专利名称：一种低聚糖Lewis X的酶催化制备方法
技术领域：
本发明涉及低聚糖类化合物的酶催化制备方法，具体地说是lewis X(Gal-β -1，4-(Fuc-a-1, 3)-GlcNAc)的制备方法；该化合物的唾液酸衍生物SLex是细胞表面糖脂和糖蛋白的终端寡糖，在细胞相互识别作用中起至关重要的作用。
背景技术：
Lewis X是一个岩藻糖化的三糖抗原，广泛分布于真核生物和某些细菌的细胞表面，是一个具有多种功能的聚糖，在许多生理和病理过程中发挥重要的作用。例如，唾液酸化的Lewis X,这个四糖表达于白血细胞如粒细胞和单核细胞,这种聚糖与多种肿瘤包括胰 腺癌、乳腺癌、结肠癌和肺癌等组织来源密切相关。含有Lewis X的聚糖还发现于具有传染性的细菌幽门螺旋杆菌和寄生血吸虫。已有文献报道了 Lewis X的化学合成方法，由于糖分子中存在多个性质相似的羟基基团，同时糖苷键在形成过程中还可以产生a和β两种异构体因此糖的合成化学中两个最基本的问题一直是控制反应的区域选择性和立体选择性。因此，该合成方法收率很低，不适合于大规模生产。
发明内容
本发明的目的在于利用酶催化的方法来提供一种简易、有效的低聚糖lewis X的制备方法。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案实现
本发明制备lewis X的方法,其制备过程为
QRzBr
pyridine BzO0 82AcOH β ￡ΟΒζ
14
31) (BnO)2POO-Et3NH+
2) H2, P d/C; cycloh&tylamine
GMP-morphoIjclste QP O3 ηο「οη ·-
HO ■
GDP-p-L-FucoseS
0^0H0uOH,CH
H0^v00^V-°H
-yt!-■■■■■■■.1.5h I NHAc
a-1,3 fu cosy Itransf erase
Im
HOm
I Lewis X即第一步以岩藻糖(化合物2)为原料，在吡啶条件下与苯乙酰氯反应，生成苯乙酰基保护的岩藻糖(化合物3);第二步，化合物3在溴化氢和乙酸条件下反应得到1-溴代产物(化合物4);第三步，化合物4与磷酸二苄酯三乙胺盐反应，然后在pd-C/氢化条件下脱除苄基生成1-磷酸岩藻糖(化合物5);第四步，化合物5与GMP-吗啡啉酯反应，吗啡啉酯反应生成⑶P-L-岩藻糖(化合物6);第四步，化合物5在α -1，3-岩藻糖基转移酶的作用下与N-乙酰化乳糖胺(化合物7)反应得到Lewis X (化合物I)。所述第一步中，保护基试剂为乙酸酐、乙酰氯、或苯乙酰氯，其中优选苯乙酰氯；所述第一步中的溶剂为吡啶。所述第一步中苯乙酰氯摩尔用量与岩藻糖的摩尔量之比为5-1 ;反应温度为0°C ;反应时间为10-15小时，通常在12小时反应完成。所述第二步中，溴化试剂为氢溴酸的乙酸溶液；所用溴化氢摩尔用量与化合物4的摩尔量之比为3-1 ；反应温度为0°C ;反应时间为3-5小时,通常在4小时反应完成。所述第三步反应中，磷酸化试剂为磷酸二苄酯三乙胺盐；所述第三步反应中磷酸 化试剂的摩尔用量与化合物4的摩尔量之比为1.2-1 ;反应温度为0°C;反应在氩气条件下进行，反应时间为15小时。所述第三步反应中脱保护试剂为pd/C/H2和环己胺。所述第四步反应中，生成⑶P-fucose的试剂为GMP-吗啡啉酯，所述反应在吡啶中进行；所述第四步反应中GMP-吗啡啉酯的摩尔用量和化合物5的摩尔用量之比为O. 7-1 ；所述第四步反应中，反应温度为室温，通常在3-4天反应完成。所述第五步反应中，生成Lewis X的试剂为N-乙酰化乳糖胺，所述反应的催化剂为α -1, 3-岩藻糖基转移酶；所述反应在Tris-HCl缓冲溶液中进行；所述反应温度为37°C;所述反应时间为3-5小时。本发明的优点在于化合物I的化学合成步骤很长，并且收率很低，本发明通过一条全新的合成路线，以廉价易得的岩藻糖为原料，经过多步反应生成岩藻糖在生物体内的通用给他GDP-岩藻糖，然后在α -1, 3-岩藻糖基转移酶的作用下与N-乙酰化乳糖胺反应可以很方便的得到Lewis X。
具体实施例方式下面通过具体的实施方式，对本发明做详细的描述，但本发明不限于这些实例本身。一、化合物3的制备
L-岩藻糖(化合物2,4. O g, 24. 4 mmol)溶于卩比唳中(50 mL),搅拌下缓慢滴加苯乙酰氯(17. 2 g，122 mmol )，室温搅拌反应过夜。TLC检测反应完全后将混合物倒入冰水中，用二氯甲烷(100 mL)稀释，分别用盐酸(4 N)和饱和碳酸氢钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥后浓缩得化合物糖浆状化合物3 (15 g)。二、化合物4的制备
将上述粗产物溶于乙酸(16 mL)中，用冰浴冷却，加入溴化氢的乙酸溶液(16 mL)，混合物在室温下搅拌反应4小时。混合物用二氯甲烷(100 mL)稀释，然后用冰水和饱和碳酸氢钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥后浓缩得到1-溴代岩藻糖(化合物4yHNMR (CDCl3,400 MHz) δ 3. 80 (d, / = 6. 5 Hz, 3H), 4. 50 (dt, / = 6. 5,1. 0 Hz, 1H)，5. 63 (dd,J = 14. 0, 10. 4 Hz, 1H), 5. 85 (dd, / = 3. 4,1. 0 Hz, 1H)，6. 02 (dd, J = 10. 5, 3.5Hz, 1H), 6. 94 (d, / = 4. Ο, 1H)，7. 23-7. 65 (m, 15H)。三、化合物5的制备
化合物4(15 g)溶于干燥的二氯甲烷中，加入4A分子筛，搅拌15分钟。加入磷酸二苄酯三乙胺盐(25. 2 mmol)的二氯甲烷(15 mL)溶液和碳酸银(8. 2 g，29. 7 mmol)。混合物在氮气保护下搅拌反应2小时，过滤后浓缩。粗产物用硅胶柱提纯得浆状中间体(12.1 g，收率73%)。上述中间体溶于甲苯(100 mL)中，加入吡啶(20 mL)和三乙胺(15 mL)，然后加入Pd-C (10%，700 mg)，通氢气反应5小时，过滤后浓缩得到泡沫状产物12. 2 g。上述产物溶于甲醇中(40 mL)，加入环己基胺(40 mL)，加热至回流反应4小时。反应完全后浓缩，除产物溶于水中，用氯仿萃取三次，水相浓缩、干燥，得白色化合物5 (6.3 g，收率63%)。1HNMR(D20,400 MHz) δ1. 07 (m, 2H)，1. 16 (d, / = 6. 8 Hz, 3H)，1. 24 (m, 8H)，1. 55 (m,2H),1. 70 (m, 4H),1. 88 (m, 4H)，3. 04 (m, 2H)，3. 41 (dd, /=9.9，7. 8 Hz, 1H)，
3.57 (dd, /=9.9，3.5 Hz, 1H)，3. 62 (dd, /=3.5，O. 9 Hz, 1H)，3. 71 (m, 1H)，
4.73 (t, /= 5.1 Hz, 1H)。四、化合物6的制备
化合物5 (3. 7 g)溶于吡啶(10 mL)中，氮气保护下加入GMP-吗啡啉酯(4. 3 g)的吡啶(10 mL)溶液，反应用核磁监控，反应结束后浓缩，残余物溶于少量水中，然后用交联葡聚糖柱G-1O (50*2.5 cm)分离，得到浆状⑶P-岩藻糖的锂盐(1. 44 g，收率43%)。1HNMR (D2O,400 MHz) δ1. 14 (d, / = 6. 7 Hz, 3H), 3. 48 (dd, J = 10. O, 7.9 Hz, 1H)，3. 58 (dd,J = 10. O, 3. 4 Hz, 1H)，3. 63 (m, 1H)，3. 69 (m, 1H)，4. 16 (m, 2H)，4. 27 (m, 1H)，
4.44 (dd, / = 4. O, 3.4 Hz, 1H)，4. 65 (t, / = 5. 5 Hz, 1H)，4. 84 (t, / = 8. O Hz,1H), 5. 81 (d, /= 5.8 Hz, 1H)，8. O (s, 1H)。FABMS: m/z 594 [M-Li]'四、化合物I的制备
化合物6 (O.1 mmol)溶于Tris-HCl缓冲溶液(5 mL, IOOmM, pH 7. 5)，加入N-乙酰化乳糖胺(化合物7,0.1 mmol),硫酸猛(20 mM) ( α-1，3-岩藻糖基转移酶(2 units),反应混合物在37V反应3-4小时。加入乙醇终止反应， 离心除去不溶物，浓缩除去乙醇，水相冻干后用Bio-GelP2胶分离，冻干后得到产物501 mg，收率95%。MALD1-TOF MS C20H35NO15(529.48) (m/z), 568 [M+K]+。
权利要求
1.一种低聚糖lewis X的酶催化制备方法，以L-岩藻糖为原料，包括如下步骤(a)、L-岩藻糖用苯乙酰基保护羟基；(b)、苯乙酰基保护的L-岩藻糖与溴化氢作用生成1-溴代岩藻糖；(c)、l-溴代岩藻糖与磷酸二苄酯三乙胺盐反应，然后在Pd-C/氢化条件下脱除苄基生成1-磷酸岩藻糖；(d)、l-磷酸岩藻糖中间体脱除苯乙酰基保护基后与GMP-吗啡啉酯反应，吗啡啉酯反应生成⑶P-L-岩藻糖；Ce),⑶P-L-岩藻糖在α -1, 3_岩藻糖基转移酶的作用下与N-乙酰化乳糖胺反应得到 Lewis X0
2.根据权利要求1所述的一种低聚糖lewisX的酶催化制备方法，其特征在于步骤 Ca)中的保护基为苯乙酰基，所用试剂为苯乙酰氯，反应溶剂为吡啶，所述保护反应温度为 (TC，所述保护反应时间为7-12小时。
3.根据权利要求1所述的一种低聚糖lewisX的酶催化制备方法，其特征在于步骤(b)中的溴代反应在乙酸中进行，所用的溴代试剂为溴化氢，所述溴代反应温度为室温，所述硝化反应时间为3-5小时。
4.根据权利要求1所述的一种低聚糖lewisX的酶催化制备方法，其特征在于步骤(c)中1-溴代岩藻糖与磷酸二苄酯三乙胺盐反应在干燥的二氯甲烷中进行，所述反应的试剂为碳酸银，反应温度为0°C ;
5.根据权利要求1所述的一种低聚糖lewisX的酶催化制备方法，其特征在于步骤 Cd)中1-磷酸岩藻糖与GMP-吗啡啉酯反应在干燥的吡啶中进行，所述反应温度为室温，反应时间为7-12小时；
6.根据权利要求1所述的一种低聚糖lewisX的酶催化制备方法,其特征在于步骤(e)中生成三聚糖Lewis X的反应在Tris-HCl缓冲溶液中进行，所述反应所用的酶为 α-1，3-岩藻糖基转移酶，所述反应温度为37°C ；
7.根据权利要求1所述的一种低聚糖lewisX的酶催化制备方法，其特征在于步骤(e)中生成三聚糖Lewis X产物通过Bio-Gel P2色谱柱提纯。
全文摘要
本发明涉及低聚糖类化合物的酶催化制备方法，具体地说是lewis X(Gal-β-1,4-(Fuc-α-1,3)-GlcNAc)的制备方法；该化合物的唾液酸衍生物SLex是细胞表面糖脂和糖蛋白的终端寡糖，在细胞相互识别作用中起至关重要的作用。其以L-岩藻糖为原料，经过保护，1-位磷酸化，然后与GMP-吗啡啉酯反应生成岩藻糖的通用给体GDP-L-岩藻糖；GDP-L-岩藻糖在α-1,3-岩藻糖转移酶的作用下与N-乙酰化乳糖胺反应得到Lewis X。该方法工艺简便，借助转移酶的作用，以简单易得的糖为原料，立体专一性的得到三聚糖Lewis X。
文档编号C12P19/18GK102994590SQ20121030866
公开日2013年3月27日 申请日期2012年8月28日 优先权日2012年8月28日
发明者胡天顺, 林海平 申请人:苏州格兰斯生物科技有限公司