洗涤2次，然后加入浓度为0. 25%胰 酶-EDTA溶液125ml消化，收集细胞；
4:收获的细胞计数后,选用的微载体为Cytodex I，按照每个微载体添加5个细胞的比例进行细胞接种；每升培养基中加入3克微载体；细胞接种后在12h、24h、48h、72h取样观察细胞在微载体上的生长状况。5 :生物反应器培养细胞的条件为
选用7. 5L的NBS生物反应器，其工作体积为5L，培养细胞的培养基为MEM (Hyclone)；血清使用浓度为7-10% ；C02通气量为10% ;溶氧量为40%的溶液饱和溶氧量；温度为37°C ；搅拌速度为40转/分，pH为7. 4 ;培养时间为56h ；
6:步骤5培养的细胞达到接种禽流感病毒的要求后，进行下述步骤在搅拌的状态下，通过虹吸的原理，把生物反应器中的培养基连带微载体一起转移到放置有150目不锈钢筛网的容器中，该容器顶部含有三通孔，能够控温37°C，容器下部装有与容器紧密固定在一起的不锈钢筛网，该容器的底部含有一个排液出口 ；容器中的培养基通过排液出口排掉；然后用PBS洗涤收集在容器中的微载体，并通过容器的底部排液出口排出PBS ；
7:然后关闭排液出口，把H9亚型禽流感病毒-胰酶接种液加入到步骤6所得收集有微载体的容器中，同时连通容器的底部阀门和顶部三通管的一个孔，并且使用蠕动泵缓慢的泵H9亚型禽流感病毒-胰酶接种液使其在长满细胞的微载体上慢慢的循环流动，以便病毒均匀接种；
8:细胞接种病毒后，向步骤7所得装有微载体的容器加入不含血清的MEM培养基，并利用虹吸的原理通过虹吸使微载体连同培养基一起加入到生物反应器中，然后进行病毒繁殖，H9亚型禽流感病毒在生物反应器中繁殖的条件为培养基为MEM (Hyclone) ； CO2通气量为10% ;溶氧量为40%的溶液饱和溶氧量；温度为37°C。搅拌速度为40转/分，pH为6. 5-7. 2 ；
9:收集H5亚型禽流感病毒。其禽流感病毒液收获量为9L，HA价大于9. 0。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其架构形式能够灵活多变，可以派生系列产品。只是做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。
权利要求
1.微载体悬浮培养细胞接种禽流感病毒的方法，其特征在于，包括如下具体步骤 1:选择导入载体所需要的种细胞MDCK或者VeiO ； 2:转瓶繁殖细胞传代的方法首先复苏步骤I所选择的种细胞到T225的细胞瓶中，生长48h左右，按照I :4的比例进行传代；然后把4个长满细胞的T225细胞瓶中的细胞传到I个15L转瓶进行培养；48小时左右按照I :4或I :3的比例进行细胞传代培养； 3:收获转瓶中的细胞将步骤2所得细胞用PBS洗涤2-3次，然后加入胰酶-EDTA溶液消化；15L转瓶加入100-150ml胰酶-EDTA溶液，其它类型的转瓶按照类似比例添加胰酶-EDTA溶液消化，然后收集细胞； 4:收获的细胞计数后,按照每个微载体添加5-20个细胞的比例进行细胞接种；姆升培养基中加入2-10克微载体； 5:生物反应器培养接种细胞 生物反应器投放载体的量为2-10克/升；生物反应器培养细胞的培养基为MEM(Hyclone);血清使用浓度为7_10% ；C02通气量为5-10% ;溶氧量为40-60%的溶液饱和溶氧量 ，温度为37°C ;搅拌速度为30-55转/分，pH为6. 8-7. 4 ；90-95%以上的微载体在细胞接种后48-72h期间能够达到接种禽流感病毒的要求； 6:步骤5培养的细胞达到接种禽流感病毒的要求后，进行下述步骤在搅拌的状态下，通过虹吸的原理，把生物反应器中的培养基连带微载体一起转移到放置有150-250目不锈钢筛网的容器中，该容器顶部含有三通孔，能够控温37°C，容器下部装有与容器紧密固定在一起的不锈钢筛网，该容器的底部含有ー个排液出口 ；容器中的培养基通过排液出口排掉；然后用PBS洗涤收集在容器中的微载体，并通过容器的底部排液出ロ排出PBS ； 7:然后关闭排液出ロ，把禽流感病毒-胰酶接种液加入到步骤6所得收集有微载体的容器中，同时连通容器的底部阀门和顶部三通管的ー个孔，并且使用蠕动泵缓慢的泵禽流感病毒-胰酶接种液使其在长满细胞的微载体上慢慢的循环流动，以便病毒均匀接种； 8:细胞接种病毒后，向步骤7所得装有微载体的容器加入不含血清的MEM培养基，并利用虹吸的原理通过虹吸使微载体连同培养基一起加入到生物反应器中，然后进行病毒繁殖，病毒在生物反应器中繁殖的条件为培养基为MEM (Hyclone)； CO2通气量为5-10% ;溶氧量为40-60%的溶液饱和溶氧量 ，温度为37°C ； 搅拌速度为30-45转/分，pH为6. 5-7. 2; 9:收集禽流感病毒液。
2.如权利要求I所述的微载体悬浮培养细胞接种禽流感病毒的方法，其特征在于，步骤6中，通过150-250目不锈钢筛网收集已经长满细胞的微载体。
3.如权利要求I所述的微载体悬浮培养细胞接种禽流感病毒的方法，其特征在于，步骤6中，用PBS洗涤收集在容器中的微载体重复2-3次。
4.如权利要求I所述的微载体悬浮培养细胞接种禽流感病毒的方法，其特征在于，步骤7中，禽流感病毒接种过程中，微载体和细胞在不流动的情况下，通过蠕动泵缓慢的泵禽流感病毒-胰酶接种液使其在长满细胞的微载体上慢慢的循环流动，以便病毒均匀接种。
5.如权利要求I所述的微载体悬浮培养细胞接种禽流感病毒的方法，其特征在于，步骤7中，病毒繁殖过程中，当病毒繁殖培养基pH低于6. 5或者禽流感病毒HA价高于9. O,就更换部分溶液。
6.如权利要求I所述的微载体悬浮培养细胞接种禽流感病毒的方法，其特征在于，所述微载体为Cytodex I或hyclone。
全文摘要
本发明提供了一种微载体悬浮培养细胞接种禽流感病毒的方法，包括如下具体步骤选择导入载体所需要的种细胞；转瓶繁殖细胞传代；收获转瓶中的细胞；细胞接种微载体；生物反应器培养接种细胞；收集长满细胞的微载体然后接种禽流感病毒-胰酶；培养禽流感病毒-胰酶；收集禽流感病毒液。该方法解决微载体培养细胞繁殖禽流感病毒过程出现的载体丢失、血清清洗不干净、接毒不均匀甚至接不上禽流感病毒等问题。
文档编号C12N5/02GK102676460SQ20121015362
公开日2012年9月19日 申请日期2012年6月19日 优先权日2012年6月19日
发明者张冬霞, 徐家华, 施维松, 汤钦, 陈瑞爱 申请人:广东大华农动物保健品股份有限公司, 肇庆大华农生物药品有限公司