专利名称：一种离子体注入孢子芽体诱变红霉素产生菌的选育方法
技术领域：
本发明属于生物发酵技术领域，特别是涉及一种离子体注入孢子芽体诱变红霉素产生菌的选育方法。
背景技术：
菌种的强弱直接影响到发酵效价。因此选育出一种优质菌种对于红霉素发酵来说具有非常重要的意义。红霉素产生菌的常规诱变选育方法是先制备一定浓度的孢子悬浮液，孢子悬浮液是将生长至孢子状态保存的斜面用无菌水刮取制成混悬液，然后采用各种物理和化学的诱变剂进行诱变处理。该诱变方法针对孢子进行诱变，由于孢子是菌种在生长繁殖过程中所产生的有繁殖和休眠作用的细胞，它的营养细胞通过细胞壁加厚和积存养料而能抵抗不 良环境条件，因此，通常对菌种的保藏均采用保藏其孢子态的细胞，从而达到稳定保存的目的。但是，也正因为孢子的这种生理特性，致使孢子对诱变剂有一定的抗逆性，从而大大减弱了诱变剂对遗传物质的诱变效应，导致突变率低，无法满足生产需求。
发明内容
本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种可获得较高突变率，诱变方法简便、易控制，且可快速有效地获得高的正突变率，诱变菌种性状稳定的含孢子芽体菌种的诱变选育方法。本发明是基于以下原理而设计I、通过多次试验观察到在一定的培养条件下将孢子培养至刚刚萌发或生长为菌丝体时，孢子在条件发生变化后萌发首先消耗自身储存的养料，从而使细胞壁变薄，且结构发生变化，特别是菌丝体，它的细胞膜通透性增加，故而抗逆性会大大减弱，对诱变剂特别敏感。同时我们也观察到菌丝体对干燥环境和诱变剂都过于敏感，在诱变过程中浓度和死亡率难以控制，不宜操作，容易导致试验失败。2、离子注入微生物诱变选育是核技术应用于生物研究，进行物理科学与生命科学交叉学科研究的典型范例，其作用机理是高能量离子体对生物体有两个沉积作用，即能量沉积和质量沉积。能量沉积指注入的离子与生物体大分子发生一系列碰撞并逐步失去能量，而生物体大分子逐步获得能量进而发生键断裂，原子被击出位，生物大分子留下断键或缺陷的过程。质量沉积即注入的离子与生物大分子形成新的分子。这两种双重作用，从而使生物体产生死亡，引起自由基间接损伤，染色体重复、易位、倒位或使DNA分子断裂、碱基缺失等多种生物学效应。所以，离子注入诱变可得到较高的突变率，且突变谱广、死亡率低、正突变率高、性状稳定。本发明正是利用菌种自身生理生化特点，结合离子注入诱变得到红霉素产生菌，具体为
一种离子体注入孢子芽体诱变红霉素产生菌的选育方法，其特征是将培养好的红色糖多孢菌孢子芽体采用离子注入诱变方法诱变。上述红色糖多孢菌孢子芽体的培养过程为首先制备孢子悬浮液，用灭菌的滤纸过滤，收集过滤孢子液，然后在过滤孢子液中加入S培养液，在34 37°C条件下培养13 15小时，观察计数有70 80%的孢子发芽则终止培养，离心收集孢子芽，用无菌生理盐水洗涤，等体积悬浮。所述S培养基配比为葡萄糖I %，蛋白胨0.4%，酵母膏0.4%，MgSO4. 7H20O. 05%, KH2PO4 O. 2%, K2HPO4O. 4%，以 g/100ml H2O 计。所述离子注入诱变采用N离子注入机实现。 所述离子注入诱变具体为将培养好的红色糖多孢菌孢子芽体放置在空白培养皿内涂布均匀风干，然后放置到N离子注入机中，抽真空，真空度达5*10_4Pa时，充入氮气，力口速电压达20KV起弧进行真空环境的离子注入诱变5 500秒。离子注入诱变后，先加无菌水洗脱，稀释后涂平板培养，挑选形态标准的单菌落试管斜面培养，摇瓶培养，发酵培养，检测发酵效价，初筛留种。本发明采用将离子体注入孢子芽体诱变红霉素产生菌，可得到较高的突变率，并且可快速有效地获得正突变率高的红霉素菌株，将该菌株稳定纯化，用于生产可有效提高生产效益。
具体实施例方式I选育的步骤出发菌株(挑选生产使用菌株红色糖多孢菌saccharopolysporaerythraea)，孢子萌发培养，孢子芽体的收集，离子注入诱变，分离培养，挑取单菌落接斜面，摇瓶考察，发酵培养，实验数据统计分析，初筛留种。2诱变筛选过程2. I挑选大生产使用的生长饱满的工作细胞库斜面，加入30ml无菌水，用接种环刮取孢子，将其悬浮在无菌水中，制成混合均匀的孢子悬浮液。用灭菌的滤纸进行过滤，收集过滤孢子液备用。2. 2孢子萌发培养。2. 2. I孢子芽体的生理特点。孢子萌发是先吸水膨胀，然后长出芽管，孢子萌发以芽管长度超过孢子直径一半为萌发标准。我们统计了孢子的萌发率和萌发时间。使用S培养液(使用S培养基的标准配比液，其配比以g/100ml H2O计，葡萄糖I %，蛋白胨0.4%，酵母膏 0. 4%,MgSO4. 7Η200· 05%，KH2PO4 0. 2%, K2HPO4 0. 4% )培养实验菌种，其萌发率一般在80%，孢子萌发的时间为13 15小时。2. 2. 2孢子芽体的培养。准确吸取5ml过滤孢子液加入25ml的S培养液中，在35°C摇瓶柜内振摇培养至13 15小时，观察计数约有70 80%的孢子发芽则终止培养。2. 2. 3离心收集孢子芽体。将培养好的发芽孢子的S液吸入离心管内2000转离心沉降，用无菌生理盐水洗涤3遍，等体积悬浮。2. 2. 4孢子芽体的离子注入诱变的处理。吸取一定量的孢子芽体悬浮液放置在90mm的空白培养皿内涂布均匀风干，打开离子机真空箱体，放置培养皿开盖，关上箱体门，对小靶室进行抽真空，真空度达到5*104Pa时，开充气阀，充入氮气，调节各模块参数稳定起弧后，加速电压达20KV起弧进行真空环境的离子注入诱变5 500秒，操作结束，取出平板，用无菌水进行洗脱，将洗脱的悬浮液稀释涂平板进行培养(琼脂培养基)。培养至6 8天后，观察菌落生长成熟(有明显的形态分化)后，将其终止培养，放置在冷藏箱内保存备用。3摇瓶筛选过程。取出保存备用的分离平板，挑选分离平板上生长的形态标准的单菌落接试管斜面(琼脂培养基)，放置在恒温室内培养，培养成熟后冷藏，配置摇瓶培养基(黄豆饼粉2. 5 %、糊精2. O %、葡萄糖I. 90 %、碳酸钙O. 5 %、硫酸铵0.1%、玉米浆1.2%、磷酸二氢钾O. 04%，以g/100mlH20计)，进行摇瓶接种，将生长成熟的摇瓶种子培养液移种到发酵摇瓶培养基(同摇瓶培养基)内进行发酵培养，检测发酵摇瓶效价单位，初筛留种。4使用设备的特点。
4. I该N离子注入设备的设计采用双潘宁工作原理。具有会切磁场的双潘宁源产生的N离子经过磁场和放电室几何结构的双重约束，并且离子运动路程加长，增加了离子间的碰撞几率，使得离子的能量均一，离子密度提高，且离子的运动方向基本一致。4. 2该设备采用氮气为离子源。因为N离子为DNA碱基的重要元素之一，N离子注入不仅可以直接引起碱基分子结构的变化，还可以参与细胞结构的重组和修复。所以使我们的离子注入诱变可得到较高的突变率，且突变谱广、死亡率低、正突变率高、性状稳定。4. 3该设备离子注入在真空腔室内进行，模仿太空环境。本次试验获得3株菌株提高率在15%以上。初筛摇瓶结果如下
菌株编号效价(u/ml)平均值(u/ml)对照(u/ml) 提高率％
^5532~ 49996082 5538477116. 076
O
~36# 5586 5423 5509 5506477115.41^
103# 4822 4986 5036 4948419218.0权利要求
1.一种离子体注入孢子芽体诱变红霉素产生菌的选育方法，其特征是将培养好的红色糖多孢菌孢子芽体采用离子注入诱变方法诱变。
2.按照权利要求I所述的离子体注入孢子芽体诱变红霉素产生菌的选育方法，其特征在于上述红色糖多孢菌孢子芽体的培养过程为首先制备孢子悬浮液，用灭菌的滤纸过滤，收集过滤孢子液，然后在过滤孢子液中加入S培养液，在34 37°C条件下培养13 15小时，观察计数有70 80%的孢子发芽则终止培养，离心收集孢子芽，用无菌生理盐水洗涤，等体积悬浮。
3.按照权利要求2所述的离子体注入孢子芽体诱变红霉素产生菌的选育方法，其特征在于所述S培养基配比为葡萄糖1%，蛋白胨O. 4 %，酵母膏O. 4 %,MgSO4. 7H20 O. 05%,KH2PO4O. 2%, K2HPO4O. 4%,以 g/100ml H2O 计。
4.按照权利要求I所述的离子体注入孢子芽体诱变红霉素产生菌的选育方法，其特征在于所述离子注入诱变采用N离子注入机实现。
5.按照权利要求I或4所述的离子体注入孢子芽体诱变红霉素产生菌的选育方法，其特征在于所述离子注入诱变具体为将培养好的红色糖多孢菌孢子芽体放置在空白培养皿内涂布均匀风干，然后放置到N离子注入机中，抽真空，真空度达5*10_4Pa时，充入氮气，力口速电压达20KV起弧进行真空环境的离子注入诱变5 500秒。
6.按照权利要求5所述的离子体注入孢子芽体诱变红霉素产生菌的选育方法，其特征在于离子注入诱变后，先加无菌水洗脱，稀释后涂平板培养，挑选形态标准的单菌落试管斜面培养，摇瓶培养，发酵培养，检测发酵效价，初筛留种。
全文摘要
本发明涉及一种离子体注入孢子芽体诱变红霉素产生菌的选育方法，其特征是将培养好的红色糖多孢菌孢子芽体采用离子注入诱变方法诱变。本发明采用将离子体注入孢子芽体诱变红霉素产生菌，可得到较高的突变率，并且可快速有效地获得正突变率高的红霉素菌株，将该菌株稳定纯化，用于生产可有效提高生产效益。
文档编号C12R1/645GK102851276SQ201210308738
公开日2013年1月2日 申请日期2012年8月28日 优先权日2012年8月28日
发明者李学兵, 郭惠芬, 陈荔, 杨玉芳, 蒋鸿 申请人:宁夏启元药业有限公司