专利名称：一种嗜热链球菌增菌培养基及其制备方法
技术领域：
本发明属于益生菌培养技术领域，涉及ー种嗜热链球菌增菌培养基及其制备方法。
背景技术：
近几年我国乳品エ业发展速度较快，酸奶及发酵乳饮料的发展居乳制品产业之首。平均年增长速度达15%以上，而且在今后很长一段时间内仍会保持这ー增长速度。同时随着社会的发展和人们生活水平的提高，对酸奶发酵剂的品质有了更高的要求。 传统发酵剂一般需要对菌种进行扩大培养，周期长、接种量大、操作繁琐、菌种容易污染、退化或变异，质量不易控制，而且发酵剂活菌数低等(IO7-IO8CfuAiL)。而直投式乳酸菌发酵剂不需对菌种活化、扩大繁殖过程而直接应用于生产。其主要优点是活菌含量高、接种量小、生产成本较低、保藏期长、携帯方便，可直接用于发酵制品的生产，減少扩大培养的复杂操作エ序，从而简化产品的生产エ艺。有利于保持产品质量的稳定，防止菌种的退化、变异和污染。因此，直投式乳酸菌发酵剂满足了生产的迫切需要，成为乳酸菌发酵剂研究的主要方向，具有非常好的经济价值和不可估量的应用前景。靳亚平等对培养嗜热链球菌的7种基础培养基进行筛选，确定为乳酸菌培养基。然后优化培养条件起始PH值为6. 8，发酵温度为42V。得出最佳乳酸菌培养基葡萄糖IOg,酵母膏 7. 5g,蛋白胨 7. 5g, KH2P042g,番茄汁 IOOmL,吐温-800. 5mL,蒸馏水 900mL, 2%乳清。田洪涛等研究了在MRS基础培养基中添加不同营养物质对嗜热链球菌生长的影响，最后增殖培养基的最佳配比为在MRS培养基中添加0. 3%玉米浆、7. 5%番茄汁、5. 0%啤酒液、1.0%乳糖；试验菌株在増殖培养基中经37°C培养24h。吕嘉枥等研究了嗜热链球菌在脱脂乳培养基中，添加生长因子后的增菌效果。实验结果表明，6%黄豆芽汁，6. 7%胡萝卜汁，2%香菇汁，2. 5%醪糟，20%信阳毛尖茶汁，5%啤酒，5%麦芽汁均可作为嗜热链球菌的单因子最佳促生长剂。李用芳等试验了嗜热链球菌在几种不同的基础培养基的生长情況，结果表明嗜热链球菌的最佳生长培养基为番茄汁培养基I和牛乳琼脂培养基，番茄汁琼脂培养基I配方为葡萄糖10g，酵母膏10g，番茄汁400ml，盐液A5ml，盐液B5ml，蒸馏水600ml，琼脂20g，pH6. 0.牛乳琼脂培养基①脱脂奶粉100g，蒸馏水1000ml，0. IOOMPa灭菌IOmin0②琼脂25-30g,水50ml，酵母膏2. 5g，蒸馏水300ml，0. IOOMPa灭菌20min。①和②分开灭菌后混匀倒平板。李莹等研究了蔬菜汁培养基的组成(蔬菜汁、碳源、氮源)对嗜热链球菌生长的影响，优化了蔬菜汁培养基的组成。结果表明用于嗜热链球菌生长的最优的蔬菜汁组分为番茄汁10%、豆浆2%、乳糖2%。专利CN1844353A公布了一种廉价的嗜热链球菌菊芋汁增菌培养基，它是以菊芋汁作为主要培养基成分。益生元(Prebiotics)是指那些“人体不消化或难消化的成份(如低聚糖由2-10个单糖组成的糖类，由于其聚合度低，所以称作低聚糖)，这些成份可选择性的刺激结肠生理活性益生菌的活性，从而产生对宿主的健康效应”。具有益生元功能的物质主要是ー些非消化性低聚糖，如低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚半乳糖，低聚木糖，大豆低聚糖，水苏糖，棉籽糖，菊糖，甘露低聚糖，低聚壳聚糖等。低聚木糖又称木寡糖，是由2-7个木糖分子以￠-1, 4糖苷键结合而成的功能性聚合糖。促进益生菌增殖的同时产生多种有机酸。降低肠道PH值，抑制有害菌生长，使益生菌在肠道大量増殖。低聚异麦芽糖(Isomaltose)是由两个葡萄糖分子以a -I, 6糖苷键连接起来的双糖聚合而成，能有效的促进人体内有益细菌-双歧杆菌的生长繁殖，而且其耐热、耐酸性极佳。大豆低聚糖(SoybeanOligosaccharide)是大豆中可溶性糖的总称,主要成分是水苏糖、棉子糖和鹿糖等。大豆低聚糖能促进人体肠道内固有的有益细菌一双歧杆菌的増殖、改善人体免疫力、延缓衰老等，是近年来受到重视的功能性低聚糖，它可广泛用于保健食品和化妆品中。
发明内容
本发明解决的问题在于提供ー种嗜热链球菌增菌培养基及其制备方法，该培养基是ー种适合嗜热链球菌大量生长的增殖培养基，可应用于高效浓缩型直投式发酵剂的エ业化大規模生产。 本发明是通过以下技术方案来实现ー种嗜热链球菌增菌培养基,包括葡萄糖0. 8 I. 2g,酵母膏0. 5 I. Og,大豆蛋白胨0. 5 I. Og,番爺汁8 12mL,低聚木糖0. 2 0. 4g,低聚异麦芽糖0. 2 0. 4g,大豆低聚糖 0. 2 0. 4g,水 88 92mL, KH2PO4O. I 0. 2g 和吐温 800. 01 0. 05mL, pH 值 7. 0
7.2。所述的番茄汁是将番茄洗浄后，热烫软化、去皮破碎，然后加水打浆，煮沸后冷却，过滤，得到番茄汁。所述的大豆低聚糖是将脱脂大豆粉的こ醇提取液用酸沉淀去除蛋白，得到大豆低聚糖提取液，再经过脱色、脱盐处理后得到大豆低聚糖。ー种嗜热链球菌增菌培养基的制备方法，包括以下步骤I)番茄汁的制备取新鲜番茄用清水洗浄，经过热烫软化、去皮破碎，加水打浆，然后煮沸10 30min,冷却后过滤,得到番爺汁；2 )大豆低聚糖的提取大豆粉经石油醚脱脂后得到脱脂大豆粉，然后将脱脂大豆粉用体积分数60 80%こ醇，在90 100°C索式提取器中提取150 200min，分离得到提取液后用饱和醋酸铅溶液沉淀蛋白；沉淀完全后，调pH值至中性，加入草酸除去过量的铅离子，过滤除去沉淀，滤液用NaOH调至中性，得到大豆低聚糖提取液；在大豆低聚糖提取液中加入活性炭于45 60°C脱色20 40min，分离得到脱色液后再上样于离子交換树脂进行脱盐处理，洗脱后收集得到大豆低聚糖；3)低聚糖浓溶液的制备将低聚木糖、大豆低聚糖和低聚异麦芽糖分别配制成质量分数为I 5%的溶液，过滤；4)嗜热链球菌增菌培养基的制备将葡萄糖，酵母膏，大豆蛋白胨，KH2PO4，吐温80混合溶于水中，用NaOH溶液调pH至7. O 7. 2，然后经118°C，15min灭菌，最后再加入过滤的番茄汁和低聚糖溶液；上述各组份的配比为葡萄糖0. 8 I. 2g，酵母膏0. 5 I. Og,大豆蛋白胨0. 5
I.Og,番爺汁8 12mL,低聚木糖0. 2 0. 4g,低聚异麦芽糖0. 2 0. 4g,大豆低聚糖0. 2 0. 4g,水 88 92mL, KH2PO4O. I 0. 2g 和吐温 800. 01 0. 05mL。所述的番茄汁的过滤为先经过双层纱布过滤，再经12rC、20min高温灭菌的0. 2微米的膜过滤。所述的大豆低聚糖的提取为大豆粉经石油醚脱脂、除去石油醚后，得到脱脂大豆粉； 然后用体积分数60 80%こ醇，按脱脂大豆粉こ醇=Ig : 8 IOmL的料液比，在90°C索式提取器中提取150 200min，重复提取两次，合并提取液后用pH为4 5的饱和醋酸铅溶液沉淀蛋白；沉淀完全后，调pH值至中性，加入草酸除去过量的铅离子，过滤除去沉淀；滤液用0. 5mol/LNa0H调至中性，得到大豆低聚糖提取液；在大豆低聚糖提取液中加入固形物质量I. 5 2%的活性炭于45°C脱色30min，脱色液再以35m3/(m3 h)的速度流过50 60°C的732型阳离子交换树脂或717型阴离子交换树脂进行脱盐处理，将脱盐后的提取液浓缩后干燥得到大豆低聚糖。所述的低聚木糖分子式为(C5HltlO5)n, n为2_7，分子量为300-1051。低聚异麦芽糖分子式为(C5HltlO5)n, n为2-10分子量为300-2000。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明提供的嗜热链球菌增菌培养基，在常用的基础培养基上添加了番茄汁和低聚糖(包括低聚木糖、大豆低聚糖和低聚异麦芽糖)，以达到增菌的效果；而且这些成分来源方便，价格低廉，制作简单，且能够起到明显的增菌效果嗜热链球菌经活化后，以5%的接种量接入该增菌培养基中，42°C培养llh，活菌数高达(5. 9-7. 6) X108Cfu/mL以上，与相同处理的实验室常用的、价格昂贵的M17培养基的活菌数(3. 2-3. 7) X 108Cfu/mL相比，活菌数得到了提高，增菌效果显著。本发明提供的ー种嗜热链球菌增菌培养基，由于其来源方便、价格低廉、增菌效果明显，是ー种适合嗜热链球菌大量生长的增殖培养基，可应用于高效浓缩型直投式发酵剂的エ业化大規模生产。
具体实施例方式下面结合具体的实施例对本发明做进ー步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。实施例I嗜热链球菌增菌培养基组成葡萄糖0. 8g,酵母膏0. 5g,大豆蛋白胨0. 5g,番爺汁8mL，低聚木糖(C5H10O5)nO. 2g，低聚异麦芽糖(C5H10O5)nO. 2g，大豆低聚糖0. 2g，水92mL，KH2PO4O. 2g,吐温 800. 05mL, pH 值 7. O。嗜热链球菌增菌培养基的制备I)番茄汁的制备取新鲜番茄500g用清水洗浄，经过热烫软化、去皮破碎，加500mL水打浆，然后煮沸20min，冷却后，用双层纱布过滤，再经121°C，20min高温灭菌的0. 2微米的膜过滤。2)大豆低聚糖的提取市售大豆粉，经石油醚脱脂、除去溶剂后，得到脱脂大豆粉，然后用80%こ醇，按I 10的料液比，在90°C提取165min，重复提取两次，用饱和醋酸铅溶液沉淀蛋白(pH为4-5)，沉淀完全后，调pH值至中性，加入草酸除去过量的铅离子，过滤除去沉淀。滤液用0. 5mol/LNa0H调至中性，得到大豆低聚糖的提取液。在提取液中加入I. 5%的活性炭(相对固形物)于45°C脱色30min，脱色液再以35mV(m3 h)的速度流过50_60°C的732型阳离子交换树脂和717型阴离子交換树脂进行脱盐处理，最后得到产品大豆低聚糖。3)低聚糖浓溶液的制备将低聚木糖、大豆低聚糖和低聚异麦芽糖分别配制成1%的浓溶液，然后经121°C， 20min高温灭菌的0. 2微米的膜过滤。4)嗜热链球菌增菌培养基的制备将葡萄糖，酵母膏，大豆蛋白胨，KH2PO4,吐温80混合溶于水中，用ImoL/L NaOH溶液调PH至7. 0，然后经118°C，15min灭菌，最后再加入经膜过滤的番茄汁和低聚糖溶液。将嗜热链球菌经过液体M17培养基活化后，以5%的接种量接入本实施例所得的增菌培养基中，42°C培养llh，活菌数可达5. 9X 108cfu/mL，较之对照M17培养基的活菌数3. 25 X 108cfu/mL相比得到了提高。实施例2嗜热链球菌增菌培养基组成葡萄糖I. Og,酵母膏0. 8g,大豆蛋白胨0. 8g,番爺汁10mL，低聚木糖(C5HltlO5)nO. 2g，低聚异麦芽糖(C5HltlO5)nO. 2g，大豆低聚糖0. 2g，水90mL，KH2PO4O. 2g,吐温 800. 05mL, pH 值 7. I。嗜热链球菌增菌培养基的制备I)番茄汁的制备取新鲜番茄用清水洗浄，经过热烫软化、去皮破碎，加水打浆，然后煮沸24min，冷却后过滤，得到番茄汁；2)大豆低聚糖的提取大豆粉经石油醚脱脂后得到脱脂大豆粉，然后将脱脂大豆粉用体积分数70%乙醇，在95°C索式提取器中提取180min，分离得到提取液后用饱和醋酸铅溶液沉淀蛋白；沉淀完全后，调pH值至中性，加入草酸除去过量的铅离子，过滤除去沉淀，滤液用NaOH调至中性，得到大豆低聚糖提取液；在大豆低聚糖提取液中加入活性炭于50°C脱色40min，分离得到脱色液后再上样于60°C的732型阳离子交换树脂和717型阴离子交換树脂进行脱盐处理，洗脱后收集得到大豆低聚糖；3)低聚糖浓溶液的制备将低聚木糖、大豆低聚糖和低聚异麦芽糖分别配制成质量分数为2%的溶液，过滤；4)嗜热链球菌增菌培养基的制备将葡萄糖，酵母膏，大豆蛋白胨，KH2PO4，吐温80混合溶于水中，用NaOH溶液调pH至7. 1，然后经118°C，15min灭菌，最后再加入过滤的番茄汁和低聚糖溶液；
将嗜热链球菌经过液体M17培养基活化后，以5%的接种量接入本实施例所得的增菌培养基中，42°C培养llh，活菌数可达6. 6X 108cfu/mL，相比对照M17培养基的活菌数3. 44X 108cfu/mL相比得到了提高。实施例3嗜热链球菌增菌培养基组成葡萄糖I. 0g，酵母膏0. Sg，大豆蛋白胨l.Og，番茄汁IOmL,低聚木糖0. 4g，低聚异麦芽糖0. 4g，大豆低聚糖0. 4g，水90mL, KH2PO4O. 2g，吐温800. 05mL, pH 值 7. O。嗜热链球菌增菌培养基的制备I)番茄汁的制备
取新鲜番茄用清水洗浄，经过热烫软化、去皮破碎，加水打浆，然后煮沸28min，冷却后过滤，得到番茄汁；2)大豆低聚糖的提取大豆粉经石油醚脱脂后得到脱脂大豆粉，然后将脱脂大豆粉用体积分数75%乙醇，在98°C索式提取器中提取170min，分离得到提取液后用饱和醋酸铅溶液沉淀蛋白；沉淀完全后，调pH值至中性，加入草酸除去过量的铅离子，过滤除去沉淀，滤液用NaOH调至中性，得到大豆低聚糖提取液；在大豆低聚糖提取液中加入活性炭于55°C脱色35min，分离得到脱色液后再上样于732型阳离子交换树脂和717型阴离子交換树脂进行脱盐处理，洗脱后收集得到大豆低聚糖；3)低聚糖浓溶液的制备将低聚木糖、大豆低聚糖和低聚异麦芽糖分别配制成质量分数为3%的溶液，过滤；4)嗜热链球菌增菌培养基的制备将葡萄糖，酵母膏，大豆蛋白胨，KH2PO4，吐温80混合溶于水中，用NaOH溶液调pH至7. 0，然后经118°C，15min灭菌，最后再加入过滤的番茄汁和低聚糖溶液；将嗜热链球菌经过液体M17培养基活化后，以5%的接种量接入本实施例所得的增菌培养基中，42°C培养llh，活菌数可达7. IX 108cfu/mL，相比对照M17培养基的活菌数3. 58 X 108cfu/mL相比得到了提高。实施例4嗜热链球菌增菌培养基组成葡萄糖1.2g，酵母膏I. 0g，大豆蛋白胨l.Og，番茄汁12mL,低聚木糖0. 4g，低聚异麦芽糖0. 4g，大豆低聚糖0. 4g，水88mL, KH2PO4O. 2g，吐温800. 05mL, pH 值 7. O。嗜热链球菌增菌培养基的制备I)番茄汁的制备取新鲜番茄用清水洗浄，经过热烫软化、去皮破碎，加水打浆，然后煮沸30min，冷却后过滤，得到番茄汁；2)大豆低聚糖的提取大豆粉经石油醚脱脂后得到脱脂大豆粉，然后将脱脂大豆粉用体积分数65%こ醇，在100°C索式提取器中提取160min，分离得到提取液后用饱和醋酸铅溶液沉淀蛋白；
沉淀完全后，调pH值至中性，加入草酸除去过量的铅离子，过滤除去沉淀，滤液用NaOH调至中性，得到大豆低聚糖提取液；在大豆低聚糖提取液中加入活性炭于60°C脱色25min，分离得到脱色液后再上样于732型阳离子交换树脂和717型阴离子交換树脂进行脱盐处理，收集得到大豆低聚糖；3)低聚糖浓溶液的制备将低聚木糖、大豆低聚糖和低聚异麦芽糖分别配制成质量分数为5%的溶液，过滤；4)嗜热链球菌增菌培养基的制备
将葡萄糖，酵母膏，大豆蛋白胨，KH2PO4，吐温80混合溶于水中，用NaOH溶液调pH至7. 2，然后经118°C，15min灭菌，最后再加入过滤的番茄汁和低聚糖溶液；将嗜热链球菌经过液体M17培养基活化后，以5%的接种量接入本实施例所得的增菌培养基中，42 °C培养IIh，活菌数可达7. 6X IO8Cfu/mL，比对照M17培养基的活菌数3. 7 X 108cfu/mL相比得到了提高。
权利要求
1.一种嗜热链球菌增菌培养基，其特征在于，包括葡萄糖O. 8 I. 2g，酵母膏O. 5 I. Og,大豆蛋白胨O. 5 I. Og,番爺汁8 12mL，低聚木糖O. 2 O. 4g，低聚异麦芽糖O. 2 0.4g,大豆低聚糖 O. 2 O. 4g,水 88 92mL, KH2PO4O. I O. 2g 和吐温 800. 01 O. 05mL,pH 值 7. O 7. 2。
2.如权利要求I所述的嗜热链球菌增菌培养基，其特征在于，所述的番茄汁是将番茄洗净后，热烫软化、去皮破碎，然后加水打浆，煮沸后冷却，过滤，得到番茄汁。
3.如权利要求I所述的嗜热链球菌增菌培养基，其特征在于，所述的大豆低聚糖是将脱脂大豆粉的乙醇提取液用酸沉淀去除蛋白，得到大豆低聚糖提取液，再经过脱色、脱盐处理后得到大豆低聚糖。
4.一种嗜热链球菌增菌培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 O番茄汁的制备 取新鲜番茄用清水洗净，经过热烫软化、去皮破碎，加水打浆，然后煮沸10 30min，冷却后过滤，得到番茄汁； 2)大豆低聚糖的提取 大豆粉经石油醚脱脂后得到脱脂大豆粉，然后将脱脂大豆粉用体积分数60 80%乙醇，在90 100°C索式提取器中提取150 200min，分离得到提取液后用饱和醋酸铅溶液沉淀蛋白； 沉淀完全后，调PH值至中性，加入草酸除去过量的铅离子，过滤除去沉淀，滤液用NaOH调至中性，得到大豆低聚糖提取液； 在大豆低聚糖提取液中加入活性炭于45 60°C脱色20 40min，分离得到脱色液后再上样于离子交换树脂进行脱盐处理，洗脱后收集得到大豆低聚糖； 3)低聚糖浓溶液的制备 将低聚木糖、大豆低聚糖和低聚异麦芽糖分别配制成质量分数为I 5%的溶液，过滤； 4)嗜热链球菌增菌培养基的制备 将葡萄糖，酵母膏，大豆蛋白胨，KH2PO4,吐温80混合溶于水中，用NaOH溶液调pH至7.O 7. 2，然后经118°C，15min灭菌，最后再加入过滤的番茄汁和低聚糖溶液； 上述各组份的配比为葡萄糖O. 8 I. 2g，酵母膏O. 5 I. 0g，大豆蛋白胨O. 5 1.Og,番爺汁8 12mL,低聚木糖O. 2 O. 4g,低聚异麦芽糖O. 2 O. 4g,大豆低聚糖O. 2 O.4g,水 88 92mL, KH2PO4O. I O. 2g 和吐温 800. 01 O. 05mL。
5.如权利要求4所述的嗜热链球菌增菌培养基的制备方法，其特征在于，所述的番茄汁的过滤为先经过双层纱布过滤，再经121°C、20min高温灭菌的O. 2微米的膜过滤。
6.如权利要求4所述的嗜热链球菌增菌培养基的制备方法，其特征在于，所述的大豆低聚糖的提取为 大豆粉经石油醚脱脂、除去石油醚后，得到脱脂大豆粉； 然后用体积分数60 80%乙醇，按脱脂大豆粉乙醇=Ig : 8 IOmL的料液比，在90 100°C索式提取器中提取150 200min，重复提取两次，合并提取液后用pH为4 5的饱和醋酸铅溶液沉淀蛋白； 沉淀完全后，调PH值至中性，加入草酸除去过量的铅离子，过滤除去沉淀；滤液用O.5mol/LNaOH调至中性，得到大豆低聚糖提取液； 在大豆低聚糖提取液中加入固形物质量I. 5 2%的活性炭于45°C脱色30min，脱色液再以35m3/(m3 · h)的速度流过50 60°C的732型阳离子交换树脂和717型阴离子交换树脂进行脱盐处理，将脱盐后的提取液浓缩后干燥得到大豆低聚糖。
7.如权利要求4所述的嗜热链球菌增菌培养基的制备方法，其特征在于，所述的低聚木糖分子式为(C5HltlO5)n，n为2 7，分子量为300 1051 ;低聚异麦芽糖分子式为(C5HltlO5)η，η为2 10分子量为300 2000。
全文摘要
本发明公开了一种嗜热链球菌增菌培养基及其制备方法，包括葡萄糖0.8～1.2g，酵母膏0.5～1.0g，大豆蛋白胨0.5～1.0g，番茄汁8～12mL，低聚木糖0.2～0.4g，低聚异麦芽糖0.2～0.4g，大豆低聚糖0.2～0.4g，水88～92mL，KH2PO40.1～0.2g和吐温800.01～0.05mL，pH值7.0～7.2。在常用的基础培养基上添加了番茄汁和低聚糖(包括低聚木糖、大豆低聚糖和低聚异麦芽糖)，以达到增菌的效果；而且这些成分来源方便，价格低廉，制作简单，且能够起到明显的增菌效果。
文档编号C12N1/20GK102766590SQ201210235638
公开日2012年11月7日 申请日期2012年7月9日 优先权日2012年7月9日
发明者李串娜, 王勇, 舒国伟, 陈合 申请人:陕西科技大学