专利名称：同时快速检测食品中活的鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌的方法
技术领域：
本发明属于微生物检测领域，尤其涉及一种同时快速检测食品中活的鼠伤寒沙门氏菌、こ型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌菌的方法。
背景技术：
沙门氏菌属是革兰氏阴性、兼性厌氧的无芽孢菌。更具目前的分类，沙门氏菌属只包含两个种邦戈尔沙门氏菌和肠道沙门氏菌，其中后者包含有2500多种血清型，也是感染人和动物最多的。在众多的血清型中，鼠伤寒沙门氏菌是引起人体食源性致病菌中毒和胃肠炎的ー种重要的致病菌，主要流行在发展中国家，并且对于免疫缺陷性个体而言，如果感染该致病菌而未及时治疗则有可能致命。伤寒和副伤寒沙门氏菌主要引起人体的伤寒热和副伤寒热，尽管它们已不再发达国家流行，但是在发展中国家，例如亚洲和非洲北部地区，这些致病菌仍然还在引发严重的疾病。据估计，在全世界，毎年有22000万的沙门氏菌感染，其中死亡人数为20万。在南亚地区约有四分之一的肠热症是有副伤寒沙门氏菌引起。沙门氏菌主要感染居住环境拥挤，食物和饮水不卫生的人群，其中使用受污染的食物是组成沙门氏菌感染的主要途径，大约有95%的感染是有食用受污染的食物引起的。目前现存的检测该沙门氏菌的方法主要是通过传统的培养方法。如(杨瑞军，生肉食品中致病菌检测结果分析[J]中国卫生检验杂志.2009:19 (9)2122-2125)，传统方法具有劳动强度高、耗时、费用高等缺点。因此需要更快速检测3种致病菌的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单、快速、特异性强、灵敏度高的能同时检测活的鼠伤寒沙门氏菌、こ型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌菌的方法。该方法可用于食品样本中活的鼠伤寒沙门氏菌、こ型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌菌的初筛检测，其操作简便、结果客观准确，避免了现有方法操作繁琐、费时费力、成本高昂的缺点。本发明是通过以下技术方案实现的，
本发明涉及ー种叠氮溴化丙锭处理结合多重PCR同时快速检测食品中活的鼠伤寒沙门氏菌、こ型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌菌的方法，包括如下步骤
(1)取食物样本，加缓冲液碾磨制成匀浆液，离心去除加大的食物残渣，取上清得菌悬液，整过程均为无菌操作；
(2)取制备好的菌悬液加叠氮溴化丙啶(PMA)溶液，使PMA的终质量浓度为3μ g/mL,混勻后室温避光培养3_8min (优选为5min),齒素灯曝光,光照交联时样品置于冰上,交联后的悬浮液离心，所得沉淀用沸水浴法提取DNA ；
(3)所得DNA进行mPCR，体系包含总共10μI反应液，其中，4 μ I制备的模板DNA溶液，2 μ I 5Xbuffer，每条引物的量是15 pmol，lU Taq DNA聚合酶；反应条件是95°C 10min，接着 94°C 30 s’ 50°C 30 s，72°C I min 40 个循环，最后 72°C 延伸 10 min ；(4)mPCR反应结束后，进行目的菌检测分析。步骤(I)所述的缓冲液为PBS磷酸盐缓冲液。步骤(3)所述引物分别为从5’ -3’为 fIiC-Y:TGCGCTGAATGAAATCAACAAC /7iC-R:TAGAAACCGTACCATTACCGTC
Hat-F:ACTCAGGCTTCCCGTAACGCHat-R:GCTTCATACAGACCATCTTTAGTTGstgk-V:TGCCAGGTTACGCCACAAACC5tgk-R:CGCTGTGGTATCAATCGTGC
步骤(4)所述目的菌检测分析为用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，若有636 bp条带，则说明有鼠伤寒沙门氏菌，若有551 bp条带，则说明有こ型副伤寒沙门氏菌，若有354bp条带，则说明有伤寒沙门氏菌菌。·
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与现有技术相比，本发明有如下有益效果
I、能同时检测鼠伤寒沙门氏菌、こ型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌菌，速度快，可以在4小时内得到結果。2、只检测具有致病性的活菌，效率更高。3、本发明设计的特异性引物，采用特定反应条件，灵敏度高。可同时、高效地检测出该3种目的菌，操作简便，结果判定简单，降低了检测成本。
图I多重PCR同时检测鼠伤寒沙门氏菌、こ型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌菌电泳結果。M:DL1000 DNA Marker ; I :多重PCR同时检测鼠伤寒沙门氏菌、こ型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌菌；2 :多重PCR同时检测鼠伤寒沙门氏菌、こ型副伤寒沙门氏菌；4 :多重PCR同时检测伤寒沙门氏菌菌、こ型副伤寒沙门氏菌；5 :多重PCR单ー检测鼠伤寒沙门氏菌；6 :多重PCR单ー检测こ型副伤寒沙门氏菌；7 :多重PCR单ー检测伤寒沙门氏菌菌。图2 PMA去除死菌的干扰。(A)PMA处理组合方式；(B)多重PCR检测結果。各组中鼠伤寒沙门氏菌、こ型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌菌的浓度为106 CFU/mL。图3多重PCR同时检测鼠伤寒沙门氏菌、こ型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌菌的特异性。图4多重PCR同时检测鼠伤寒沙门氏菌、こ型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌菌的最低检测线。(a)鼠伤寒沙门氏菌(泳道1-7，4·3Χ106到4. 3 X IO1 CFU/ml), (b)こ型副伤寒沙门氏菌(泳道ト7，3. 7X IO6到3· 7X IO1 CFU/ml)，(c)伤寒沙门氏菌菌(泳道1-7,7. 2 X IO6 到 7. 2 X IO1 CFU/ml)。
具体实施方案下面结合具体实施例，进ー步阐释本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件是实验方法，通常按照常规条件中的条件，活按照制造厂商的建议条件，实施例中涉及的菌株均属于现有技术，本领域的技术人员可很容易地从公开是商业渠道获得。实施例步骤I，食物样本预处理
称取I g的食物样本，加入9ml的PBS，碾磨制成匀浆液，900 g离心5 min，去除加大的食物残渣，取上清(该过程必须无菌操作)。步骤2，PMA处理
PMA溶解于ニ甲亚砜(DMS0)中，配制成O. 5 mg/mL的PMA溶液，_20°C避光保存。取500 μ L制备好的菌悬液置于I. 5 mL微量离心管中，加入3 μ L O. 5 mg/mL的PMA溶液，使PMA的终质量浓度为3 μ g/mL ；PMA与菌悬液混合均匀后在室温条件下避光培养5 min,利用500 W的卤素灯曝光5 min，光照交联时样品置于冰上(避免过热)，且在距光源20 cm处，交联后的悬浮液于10000 g离心5 min,所得沉淀用于DNA的提取。步骤3，基因组DNA的提取
经步骤2获得的样品在10000 g,4°e条件下离心5 min,弃上清,并小心吸走残余液体，加入30 μ I无菌的去离子水100°C煮沸10 min,待冷却后12000 g，4 oC条件下离心5 min,取上清作为mPCR反应模板，制备的模板应立即用于检測。步骤4，选取靶点及设计引物
多重PCR之所以难做，问题的关键是多个靶点扩增条件不兼容。每个靶点都需要两边的引物同时配合。因此，本发明分别选取鼠伤寒沙门氏菌、こ型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌菌特异性基因，采用01igo7软件设计多重PCR引物，调整各对引物之间的退火温度，并调节引物对之间的扩增配合程度，使各对引物的退火温度尽量一致，扩增速度尽量相等。并通过实验来验证多重PCR的扩增效果，选取条件最优的引物对来作为下面检测用引物(表
I)。并采用表2提供的菌株进行引物特异性验证，菌株的编号和来源见表2。表2供试菌株及检测结果
权利要求
1.一种同时快速检测食品中活的鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌的方法，其特征在于包含下列步骤 (I)取食物样本，加缓冲液碾磨制成匀浆液，离心去除加大的食物残渣，取上清得菌悬液，整过程均为无菌操作； (2)取制备好的菌悬液加叠氮溴化丙啶溶液，使叠氮溴化丙啶PMA的终质量浓度为3μ g/mL,混勻后室温避光培养3_8min,齒素灯曝光,光照交联时样品置于冰上,交联后的悬浮液离心，所得沉淀用沸水浴法提取DNA ； (3)所得DNA进行mPCR，体系包含总共IOyI反应液，其中，4 μ I制备的模板DNA溶液，2 μ I 5Xbuffer，每条引物的量是15 pmol，lU Taq DNA聚合酶；反应条件是95°C 10min，接着 40 个循环(94°C 30 s’ 50V 30 s，72°C I min)，最后 72°C 延伸 10 min ； (4)mPCR反应结束后，进行目的菌检测分析。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(I)所述的缓冲液为PBS磷酸盐缓冲液。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(2)混匀后室温避光培养5min。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(3)所述引物分别为从5’-3’为 fIiC-Y:TGCGCTGAATGAAATCAACAAC/7iC-R:TAGAAACCGTACCATTACCGTCHat-F:ACTCAGGCTTCCCGTAACGCHat-R:GCTTCATACAGACCATCTTTAGTTGstgk-V:TGCCAGGTTACGCCACAAACC5 tgk-R:CGCTGTGGTATCAATCGTGC。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(4)所述目的菌检测分析为用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，若有636 bp条带，则说明有鼠伤寒沙门氏菌，若有551 bp条带，则说明有乙型副伤寒沙门氏菌，若有354 bp条带，则说明有伤寒沙门氏菌菌。
全文摘要
本发明属于微生物检测领域，公开了一种同时快速检测食品中活的鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌菌的方法。针对鼠伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌菌设计特异性引物，采用叠氮溴化丙锭处理处理取出死菌的干扰，最终提取DNA做多重PCR检测。本方法和经典的细菌分离、鉴定和血清学分型方法相比更快速、准确。
文档编号C12Q1/68GK102676684SQ201210177199
公开日2012年9月19日 申请日期2012年6月1日 优先权日2012年6月1日
发明者万翠香, 徐锋, 杨友均, 熊勇华, 许恒毅, 赖卫华, 魏华 申请人:南昌大学