专利名称：弥漫性大b细胞淋巴瘤分子标记物检测方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物学和医学检验领域，涉及ー组肿瘤分子标记物及其临床应用。具体而言，涉及弥漫性大B细胞淋巴瘤的分子分型标记物、检测方法及该检测方法涉及的试剂盒。
背景技术：
弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse Large B-Cell Lymphoma,DLBCL)是目前最常见的成人非霍奇金淋巴瘤，是ー种具有高侵袭性、生长迅速的肿瘤。占西方国家成人非霍奇金淋巴瘤的30% 40% ^目前，我国非霍奇金淋巳瘤的发病率约为4/10万，并以每年2-3%的速度增长，其中DLBCL最为常见，约占毎年所有淋巳瘤的50%，因此，毎年全国新发病例约为 2-3万。2008年WHO分类将DLBCL定义为大的肿瘤性B淋巴细胞呈弥漫性生长，肿瘤细胞的核与正常组织细胞的核相近或大于组织细胞的核，细胞大小不小于正常淋巴细胞的两倍2。研究表明DLBCL在病理形态学、免疫学表型、基因表达等方面均具有较高的异质性，越来越多的证据显示其可能并不是ー个真正独立的病种。正是由于DLBCL具有显著的生物学异质性，病人对治疗的反应差异显著，常规的CHOP联合化疗方案(环磷眈氨、阿霉素、长春新碱和泼泥松)只能使约40%的患者获得长期缓解。随着人鼠嵌合性抗CD20单克隆抗体(利妥昔单抗，Rituximab)联合化疗(R-CHOP)的应用，进ー步提高DLBCL的临床疗效，但仍有30-40%的患者对治疗无效或治疗后迅速复发，疾病进展快，预后差。因此，研究DLBCL不同亚型的生物学特性，制定相应的治疗方案成为目前DLBCL的研究热点。当前评价DLBCL患者的预后主要依赖临床參数，最常用的是国际预后指数(international prognostic index,IPI)，包括年龄、功能状态、血清乳酸脱氢酶水平、累及结外部位的数量以及AnnArbor分期等5个临床特征\由于这种评价方式仅是ー些临床指标的结合，并不能很好地反映肿瘤发生过程中内在的分子生物学特征。因此，对相当一部分患者的预后不能进行准确评价，具有相同IPI值的患者治疗后可能呈现完全不同的生存状况，一些被分在低危、低中危组的病人5年生存率仍仅有32%。近年来，基于基因表达谱的研究大大加深了对DLBCL的认识，也使在分子水平上对其进一步分类、诊断及预后判断成为可能。2000年，Alizadeh等4首次使用基因芯片技术检测DLBCL的基因表达图谱，将肿瘤细胞依据基因表达模式的不同分为两类生发中心B细胞(germinal center B-cell)和活化的外周血B细胞(activated B-cell)。由此将DLBCL分成两型，I型显示生发中心B细胞表达标记，即GCB-DLBCL ；11型显示活化的外周血B细胞表达标记，即ABC-DLBCL。随后，Rosenwald等人在240例的大样本研究中证实了上述结果5，并且提出了第三类肿瘤细胞的起源，此类肿瘤并不高表达上述两种细胞的特征基因，将此型命名为第三型DLBCL，即Type3-DLBCL。但这部分患者是否是独立的一型DLBCL还存在争议，有待进ー步的研究证明。国内外众多的研究结果证实，DLBCL分子亚型是独立于IPI的预后评价指标，针对各个亚型CHOP联合化疗方案的疗效各不相同4^。生存分析显示ABC和GCB五年生存率分别为31%和59%，GCB型生存率明显好于ABC型。第三型预后情况与ABC型相似。参照DLBCL基因表达谱分型的结果，一些研究组利用组织芯片(TM)以及免疫组化(IHC)等方法区分DLBCL亚型.其中具有代表性的有Hans模型、Muris模型和Amen等人提出的分类模型尽管，研究证实基因表达谱是鉴别DLBCL分子异质性的有效工具，基于基因表达模式的DLBCL分子亚型是独立于IPI的预后评价指标。但是，应用基因芯片检测成百上千个基因的成本非常昂贵，且对标本质量要求也较高，无法广泛应用于临床常规实验室。而TM和IHC方法虽然在蛋白表达水平可获得部分与基因表达谱相似的信息，但机体内的蛋白表达水平与基因表达水平经常不一致，使得基于免疫表型分型的结果和基因表达谱分型结果并不完全吻合。上述因素限制了 DLBCL分子分型的研究成果向临床的转化。近10年来，尽管科学家们作出了不懈的努力，DLBCL临床治疗仍然迫切需要可简便、有效地用于DLBCL分子分型、预后判断和治疗方案选择的分子标记物。与本发明有关的现有技术有LA clinical evaluation of the International Lymphoma Study Groupclassification of non-Hodgkin’s lymphoma. The Non-Hodgkinis LymphomaClassification Project. Blood 1997;89:3909-18.2. Sabattini E，Bacci F，Sagramoso C，Pileri SA. WHO classification oftumours of haematopoietic and lymphoid tissues in2008: an overview. Pathologica2010;102:83-7.3. A predictive model for aggressive non-Hodgkin’ s lymphoma. TheInternational Non-Hodgkin’s Lymphoma Prognostic Factors Project. N Engl J Med1993;329:987-94.4.Alizadeh AA，Eisen MB,Davis RE，et al. Distinct types of diffuselarge B—cell lymphoma identified by gene expression profiling.Nature2000;403:503-11.5. Rosenwald A, Wright G，Chan WCj et al. The use of molecular profiling topredict survival after chemotherapy for diffuse large—B—cell lymphoma. N Engl JMed 2002;346:1937-47.6. Wright G，Tan Bj Rosenwald A, Hurt EHj Wiestner A，Staudt LM. A geneexpression-based method to diagnose clinically distinct subgroups of diffuselarge B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci USA 2003;100:9991-6.7. Hans CP, Weisenburger DD，Greiner TC，et al. Confirmation ofthe molecular classification of diffuse large B—cell lymphoma byimmunohistochemistry using a tissue microarray. Blood 2004;103:275-82.8. Muris JJ，Meijer CJj Vos W, et al. Immunohistochemical profiling basedon Bcl-2, CDlO and MUMl expression improves risk stratification in patients withprimary nodal diffuse large B cell lymphoma. J Pathol 2006;208:714-23.9.Amen F, Horncastle Dj Elderfield Kj et al.Absence of cyclin-D2andBcl-2expression within the germinal centre type of diffuse large B—celllymphoma identifies a very good prognostic subgroup of patients. Histopathology2007;51:70-9.10. Lenz G, Wright G，Dave SS，et al. Stromal gene signatures inlarge-B-cell lymphomas. N Engl J Med 2008;359:2313-23.
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)分子亚型的方法和试剂盒，可应用于DLBCL分子分型。本发明的另一目的在于为DLBCL临床治疗方案的选择以及预后效果的评估比较提供临床指导。在本发明的ー个方面，提供了ー种弥漫性大B细胞淋巴瘤的分子标记物的检测方法，包括以下步骤I)将与分子标记物特异性结合的生物大分子和取自DLBCL患者的生物学样品接触，所述分子标记物包括UMDl或者MYBLl ； 2)測定所述分子标记物在生物学样品中的表达水平；在此基础上，进一歩，可进行DLBCL分子分型3)通过比较UMDl和MYBLl的表达水平，计算UMDl =MYBLl指标，并以此判断DLBCL患者的分子亚型若MYBLl的表达高于UMDl的表达(UMDl :MYBL1〈1 )，则表明为GCB型；若UMDl的表达高于MYBLl的表达(UMDl :MYBL1>1)，则表明为非GCB型。本发明还提供了一种检测DLBCL分子亚型的试剂盒，该试剂盒中的生物大分子各自特异性结合一组分子标记物中至少ー种成员，所述分子标记物包括LMDl和MYBL1。所述试剂盒中的生物大分子可以是核酸、寡核苷酸链、PCR引物组或者抗体。上述试剂盒的使用方法包括以下步骤I)将DLBCL患者的生物学样品与各自特异性结合一组分子标记物中一种成员的生物大分子接触，所述分子标记物包括基因LMDl (GenBank_ID:NM_014240, SEQ_ID N01,编码 SEQ_ID N02)和 MYBLl (GenBank_ID:NM_001080416, SEQ_ID N03,编码 SEQ_ID N04)；2)測定所述标记物在该生物学样品中表达水平；3)比较基因UMDl和MYBLl的表达水平，计算UMDl =MYBLl指标。所述试剂盒检测的表达水平可以是mRNA表达水平或者蛋白质表达水平，或者这两者的结合。所述试剂盒检测手段可以通过实时定量逆转录聚合酶链式反应；也可以通过寡核苷酸杂交；也可以采用免疫组织化学或组织芯片的方法。仅作为本发明上述步骤的例子，针对来自活检的肿瘤组织，利用实时定量逆转录聚合酶链式反应，判断DLBCL分子亚型的方法，包含以下步骤I)获取DLBCL患者离体的新鲜的肿瘤组织样本；2)以实时定量逆转录聚合酶链式反应检测该样本中LIMDl和MYBLl基因的表达；3)比较步骤2)中检测得到的UMDl和MYBLl的基因表达水平，计算UMDl =MYBLl指标，并以此判断DLBCL患者的分子亚型若MYBLl的表达高于UMDl的表达(UMD1 MYBLKl)，则表明为GCB型；若UMDl的表达高于MYBLl的表达(UMD1 :MYBL1>1 )，则表明为非GCB型。在本发明的另一方面，还提供了ー种上述试剂盒的应用，用于对DLBCL患者进行预后评价。所述预后是对长期死亡率高或低的风险评估。若试剂盒的检测结果是MYBLl的表达高于UMDl的表达，则表明患者为GCB型，预后较好；若试剂盒的检测结果是UMDl的表达高于MYBLl的表达时，则表明患者为非GCB型，预后较差。在本发明的另一方面，还提供了一种上述试剂盒的应用，用于指导医生对DLBCL患者选择适宜的治疗方案。当试剂盒的检测结果是MYBLl的表达高于LIMDl的表达，则表明患者为GCB型，预后较好，可采用CHOP方案治疗。若患者经济条件允许，建议采用R-CHOP方案治疗；当试剂盒的检测结果是LIMDl的表达高于MYBLl的表达，则表明患者为非GCB型，预后较差，建议首选R-CHOP方案治疗。上述治疗方案的选择，是因为已有的研究证实利妥昔单抗(Rituximab)联合化疗(R-CH0P方案)可以显著地提高GCB型和非GCB型患者的疗效。但是利妥昔单抗价格昂贵，每个疗程治疗费用为10-15万元，对于国内大部分患者来说是沉重经济负担，因此对于部分GCB型患者，出于节约医疗开支的考量可选用CHOP方案治疗。若患者经济条件允许，进一步建议采用R-CHOP方案治疗。而对于ABC型患者，则首选R-CHOP方案治疗。
本发明提供了一种检测DLBCL分子亚型的方法和试剂盒。通过检测和分析UMDl和MYBLl基因的表达来对患者进行分子分型，进一步为临床治疗方案的选择以及预后效果的评估比较提供临床指导。本发明创造性的提出将UMDl和MYBLl两种基因作为检测标的，通过比较两种基因表达水平的来判断DLBCL的分子亚型。本发明解决了通过基因芯片进行DLBCL分型过程中对标本要求高、检测基因数目多、操作复杂、成本高的问题。使用基因芯片的检测费用为每例患者7000-9000元，而使用本发明所述的检测试剂盒每例患者仅需200-300元，费用明显降低，且检测效果相似、重复性好。因此，本发明满足了临床应用的基本条件，具有可观的应用前景。
图I显示了 UMDl基因在接受CHOP类治疗方案的74例ABC型患者中高表达，在76例GCB型患者中低表达，具有统计学差异，t检验P < O. 01。图2显示了 MYBLl基因在接受CHOP类治疗方案的74例ABC型患者中低表达，在76例GCB型患者中高表达，具有统计学差异，t检验P < O. 01。图3显示了 UMDl =MYBLl指标关于ABC-和GCB-DLBCL判别模型的ROC曲线。图4是基于UMDl =MYBLl指标对150例接受CHOP类治疗方案患者预后分型的Kaplan-Meier生存分析结果。图5显示了 UMDl基因在接受R-CHOP治疗方案的93例ABC型患者中高表达，在107例GCB型患者中低表达，具有统计学差异，t检验P < 0. 01。图6显示了 MYBLl基因在接受R-CHOP治疗方案的93例ABC型患者中低表达，在107例GCB型患者中高表达，具有统计学差异，t检验P < 0. 01。图7是基于LIMDl =MYBLl指标对200例接受R-CHOP治疗方案患者预后分型的Kaplan-Meier生存分析结果。图8是基于UMDl =MYBLl指标对64例Type3_DLBCL患者预后分型的Kaplan-Meier生存分析结果。
具体实施例方式通过以下实施例详细说明本发明的应用，但不以任何形式限制本发明。样本收集及处理本发明采用了大样本量的DLBCL患者数据及其生物学样品信息，包含了来自北美和欧洲地区10所单位共计414例DLBCL患者的离体的肿瘤标本和 回顾性临床资料。所有肿瘤标本均为淋巴结活检标本，取自确诊的DLBCL患者。其中有181例接受了以CHOP方案为基础的治疗(环磷酰胺，阿霉素，长春新碱，强的松)；233例接受了利妥昔单抗联合CHOP(R-CHOP)的治疗方案。DLBCL的诊断由一组专长淋巴瘤的资深病理医师结合组织病理学和免疫表型进行确认。离体的新鲜组织标本经Trizol处理提取总RNA，纯化后检测RNA的纯度并定量。使用AfTymetrix one-cycle cDNA合成试剂盒ー步法合成cDNA,再合成cRNA并在合成过程中标记。cRNA片段化后与基因表达谱芯片杂交16个小吋。接着洗脱芯片、扫描。扫描后所得原始数据，采用GCOS软件分析后得到单张芯片的数据。通过RMA(RobustMultichip Average)算法对所有的芯片数据进行背景校正,均一化处理和信号归纳。随后，将预处理后的芯片数据输入统计分析软件进行后续的处理。參照基因芯片表达谱分型的金标准，167例诊断为ABC型，183例诊断为GCB型，其余的64例归为第三型。实施例I. LIMDl =MYBLl指标在接受CHOP类化疗方案的DLBCL患者中的应用本实施例中，发明人运用生物信息学技术提取了 UMDl和MYBLl基因在74例ABC型和76例GCB型接受CHOP类治疗方案的患者中的表达水平。UMDl基因在ABC型患者中高表达，在GCB型患者中低表达，具有统计学差异，t检验P < 0.01 (图I)。相应地，MYBLl基因在ABC型患者中低表达，在GCB型患者中高表达，同样具有统计学差异，t检验P<0. 01(图2)。进ー步计算UMDl和MYBLl表达量的比值(UMDl =MYBLl指标)，并将其与基因芯片表达谱分型的金标准相比较，得到UMDl =MYBLl指标的ROC曲线(图3)。由图3可见，LIMDl :MYBL1指标ROC曲线的AUC为0. 95，显示该指标具有良好的分类性能。并且在UMDl MYBLl=I附近，分类准确率达到最大值85%。因此，选择将LMDl :MYBL1=1设置为判断DLBCL患者分子亚型的分割值。若MYBLl的表达高于UMDl的表达(UMDl :MYBL1〈1 )，提示该患者为GCB型；若UMDl的表达高于MYBLl的表达(UMDl :MYBL1>1 )，提示该患者为ABC型。采用Kaplan-Meier方法分析UMDl =MYBLl指标与DLBCL预后的关系。结果证实UMDl MYBLl指标与患者预后显著相关，P=O. 03 (图4)。在所有患者中，GCB型5年生存率为57%，ABC型5年生存率为38% ；GCB型的中位生存时间为6. 9年明显长于ABC型的中位生存时间(2. 5 年)。实施例2. LIMDl =MYBLl指标在接受R-CHOP类化疗方案的DLBCL患者中的应用已有的研究证实R-CHOP方案可以同时显著地提高GCB型和非GCB型患者的疗效。本实施例中，发明人运用生物信息学技术提取了 LMDl和MYBLl基因在93例ABC型和107例GCB型接受R-CHOP的治疗方案的患者中的表达水平。UMDl基因在ABC型患者中表达上调，在GCB型患者中表达下调，具有统计学差异，t检验P < 0.01 (图5);MYBL1基因在ABC型患者中表达下调，在GCB型患者中表达上调，同样具有统计学差异，t检验P <0.01 (图6)。比较UMDl和MYBLl表达水平，若MYBLl的表达高于UMDl的表达(UMD1 MYBL1<1),提示该患者为GCB型；若UMDl的表达高于MYBLl的表达(UMDl :MYBL1>1 )，提示该患者为ABC型。采用Kaplan-Meier方法分析UMDl =MYBLl指标与DLBCL预后的关系。结果证实LIMDl :MYBL1指标与患者的预后显著相关，P < 0.01 (图7)。在所有患者中，GCB型5年生存率为77%，ABC型5年生存率为55% ；GCB型平均生存时间8. 3年明显优于ABC型3. 6年平均生存时间。本实施例的结果证实，UMDl =MYBLl指标不仅适用于接受传统CHOP类治疗方案的患者，对于接受R-CHOP治疗方案的患者具有同样的指导意义。实施例3. LIMDl =MYBLl预后指标在Type3_DLBCL患者中的应用Type3-DLBCL并不特异表达生发中心B细胞和活化的外周血B细胞的特征基因，因此既不属于GCB型，也不属于ABC型。有学者将第三型和ABC型统称为非GCB型。基因芯片表达谱分型的方法并不能对这一类DLBCL作出有效地分类。在本实施例中，将64例Type3-DLBCL患者作为一个独立的研究队列，评估UMDl =MYBLl指标在这类患者中的效用。在所有患者中，31例接受CHOP类治疗方案，33例接受R-CHOP治疗方案。发明人运用生物信息学技术比较LMDl和MYBLl基因的表达水平，得到UMDl =MYBLl指标。若UMDl MYBLKl时，患者被分入低危组(类似GCB型)；当LIMDl =MYBLl > I时，患者被分入高危组 (类似ABC型)。采用Kaplan-Meier方法分析LMDl :MYBL1指标与预后的关系，证实UMDl MYBLl指标与患者的预后显著相关，P < O. 01(图8)。在所有患者中，低危组患者5年生存率为86%，高危组患者5年生存率仅为44% ;低危组患者的平均生存时间为10. 9年，明显优于高危组患者5. 7年的平均生存时间。进一步运用Cox’s风险比例回归模型对UMDl =MYBLl指标和治疗方案(CHOP vs. R-CHOP)建模。在排除了治疗方案的影响后，LIMDl :MYBL1预后指标的危害比(Hazards Ratio)为 4· 9 (95%CI :1. 4-16. 5，P < O. 01)，显示 LIMDl MYBLl指标分类的高危组患者死亡危险度较低危组患者高4. 9倍。本实施例的结果证实，LIMDl MYBLl指标不仅适用于ABC型和GCB型患者，在基因表达谱分型无法有效判断的第三型患者中也同样适用。因此，LIMDl =MYBLl指标对所有分子亚型的DLBCL具有普遍的指导意义。以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
权利要求
1.一种弥漫性大B细胞淋巴瘤的分子标记物的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 1)将与分子标记物特异性结合的生物大分子和取自弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的生物学样品接触，所述分子标记物包括基因LIMDl或者MYBLl ； 2)测定所述分子标记物在该生物学样品中的表达水平。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述生物大分子是核酸或者抗体。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述生物大分子是寡核苷酸。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述生物大分子是PCR引物组。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述生物学样品是离体的肿瘤组织，或者是血液样品。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述表达水平是mRNA表达水平或者蛋白质表达水平，或者这两者的结合。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的测定是定量rtPCR。
8.如权利要求I所述的方法，其特征在于，采用抗体结合试验测定所述表达水平。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗体结合试验是ELISA。
10.权利要求I所述方法的应用，其特征在于，利用该方法评估弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的预后；比较LMDl和MYBLl的表达水平，当MYBLl的表达高于UMDl的表达时，为预后良好；当LIMDl的表达高于MYBLl的表达时，为预后不良。
11.一种检测检测弥漫性大B细胞淋巴瘤L分子亚型的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含生物大分子各自特异性结合一组分子标记物中至少一种成员，所述分子标记物包括LIMDl 和 MYBLl。
12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述生物大分子是核酸、寡核苷酸链、PCR引物组或者抗体。
13.权利要求11所述的试剂盒在制备评价弥漫性大B细胞淋巴瘤预后的制剂中的用途。
14.权利要求11所述的试剂盒在制备制定弥漫性大B细胞淋巴瘤治疗方案中的用途。
全文摘要
本发明属生物学和医学检验领域，涉及弥漫性大B细胞淋巴瘤的分子分型标记物、检测方法及该检测方法涉及的试剂盒。本发明首先提供了一种弥漫性大B细胞淋巴瘤分子标记物的检测方法，该方法包括以下步骤1)将与分子标记物特异性结合的生物大分子和取自弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的生物学样品接触；2)测定所述分子标记物在该生物学样品中的表达水平；3)根据分子标记物的检测结果建立判断模型。本发明还提供了上述方法在弥漫性大B细胞淋巴瘤分子分型中的应用及相应的试剂盒。本发明提供的方法可用于判断弥漫性大B细胞淋巴瘤的分子亚型，评估患者预后，为早期干预治疗及实施个体化治疗提供依据。
文档编号C12Q1/68GK102808019SQ20121017707
公开日2012年12月5日 申请日期2012年5月31日 优先权日2011年6月3日
发明者杜祥, 徐清华, 周晓燕, 倪淑娟, 谭聪 申请人:复旦大学附属肿瘤医院