专利名称：猪传染性胸膜肺炎放线杆菌lamp试剂盒及使用方法
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌LAMP试剂盒及使用方法技术领域
本发明属于兽用生物制品领域中的疾病诊断技术，具体涉及一种可简单快速检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的LAMP试剂盒及使用方法。
背景技术：
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)是一种革兰氏阴性小球菌，属于巴氏杆菌科放线杆菌属。根据生长时对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(MD)的依赖性可将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌分为两个生物型，即生物I型和生物II型，其中生物I型对猪具有致病性。又根据其荚膜多糖与脂多糖的差异，可将生物I型分为15个血清型，血清I型又分为Ia和Ib两个亚型，血清5型又分为5a、5b亚型。各血清型间的交叉保护力不强，其中1、4和6型间及3、6和8型间有交叉反应，可能这些血清型间存在着相似的细胞结构。生物I型菌株具有外毒素、内毒素、细胞毒性毒素及溶血活性毒素，除此之外，荚膜多糖、脂多糖、通透因子等也与本菌的致病性有关，但溶血活性毒素在致病性上发挥着更重要的作用。值得一提的是，不同血消的菌株的重要特性如致病毒素产量不相同，产生毒素种类也有差异，由于以上原因不同菌株对猪的致病力也不同。一般来说，血清型1、5、9、10 及11比其他血清型毒力强，也常见于暴发严重、死亡率高和肺脏病变严重的病倒，而血清3 型和6型的致病性则被认为很低。
自从1957年Pattison等第一次报道猪传染性胸膜肺炎起，世界大部分国家和地区如美国、英国、加拿大、意大利、法国、丹麦等多数养猪业发达的国家也相继报道了本病的发生和流行。由于其造成的严重损失，现已成为世界性工业化养猪的五大疫病之一。近年来随着生猪的跨国运输及我国养猪业的发展，在1987年哈尔滨兽医研究所发现本病的临诊病例，证明了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌在我国存在和流行。随着国内养猪业规模的逐渐扩大，，加之缺乏严格有效的兽医卫生管理制度，自2000年以来，猪传染性胸膜肺炎在我国多处出现爆发性流行，给我国的养猪业带来了惨重的经济损失。我国幅员辽阔，各地流行的血清型有所差异，各地的饲养管理水平和环境条件差异较大，所以本病的导致的临床症状和病理变化也不尽相同，这就给本病的诊断带来了困难。
2000年，T. Notomi及其团队发明了一种新型核酸扩增技术环介导等温扩增技术 (loop-mediated isothermal amplification,LAMP)，该方法依赖不同的4种特异性引物来识别并扩增靶基因中的6个特定区域，扩增效率高，可在30 60min将目的片段扩增109 1010倍。由于扩增依赖于靶序列的多个特异性区域，其特异性和敏感性均较普通PCR和荧光定量PCR高。此外，所运用的DNA聚合酶具有链置换功能，扩增反应可在恒温的条件下进行，不需要昂贵的仪器，仅仅使用普通的水浴锅即能进行扩增反应，加之所需时间短及反应产物易于观察(可以通过肉眼判定扩增样本是否为阳性)，这就给广大缺乏专业设备基层兽医工作站带来了福音。基于以上优点，LAMP自发明之门起，已被广泛用于病原的检测，其中包括猪瘟病毒，猪繁殖与呼吸系统综合征病毒，圆环病毒2型，猪伪狂犬病毒，猪传染性胃肠炎病毒，猪流行性腹泻病毒，副猪嗜血杆菌，大肠杆菌，巴氏杆菌等，但到目前为止，未发现将LAMP方法用于检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的专利申请。发明内容
为了克服现有检测猪传染性胸膜肺炎PCR技术中所存在的设备昂贵、耗时长等问题，本发明提供一种用于猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的LAMP检测方法，该检测方法能在短时间内检测出微量的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，所需时间比PCR缩短3倍，敏感性是常规 PCR检测的100倍以上，而且不需要昂贵的PCR仪，反应后通过离心(扩增的副产物焦磷酸镁沉在管底产生白色沉淀)即可判别阳性反应。
为实现上述目的本发明提供如下的技术方案
I.本试剂盒所包含的组分及每次检测时各组分的使用量如下表I所示
表I.本试剂盒包含的组分及用量
权利要求
1.一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌LAMP试剂盒，其特征在于，包含LAMP反应液以上试剂以50个反应为例，每个LAMP试剂盒中所包含的LAMP反应液的成分及其浓度，体积如下表所示
2.权利要求I中所述的LAMP试剂盒的使用方法，其特征是，包括如下步骤(1)配制上述24μ I LAMP反应液；(2)取患猪接触传染性胸膜肺炎病猪的鼻拭子于灭菌的反应管内，加入30μI灭菌的双蒸水，在95°C条件下作用5min使细菌破裂释放出其基因组，作用完成后立即将反应管置于冰上3min,使细菌基因组保持单链状态,再10000r/min离心3min,于3°C保存；(3)提取⑵中所得的样品上清Iμ I加入(I)中24 μ I LAMP反应液中，使反应终体积为25 μ I,上下颠倒数次,使反应物均勻混合,再IOOOOrpm瞬时离心O. 5min,使反应液全部沉到管底；(4)将(3)中所得反应物于64°C恒温水浴锅中，反应60min;(5)取出反应管4000rpm离心3min，通过观察管底是否有沉淀，或取5μI反应终产物于2%琼脂糖凝胶中电泳20min后于紫外灯下观察电泳图像来判断阴阳性。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测猪传染性胸膜放线杆菌的LAMP试剂盒及使用方法。该试剂盒包含8U/μl的BstDNA聚合酶50μl；BstDNA聚合酶缓冲液125μl；0.1mol/l的MgSO4100μl；12.5mmol/l甜菜碱100μl；17.5mmol/l dNTP100μl；引物。经多次实践检验表明，该试剂盒能在63℃-64℃恒温水浴锅中特异、敏感、快速、高效地检测出微量的多种血清型的猪传染性胸膜放线杆菌。此方法不需要复杂的仪器，亦不需要太多的专业技能，能较好地满足目前对猪传染性胸膜放线杆菌现场检测的迫切需要，可用于进出口检疫、食品卫生部门、畜牧饲养场等的现场检测，特别适合于广大兽医基层工作者对猪肉传染性胸膜肺炎放线杆菌的野外和实时检测。
文档编号C12Q1/68GK102925548SQ201210271630
公开日2013年2月13日 申请日期2012年8月2日 优先权日2012年8月2日
发明者徐志文, 朱玲, 季洪伟, 杨宏伟, 周远成 申请人:四川农业大学, 四川志邦生物科技有限公司