专利名称：一种杂合肽囊素佐剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子免疫学技术领域，具体涉及一种杂合肽囊素佐剂及其制备方法和应用。
背景技术：
Lys-His-Gly-NH2三肽是一种可以诱导B淋巴细胞分化的激素样物质，它不仅可以通过诱导干细胞的分化和作用于B淋巴细胞对机体免疫球蛋白的多样化性产生影响，而且还可以促进机体的IgM向IgG的方向发生变转，因其最早是从鸡法氏囊中提取的，所以称之为囊素三肽。1991年，Aydhya等发现囊素不仅仅存在于禽类法氏囊中，还存在于哺乳动 物的骨髓和胆管上皮细胞中。在哺乳动物中分离的囊素是以前囊素状态出现的，它是一种序列为 Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly-Gly-Arg-Arg 的 14 妝结构。从序列上我们可以看出其第9位、第10位和第11位这三个连续的氨基酸正好是囊素三肽的序列。Aydhya的研究还证实了此14肽的前囊素与囊素三肽有着相似的生物学活性。因此，我们可以推断融合状态的前囊素并不影响三肽生物活性的发挥。近年来国外对有免疫活性的多肽的序列和结构有详细的研究，其中有一种叫做加加尼翁(Gagnon’s peptide)的四肽,其氨基酸序列为Lys-Asn-Pro_Tyr。这个四肽序列被证实也是B细胞刺激物，可以增加鸡新城疫疫苗等抗体效价。为了研究重组疫苗免疫佐剂，本研究利用分子生物学的方法设计了 14个囊素三肽和2个加加尼翁四肽的杂合序列，并在序列的末端增加了 6个组氨酸的标签序列，最终序列长度为197bp，我们命名其为杂合肽囊素N197。通过合成N197的杂合多肽序列以及体外和体内动物实验来验证基因工程免疫增强剂杂合多肽的免疫活性。
发明内容
(一)本发明要解决的技术问题是提供一种可广泛用于疫苗制备，生产成本低，免疫佐剂效果好的新型杂合肽囊素免疫佐剂及其制备方法和应用。(二)本发明的技术方案是I杂合肽囊素N197的设计合成14个囊素三肽的氨基酸序列(Lys-HiS-Gly-NH2)和2个加加尼翁活性四肽的氨基酸序列(Lys-Asn-Pro-Tyr)所对应的密码子共有150bp的核苷酸。另外，在核酸序列的前面添加一个起始密码子的序列(3bp)和一个限制性内切酶EcoRI的酶切位点(6bp)。在序列的末端加上6个组氨酸的序列(18bp)，一个终止密码子(3bp)，另外加上三个限制性内切酶(Xho I1Sal I1Pst I)的核酸序列(17bp)。这样设计好的杂合肽囊素核酸序列共包括197个核苷酸(N197序列)。2含有杂合肽囊素N197序列原核表达载体的构建与鉴定把合成好的杂合肽囊素N197序列与线性化后的PET32a(Novagen公司商品化产品)原核表达载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌宿主后，用酶切鉴定的方法筛选含N197的PET32a载体的宿主菌。3杂合肽囊素在大肠杆菌中的诱导表达以终浓度为ImM的IPTG (异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)对含杂合肽囊素序列的宿主菌进行诱导表达，同时以含PET32a空载体质粒的BL-21菌同样诱导处理后样品为阴性对照。以SDS-PAGE电泳结果来分析杂合肽囊素在大肠杆菌中的表达水平。4重组大肠杆菌杂合肽囊素N197的纯化利用SDS-PAGE电泳来对杂合肽囊素N197的表达条带进行分离，并通过切胶回收的方法对重组杂合肽囊素N197进行分离、纯化，并可以进一步利用SDS-PAGE电泳对切胶回收的杂合肽囊素N197的纯度进行分析。 5纯化后的重组杂合肽囊素N197的体外免疫活性测定(碧云天生物公司的CCK8试剂盒)取鸡外周血，并分离出淋巴细胞，在LPS的作用下，测定纯化后的重组杂合肽囊素N197在体外促进B淋巴细胞增殖的免疫活性，并设立相应的阴性对照和空白对照。6重组杂合肽囊素N197体外免疫佐剂活性的测定把I日龄的SPF级白色来航鸡在SPF饲养至10日龄后分为A，B，C和D等4组，每组3只鸡。其中A组为商品化的鸡传染性法氏囊病灭活疫苗免疫组(采用市售商品化鸡传染性法氏囊病的灭活苗在鸡颈部皮下注射200 μ I) ；Β组为联合免疫组(用商品化的鸡传染性法氏囊病灭活疫苗颈部皮下注射加200 μ I切胶回收的O. 14mg/ml的N197) ；C组为阳性攻毒组(不免疫，进行攻毒);D组为空白对照组(不免疫，不攻毒)。对各组中需要免疫的鸡只按上述方案进行免疫，在24日龄时加强免疫一次，疫苗接种剂量及各组免疫增强剂的添加情况同第一次免疫。7杂合肽囊素N197对商品化鸡IBD疫苗免疫抗体水平的影响在第二次免疫13日后，即鸡群37日龄时对鸡群进行翅静脉采血。具体方法如下
(I)固定鸡只，使鸡的翅膀上翻(注意勿使鸡翅膀折伤或脱臼)；(2)在鸡翅中部选取翅静脉比较清楚的位置用70%酒精棉球消毒并使血管得以扩张;(3)用Iml的一次性无菌注射器在消毒部位采血约Iml/只；(4)将采集的鸡血在室温放置Ih后于4°C冰箱过夜。次日，以2000rpm，4°C离心IOmin并小心吸取上清；(5)采用琼扩实验方法测定血清中鸡IBD抗体的水平和效价。中间孔加入标准鸡传染性法氏囊病琼扩抗原，周围的孔中分别加入采集的免疫鸡群及对照组实验鸡只的抗血清。8杂合肽囊素N197对攻毒后鸡法氏囊的保护作用分析鸡群采血后立即对其进行攻毒，每只鸡采用滴眼的方式滴加90 μ I鸡IBDV的强毒株BC6/85的病毒液(约1000 EID5tlX攻毒6天后，处死所有鸡群并对其进行剖检。主要取鸡的脾脏和法氏囊组织称重后立即放入10%的福尔马林溶液进行固定后进行病理切片分析。(三)本发明其有益效果是目前，畜禽疫苗所使用的佐剂主要还是矿物油类佐剂为主，虽然油佐剂的免疫效果得到了认可，但是其的主要缺陷在于其具有一定的毒副作用(引起局部炎症等等)。本研究制备的杂合肽囊素N197作为疫苗佐剂主要有如下几方面的有益效果I杂合肽囊素N197是一种高效、低廉，安全的畜禽疫苗佐剂囊素三肽作为疫苗佐剂的免疫促进作用已被广泛证实，但是由于天然提取的囊素三肽工艺复杂，得率较低，成本昂贵，所以用天然提取的囊素工作畜禽用佐剂几乎没有可能性。而本研究采用大肠杆菌系统在体外表达杂合肽囊素N197，此方法获得的重组蛋白的效率很高，且大肠杆菌系统生产外源蛋白的成本比较低，因此，杂合肽囊素N197是一种高效，低廉的免疫佐剂。另外，由于囊素三肽和加加尼翁活性四肽是家禽等生物体内本身存在的一种小肽，且多肽在自然环境中易降解，因此，把多个囊素三肽和加加尼翁活性四肽的密码子串联后，在体外表达的重组杂合肽囊素N197对畜禽来说应该是一种比较安全的免疫佐剂。2重组杂合肽囊素N197是一种具有广谱促免疫作用的免疫佐剂 该佐剂能提高多种畜禽疫苗的免疫效果，这直接减少了畜禽患病的机会，间接增加了养殖户的收入和经济效应。同时，该新型佐剂的应用可望提高传统疫苗的免疫效果，降低畜禽重大传染病的防治成本。3重组杂合肽囊素N197是一种绿色、环保的免疫佐剂该免疫佐剂可降低畜禽疫苗抗原的使用量，从而减少了因大量繁殖病毒对疫苗生产区域的环境和疫苗使用场所周围环境的污染程度，降低企业的生产成本，是一种绿色、环保免疫佐剂。此外，重组杂合肽囊素N197属于重组多肽佐剂，其在自然界中可以被降解，不会对环境和其他生物造成生物危害。
四
图I :含杂合肽囊素N197核酸序列的PET32a重组载体的酶切鉴定图A:N197 ;M:DNA分子量标准；1:含杂合肽囊素N197核酸序列的PET32a重组载体的酶切鉴定；图2 :含杂合肽囊素N197核酸序列的PET32a表达载体在大肠杆菌中的诱导表达。A :杂合肽囊素N197 ;1_2:诱导4h时的PET32a_N197转化菌；M:蛋白分子量标准；3:诱导4h时的PET32a空质粒转化菌图3 :杂合肽囊素N197的纯化A:纯化后的杂合肽囊素N197;M:蛋白质分子量标准；I:切胶回收的重组杂合肽囊素N197的印迹
五具体实施例方式I杂合肽囊素N197的设计合成14个囊素三肽的氨基酸序列(Lys-His-Gly-NH2)和2个活性四肽的氨基酸序列(Lys-Asn-Pro-Tyr)所对应的密码子共有150bp的核苷酸。另外在核酸序列的前面添加一个起始密码子的序列(3bp)和一个限制性内切酶EcoR I的酶切位点(6bp)。在序列的末端加上6个组氨酸的序列(18bp)，一个终止密码子(3bp)，另外加上三个限制性内切酶(XhoI，Sal I1Pst I)的核酸序列(17bp)。这样设计好的杂合肽基因共包括197个核苷酸。具体序列如下
5 ' -GAATTCATGAAACACGGTAAACATGGCAAACACGGTAAACACGGCAAACACGGCAAACACGGTAAACACGGTAAACATGGCAAACACGGCAAGCACGGTAAGCACGGTAAACACGGCAAACATGGCAAACACGGTAAAAATCCGTACAAGAACCCGTATCATCACCACCATCACCATTAAGTCGACTCGAGCTGCAG-3 ^N197序列设计好之后，送南京金斯瑞公司进行序列的合成。2含有杂合肽囊素N197序列原核表达载体的构建2. I杂合肽囊素N197序列的准备取金斯瑞公司提供的含N197杂合肽基因的克隆载体PUC57-N197的转化菌(穿刺菌)溶解于普通的LB培养基中，再用接种环蘸取TOC57-N197的转化菌的菌液，在含有终浓度为50μ g/ml氨苄青霉素(Amp)的普通LB琼脂平板上，以四区划线的方式进行转接，接着
置于37°C培养箱，培养12-16h，以获得含N197杂合肽基因的克隆载体roC57_N197的转化菌的单菌落。次日从PUC57-N197的转化菌划线平板上挑取单个菌落至I支含3ml液体LB培养基的试管中，37°C培养12-16h后取I. 2ml菌液用普通质粒小提试剂盒提取质粒。提取的PUC57-N197质粒用EcoR I和Sal I进行酶切，酶切体系如下
提取的 PUC57-N19740μ1
IO^Buffer H16μ1
EcoR I3·2μ1
Sal I3.2μ1
(IdH2O97.6μ1
总体积160μ1以上酶切体系在37°C作用2h后，用2%的琼脂糖凝胶电泳来鉴定PUC57-N197是否正确。如鉴定为正确的含有N197核酸片段的质粒，则可以对该质粒进行大量酶切，并在紫外灯下割取分子量在197bp左右的目标条带，并对其中的核酸进行回收。2. 2PET32a表达载体的线性化及其回收按如下体系的组成对原核表达载体PET32a进行酶切(EcoR I、Sal I)、回收。
PET32a20 il
IOxButTer H8μ1
hcoR Ii .6μ1
Sail1.6μ1
ddH2048.8μ1
总体积80μ12. 3重组杂合肽囊素Ν197原核表达载体(PET32a_N197)的构建把分别经过EcoR I和Sal I两个酶酶切的PET32a回收溶液和N197进行连接，构建含N197序列原核表达载体PET32a，具体连接体系如下_切回收的N1973μ1
PET32aI μ!
IOxiigase BufferΙμ
14DNA ligaseUd
ddH^O4μ1
总体积10μ1以上各组分在O. 25ml的离心管中混匀并稍加离心，放入4°C恒温体系中连接过夜。
2. 4杂合肽囊素N197序列与表达载体PET32a的连接产物的转化将10 μ I Ν197回收片段与PET32a载体的连接产物加入一支200 μ I BL-21感受态细胞的菌液中，轻轻混匀后冰浴30min。将冰浴后的连接产物在42°C，热应激90s后轻轻放置冰水中冰浴5min。接着在转化体系中加入800 μ I的LB培养基，37°C，170rpm振荡培养50min。取200 μ I转化菌液均匀涂布于含有50 μ g/ml终浓度的Amp的普通LB琼脂平板上，37°C培养12-16h后观察菌落的生长情况。在涂有转化菌液的平板上挑取I个大小适中，形态饱满的转化菌落至含3ml液体普通LB培养基(含50 μ g/ml浓度的Amp)的试管中，37°C培养过夜。在每个试管中取I. 5ml的菌液至Eppendorf管中，使用普通质粒小提试剂盒提取质粒。2. 5含杂合肽囊素N197序列的PET32a表达载体的鉴定把提取的转化菌的质粒用EcoR I和Sal I酶切，酶切体系如下
转化的质粒8μ1
IOxBuffer H2μ1
I0.5μ1
Sal I0.5μ1
CidH2O9μ1
总体积20μ1以上各组分在O. 25ml的离心管中混匀并稍加离心后于37°C恒温水浴2. 5h左右，取酶切后的质粒溶液在2%的琼脂糖凝胶中电泳，100V电压，电泳20min左右，在UVPBiospectrum 600下观察有无分子量大小分别为200bp和5900bp左右的两条核酸条带,转化质粒中能酶切出这两种分子量核酸的质粒即可鉴定为重组N197的PET32a表达质粒。2. 6杂合肽囊素N197序列在大肠杆菌中的诱导表达把本章2. 2中含有阳性重组N197的PET32a表达载体的大肠杆菌在氨节青霉素平板上四区划线，37°C培养至肉眼可见大小适度的单菌落后停止培养。从划线平板上挑取2个菌落接种到3ml含氨苄青霉素(100 μ g/ml)的LB液体培养基中，37°C振摇过夜。次日取2%过夜培养物接种到4ml含氨苄青霉素的普通LB液体培养基中，37°C剧烈振摇培养，约2-2. 5h后达到对数生长中期(菌液OD6tltl值为O. 5-0. 6左右)，加入终浓度为ImM的IPTG进行诱导表达。以PET32a空载体质粒的BL-21菌同样诱导处理后为阴性对照。2个诱导菌和空载体PET32a菌在IPTG诱导4h时各取500 μ I样品，诱导菌室温12000rpm离心30s。收各管的菌体沉淀加入40 μ I的ddH20重悬细菌沉淀，100°C处理IOmin后进行SDS-PAGE。2. 7重组大肠杆菌杂合肽囊素N197的纯化从划线平板上挑取单菌落接种到3mlLB液体培养基(含终浓度为50 μ g/ml的氨苄青霉素)，37°C振摇过夜。次日，取2%过夜培养物接种到IOml含氨苄青霉素的普通LB液体培养基中，37°C剧烈振摇培养，约2-2. 5h后达到对数生长中期(菌液0D600值为O. 5-0. 6左右)，加入终浓度为ImM的IPTG进行诱导表达。在诱导4h时，所有的诱导菌经12000rpm，离心30s，其沉淀用800 μ I的ddH20重悬后加入200 μ I的SDS-PAGE的loading buffer中，在100°C煮沸IOmin后进行SDS-PAGE。剩余的样品于_20°C保存。SDS-PAGE结束后把胶用ddH20稍漂洗后去掉泡沫，用O. 25M的KCl溶液(4°C预冷)浸泡胶，杂合肽囊素N197的印迹会立即显现出来，此时用干净的刀片把含有杂合肽囊素N197的凝胶切割下来并浸泡在ddH20中约Imin后，用注射器针筒压碎凝胶，使凝胶颗粒大 小约为O. 然后在碎的凝胶中加入PBS或ddH20,过夜后12000rpm,离心15min,取上清即为含有很纯杂合肽囊素N197的切胶回收溶液。取40 μ I的杂合肽囊素N197的切胶回收溶液，加10 μ I loading buffer，在100°C煮沸IOmin后进行SDS-PAGE。通过电泳来确定杂合肽囊素N197的纯度。2. 8杂合肽囊素N197对商品化鸡传染性法氏囊疫苗的免疫增强剂效应把I日龄的SPF级白色来航鸡在SPF饲养至10日龄后分为A，B，C和D等4组，每组3只鸡。其中A组为商品化的鸡传染性法氏囊病灭活疫苗免疫组(采用市售商品化鸡传染性法氏囊病的灭活苗在鸡颈部皮下注射200 μ I) ；Β组为联合免疫组(用商品化的鸡传染性法氏囊病灭活疫苗颈部皮下注射加200 μ I切胶回收的O. 14mg/ml的N197) ；C组为阳性攻毒组(不免疫，进行攻毒);D组为空白对照组(不免疫，不攻毒)。对各组中需要免疫的鸡只按上述方案进行免疫，在24日龄时加强免疫一次，疫苗接种剂量及各组免疫增强剂的添加情况同第一次免疫。2. 8. I杂合肽囊素N197对商品化鸡IBD疫苗免疫抗体水平的影响在第二次免疫13日后，即鸡群37日龄时对鸡群进行翅静脉采血。具体方法如下(I)固定鸡只，使鸡的翅膀上翻(注意勿使鸡翅膀折伤或脱臼)；(2)在鸡翅中部选取翅静脉比较清楚的位置，用70%酒精棉球消毒并使血管得以扩张；(3)用Iml的一次性无菌注射器在消毒部位采血约Iml/只；(4)将采集的鸡血在室温放置Ih后于4°C冰箱过夜。次日，以2000rpm，4°C离心IOmin并小心吸取上清；(5)采用琼扩实验方法测定血清中鸡IBD抗体的水平和效价。中间孔加入标准鸡传染性法氏囊病琼扩抗原，周围的孔中分别加入采集的免疫鸡群及对照组实验鸡只的抗血清。2. 8. 2杂合肽囊素N197对攻毒后鸡法氏囊的保护作用分析鸡群采血后立即对其进行攻毒，每只鸡采用滴眼的方式滴加90 μ I鸡IBDV的强毒株BC6/85的病毒液(约1000EID5(i)。攻毒6天后，处死所有鸡群并对其进行剖检。主要取鸡的脾脏和法氏囊组织称重后立即放入10%的福尔马林溶液进行固定后进行病理切片分析。
权利要求
1.一种杂合肽囊素N197佐剂，其特征是由14个囊素三肽的氨基酸序列Lys-His-Gly-NH2和2个活性四肽的氨基酸序列Lys-Asn-Pro-Tyr及6个组氨酸组成的杂合多肽序列。
2.权利要求I所述的杂合肽囊素N197佐剂的制备方法，其特征是由以下步骤组成 ①杂合肽囊素N197的设计合成 14个囊素三肽的氨基酸Lys-His-Gly-NH2和2个活性四肽的氨基酸Lys-Asn-Pro-Tyr所对应的核酸序列,共150bp的核苷酸，同时在该核酸序列的N段添加一个起始密码子的序列3bp和一个限制性内切酶EcoR I的酶切位点6bp，另外在该序列的C端加上6个组氨酸的密码子序列18bp，一个终止密码子3bp和三个限制性内切酶Xho I，Sal I1Pst I的核酸序列17bp，这样设计好的杂合肽囊素基因共197个核苷酸，具体序列如下5 z -GAATTCATGAAACACGGTAAACATGGCAAACACGGTAAACACGGCAAACACGGCAAACACGGTAAACACGGTAAACATGGCAAACACGGCAAGCACGGTAAGCACGGTAAACACGGCAAACATGGCAAACACGGTAAAAATCCGTACAAGAACCCGTATCATCACCACCATCACCATTAAGTCGACTCGAGCTGCAG-3 ,； ②重组杂合肽囊素N197的原核表达载体PET32a-N197的构建及其重组菌 杂合肽囊素N197核酸序列与线性化的PET32a (Novagen公司商品化产品)原核表达载体进行连接，获得了重组杂合肽囊素N197的原核表达载体PET32a-N197，该载体转化大肠杆菌BL-21宿主后获得了含PET32a-N197载体的重组菌，该重组菌表达重组杂合肽囊素N197的量可高达20% ；
3.权利要求I所述重组杂合肽囊素N197佐剂在制备法氏囊疫苗或新城疫疫苗或猪瘟疫苗或禽流感疫苗或马立克氏病疫苗等畜禽疫苗制备中的应用。
4.权利要求I所述重组杂合肽囊素N197独立使用时，对畜禽免疫力的增强作用。
全文摘要
本发明属于分子免疫学技术领域，具体涉及一种杂合肽囊素佐剂及其制备方法和应用。主要技术方法如下先设计出14个囊素三肽的氨基酸序列(Lys-His-Gly-NH2)和2个活性四肽的氨基酸序列(Lys-Asn-Pro-Tyr)密码子为主体的杂合肽囊素N197的核酸序列。接着构建了重组表达载体PET32a-N197，将其转入BL-21(DE3)大肠杆菌后，杂合肽囊素N197获得了高效表达。纯化后的杂合肽囊素N197具有显著的免疫佐剂的特性。本发明中的杂合肽囊素N197具有高效的佐剂特性，且利用大肠杆菌系统可以在体外对其进行大规模的生产，其生产成本低，生产效率高，生物活性好，非常适合企业化生产，具有很好的作为畜禽免疫佐剂的应用前景。
文档编号C12N15/70GK102796200SQ20121029558
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月17日 优先权日2012年8月17日
发明者沈萍萍, 蔡梅红 申请人:南京大学