一种光合细菌菌株及其应用的制作方法

专利名称：一种光合细菌菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种微生物领域，尤其涉及一种光合细菌菌株及其应用。
背景技术：
光合细菌是ー类具有固碳、固氮、脱氢、氧化硫化物等功能的微生物，此外，光合细菌本身是活蛋白，内含有丰富的氨基酸、维生素、促生长因子、抗病毒活性因子、辅酶Q及多种生理活性物质，具有抗脂质过氧化、改善水质，培养饵料生物，防治疾病，提高成活率，固氮，产氢气等功能，因而在水产养殖、禽畜饲养、饲料添加、环境保护、新能源的生产及保健品等方面越来越多的被应用，成为现代生物技术不可缺少的一部分。但是现有的光合细菌通常对酸、碱、盐、抗生素的耐受能力不强，在实际使用中受到限制，对蔬菜生长的促进效果不大。

发明内容
本发明的目的是克服现有光合细菌耐受性低、不能有效促进蔬菜生长的缺陷，提供ー种具有耐酸、耐碱、耐盐、耐抗生素能力且能显著提高蔬菜产量及品质的光合细菌菌株。本发明的另一目的在于提供上述光合细菌菌株的应用。为了达到上述目的，本发明通过采用选择性培养基在厌氧和好氧培养条件下，对生长于广东省水田土壌中的光合细菌进行分离、纯化得到一种光合细菌菌株，所述细菌为胶状红长命菌iRubrivivax gelatinosus) sbgll,于2012年5月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 6085。该胶状红长命菌sbgll具有耐酸、耐碱、耐盐和抗生素的能力，可作为接种剂促进生菜、番茄、辣椒等蔬菜的生长。经过序列測定，上述光合细菌菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO: I所示。本发明还提供ー种接种剂，其含有上述光合细菌菌菌株，即胶状红长命菌sbgll。本发明的光合细菌菌株优选作为液体菌肥以促进生菜、番茄、辣椒等蔬菜作物生长。所述液体菌肥由上述光合细菌菌株按2 5% (特别优选3%)的接种量采用LB液体培养基培养而得。同时本发明还提供一种促进蔬菜生长的方法，具体是将上述液体菌肥施用于种植蔬菜的PH为4. 0-10. 0的土壌中。该方法特别适合于促进生菜、番茄或辣椒等蔬菜的生长。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
发明人经过大量的实验研究，筛选出ー种具有耐酸、耐碱、耐盐和抗生素能力的光合细菌菌株，即胶状红长命菌{Rubrivivaxsbgll,所述的光合细菌菌株能够显著
地提高蔬菜的产量及品质，可广泛地应用于各种蔬菜。在经本发明的细菌处理后，生菜、番茄、辣椒等蔬菜的产量及品质都有了显著提高。本发明还为生菜、番茄、辣椒等蔬菜提供了一种优良的液体菌肥，它来源于农田土壌中，明显促进生菜、辣椒、茄子等蔬菜对酸、碱性土壤的耐受性，可防止使用化肥进ー步使土壌酸化而不利于植物生长。
具体实施例方式实施例I
胶状红长命菌{Rubrivivax gelatinosus) sbgll的分离、纯化和鉴定富集称取土样10 g于含50 mL无菌水的三角瓶中，充分振荡打散，制成悬浊液，与富集营养液按I: 5比例装人三角瓶中，并覆盖一层无菌液体石蜡(高约2 cm)形成厌氧环境，封ロ，静置于光照培养箱，30 ± 2°C，培养15 20d，瓶壁上先长出黄、绿、红、紫红等多种不同顔色的菌株，后又被优势菌株覆盖并贴满瓶壁。取此第一代培养瓶中的菌悬液100 ML于250 mL富集营养液进行第二代培养，培养方法与第一代相同。培养约10天后从第二代培养瓶中吸取10 ML于250 mL富集营养液进行第三代培养，培养条件不变，富集优势菌株，淘汰劣势菌株。
分离纯化吸取第三代液体培养液I mL于盛有9 mL无菌水的试管制成10—1倍稀释菌液，再取此浓度菌悬液如法稀释至10_2、10_3倍，直至稀释到10_6倍。分别吸取10_4、10_5、IO-6三个梯度的菌悬液100 ML，分别依次采用平板涂布培养法和倾注厌氧培养法，30±2°C下光照培养，观察不同培养方法下菌体的生长情况，挑取长势较好并且具有不同特征的菌落用平板划线法进行反复传代培养，直至菌落的形状、顔色、质地、透明度一致。最后通过简单染色和镜检，进ー步观察其形态，以长度均一、宽度一致、染色情况统ー为菌株纯化标准。保存将分离纯化后的菌株在光合细菌分离培养基平板光照培养2飞d，收集平板上的菌体，保存于15 %灭菌甘油(_20°C )和牛血清中(_80°C )。并且于2012年5月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 6085。上述方法中，富集培养液(IL) =KH2PO4 0.5 g，K2HPO4 0.6 g, (NH4)2SO4 1.0 g,MgSO4* 7H20 0. 2 g (分开灭菌)，NaCl 0. 2 g, CaCl2 *2H20 0. 075 g (分开灭菌)，こ酸钠 I. 5g，酵母膏 I g，微量元素液 1.0 mL (H3BO3 0. 28 g, NaMoO4 0.075 g, CuSO4 0.004 g, MnSO40. 21 g, ZnSO4 0. 024 g, I L 水)，pH 为 7. 0±0. 2。分离培养基(IL):酵母膏 3 g，蛋白胨 3 g，CaCl2.6H20 0.3 g,MgSO4*7H20 0.5 g,琼脂粉 15 g，pH 7.0 ±0.2。由上述方法分离纯化的胶状红长命菌sbgll具有如下形态和生理、生化特性
a、菌体形态特性
胶状红长命菌为革兰氏阴性菌，细胞呈短杆状，菌体大小为0. 4^0. 7X1. 2 2. 7 Mm。b、菌落形态特性
光照厌氧液体培养物为深粉红色，瓶底、瓶壁及液面上形成一层深红色隔氧膜，不随震荡散开；琼脂平板上也生长较快，呈浅红至深紅色点状菌落，菌落表面微光滑、突起、湿润、有光泽、透明，菌落边缘整齐。C、生理生化特性
兼性厌氧，菌体富含细菌叶绿素a和类胡萝卜素；能在以吐温40，吐温80，D-葡萄糖，D-甘露糖，L-果糖，D-果糖，a -酮戊ニ酸，琥珀酸钠，水杨酸钠为碳源的培养基上生长；pH生长范围较广，可耐pH4-pH10 ;对NaCl不敏感，耐NaCl浓度达4. 0% ;对300吒 mじ1的氨苄青霉素仍有耐受性，耐庆大霉素、新霉素可达50呢 !!!じ1，而对卡拉霉素、链霉素、氯霉素、四环素、红霉素的耐受性差，低浓度的这几种抗生素就能抑制其生长。菌株sbgll能产生吲哚、分泌生长素、液化明胶和还原N03_，不能生成H2S。吲哚反应呈阳性，且能分泌生长素IAA，能液化明胶。碳源利用情况和是否需氧的实验表明本发明的菌株胶状红长命菌sbgll与胶状红长命菌模式菌株ATCC17011存在较大的差异，应为胶状红长命菌中的一个新菌株。经过序列測定，上述菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO: I所示。本发明胶状红长命菌的分子分类地位的确定
采用细菌 16S rDNA 基因通用引物 25f〔5’-AAC T(G/T)A AGA GTT TGA TCC TGGCTC-3，〕(SEQ ID NO:2 或 SEQ ID N0:3)和 1492r〔5，-TAC GG(C/T) TAC CTT GTT ACGACT T-3’〕(SEQ ID N0:4或SEQ ID NO: 5)进行扩增，将PCR产物直接进行序列測定，将获得的DNA序列输入GenBank进行比对，初步确定本发明的光合细菌属于红螺菌目、红螺菌 科、长命菌属，与胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)模式菌株ATCC17011 (美国典型培养物保藏中心菌株)有99%的相似性。结合上述的生理生化特性、16S rDNA序列分析、SDS-PAGE全细胞蛋白电泳图谱和DNA/DNA杂交结果，本发明中保藏号为CGMCC No. 6085的菌株应属于胶状红长命菌(Rubrivivax gelatinosus)。其判断參考如下文献Imhoff J F，Triiper Hし，Piennig N. Rearrangement 01 the species and genera of the phototrophic
purple nonsulfur bacteria [J]. International Journal of SystematicBacteriology, 1984，34 (3):340-343 ;Willems A，Gillis M，De Ley J. Transferof Rhodocyclus gelatinosus to Rubrivivax gelatinosus gen. nov.， comb,nov.， and Phylogenetic Relationships with Leptothrix, Sphaerotilus natans，Pseudomonas saccharophila and Alcaligenes latus[J]. International Journal ofSystematic Bacteriology, 1991，41 (I) :65-73 ；Triiper H G，Imhoff J F. The generaRhodocyclus and Rubrivivax [M] //Balows A，Triiper H G，Dworkin M，et al. Theprokaryotes. Berlin: Springer, 1992. 2556-2561 ；Garrity G M，Johnson K L，BellJ，et al. Bergey^ s manual of systematic bacteriology, 2nd Edition[M]. 3.0.New York: Springer, 2002. 64-65 ；Ramana C V，Sasikala C，Arunasri K，et al.Rubrivivax benzoatilyticus sp. nov.，an aromatic, hydrocarbon-degrading purplebetaproteobacterium[J]. International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology, 2006，56 (PT 9):2157-2164。实施例2
光合细菌应用于生菜
将实施例I活化得到的、即保藏号为CGMCC No. 6085的胶状红长命菌gelatinosus) sbgll单菌落于25mL的新鲜LB液体培养基中，37で，180rpm振荡培养24h，再将培养好的液体种子培养液按3%接种量转接到发酵培养基中，37で，180印111振荡培养28h，备用。盆栽试验做4个处理，5个重复。II:化肥做底肥，菌肥做追肥；12:化肥做底肥，不接种的等量空白营养液做追肥；13 :只有等量化肥做底肥，不追肥；CK :只浇清水不施肥。以上四个处理其他日常管理一致。結果表明生菜干重的平均数值以Il处理最高，比12提高了 12. 21 %，表明菌剂的施加在一定程度上促进了生菜干物质的积累。而处理11、12、13与CK对照相比，无论在生菜鲜重还是干重上均达到5 %显著性水平差异。施用菌肥Il组硝酸还原酶活性为72. 4 + 0. 52 l^g(N02 — ). [g(Fff) .h]-1，比对照12、13、CK组分别提高34. 91%、62. 71 %、309. 50 %。施加菌肥的叶片组织叶绿素含量高于其他处理，比CK清水对照组高出36. 49 %。Il菌肥组生菜叶片Vc含量0. 234±0. 007 mg.g—1，相比12、13、CK组分别提高了 61. 38 %、84. 25 %、127. 18 %。Il组与12、13、CK组相比生菜叶片全氮的含量分别提高了 20. 020%、18. 455%,61. 971% ;全磷分别提高了 29. 503%,36. 275%,80. 519% ;全钾分别提高了 13. 200%、19. 409%,38. 725%。上述使用的LB (液体/固体)培养基胰蛋白胨10g，酵母浸出粉5g，氯化钠5g加双蒸水定容至1L，固体培养基加I. 5%琼脂粉，121°C灭菌20min。实施例3
光合细菌应用于辣椒 将实施例I活化得到的、即保藏号为CGMCC No. 6085的胶状红长命菌gelatinosus) sbgll单菌落于25 mL的新鲜LB液体培养基(同实施例2)中，37°C, 180rpm振荡培养24h，再将培养好的液体种子培养液按3%接种量转接到发酵培养基中，37°C，180rpm振荡培养28h，备用。田间试验做4个处理，3个重复共12个小区。处理I :光合菌肥5mL*nT2 ;处理2 :光合菌肥lOmLm2 ;处理3 :灭菌的光合菌肥10mL*nT2。菌肥用清水稀释20倍后叶面喷施于蔬菜上。对照区喷同量的水，以上四个小区其他日常管理一致。实验结果表明处理I比对照开花早，结椒提前，叶色椒色均比对照绿，辣椒硝酸盐含量平均降低16. 2% ；Vc含量增加17. 9% ;产量增加15. 1%。处理2中开花早、结椒提前、叶色椒色均比对照绿的现象更明显，辣椒硝酸盐平均降低21. 3% ；Vc含量增加19. 8%，产量增加22. 9%。表明此光合细菌能够明显提高辣椒的产量及品质。实施例4
光合细菌应用于番爺
将实施例I活化得到的、即保藏号为CGMCC No. 6085的胶状红长命菌{Rubrivivaxgelatinosus) sbgll单菌落于25 mL的新鲜LB液体培养基(同实施例2)中，37°C, 180 rpm振荡培养24h，再将培养好的液体种子培养液按3%接种量转接到发酵培养基中，39°C混合培养24h，备用。田间试验做4个处理，3个重复共12个小区。处理I :菌液+化肥；处理2 :灭菌菌液+化肥；处理3 :化肥；处理4 :清水，其他日常管理一致。结果表明前三个处理比清水处理的株高分别增加57. 5%，37. 1%，25. 9% ;叶绿素分别提高60. 7%，9. 2%，3. 6% ;番茄红素分别提高72. 7%，36. 1%，53. 0% ；Vc分别提高74. 8%，32. 1%，3. 7%。表明此光合细菌能够明显提闻番爺的品质。
权利要求
1.一种光合细菌菌株，所述细菌为胶状红长命菌{Rubrivivaxsbgll,于2012年5月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo. 6085。
2.如权利要求I所述的光合细菌菌株，其特征在于其16SrDNA序列如SEQ ID NO: I所/Jn o
3.ー种接种剂，其特征在于含有权利要求I或2所述的光合细菌菌株。
4.ー种液体菌肥，其特征在于由权利要求I或2所述的光合细菌菌株按2 5%的接种量采用LB液体培养基培养而得。
5.一种促进蔬菜生长的方法，其特征在于将权利要求4所述的液体菌肥施用于种植蔬菜的PH为4. 0-10. 0的土壤中。
6.如权利要求5所述的促进蔬菜生长的方法，其特征在于所述蔬菜为生菜、番茄或辣椒。
全文摘要
本发明涉及一种光合细菌菌株及其应用。所述细菌为胶状红长命菌(Rubrivivaxgelatinosus)sbg11，于2012年5月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.6085，其16SrDNA序列如SEQ ID NO:1所示。所述的光合细菌菌株能够显著地提高蔬菜的产量及品质，可广泛地应用于各种蔬菜。在经本发明的细菌处理后，生菜、番茄、辣椒等蔬菜的产量及品质都有了显著提高。
文档编号C12R1/01GK102796687SQ201210302180
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月23日 优先权日2012年8月23日
发明者黄秋生, 彭桂香, 杨芳, 刘光华, 谭志远, 田俊岭 申请人:广东凯利生物科技有限公司, 华南农业大学