专利名称：一种微紫青霉菌的筛选方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及真菌的筛选方法及其应用，尤其涉及微紫青霉菌(Penicilliumjanthinellum)的筛选方法及其应用。
背景技术：
砷是一种在自然界广泛存在的有毒并且致癌的类金属元素，砷污染已成为全球危害十分严重的环境问题之一。据报道，全球至少5000多万人口正面临着地方性砷中毒的威胁，其中大多数为亚洲国家。中国是受砷中毒危害最为严重的国家之一，在1956-1984年二十多年间，全国曾发生过30余起砷中毒事件。我国又是砷矿大国，砷矿广泛分布在中南和西南部的湖南、云南、广西、广东等省区，砷矿开采或冶炼，含砷农药、化肥等农资产品的过量投入等，可成土壤中砷的累积，进而影响着植物、动物的生长和发育，而且还可以通 过食物链进入人体，对人类的生存和健康构成威胁。目前常用的砷污染土壤修复方法包括土壤改良剂法、溶土法、排土法、化学冲洗法以及生物修复技术。生物修复技术是利用生物(主要是植物和微生物)作用来消减、净化土壤中的砷或改变砷的形态，被普遍认为是砷污染治理中最具应用前景的技术。其中利用超积累植物去除土壤砷的植物修复技术在最近的几年取得了突破性的进展，蜈蚣草(Brakefern，Pteris vitta)和大叶井口边草(Pteris nervosa)等超积累砷的植物相继被发现,并用于砷污染地区的土壤修复。在重金属污染土壤的生物修复技术中，除了应用超积累植物吸收富集金属外，利用植物、微生物将重金属转化为易挥发的有机化合物，使其逸散到大气中，从而去除土壤中的重金属，也逐渐引起了研究者的重视。如Terry等利用微生物和植物的作用，将环境中的硒(Se)转化为生物毒性较低的气态形式(二甲基硒和二甲基二硒)，直接或通过植物的组织使其挥发到大气中。Meagher等将细菌体内的汞(Hg)还原酶基因转入芥子科植物Arabidopsis后,得到的转基因植物能耐受、吸收土壤环境中的Hg,并将Hg2+还原成Hgtl后挥发进入大气。土壤中的砷化合物也可以转变为气态的甲基砷等物质，在多个圈层中迁移和转化。因此，利用某些微生物的对砷的富集、利用和转化、挥发等功能，将種累积到生物体内或将其形成易挥发态砷化合物，已成为潜在的土壤砷污染修复技术之一。目前国内报道的对砷具有挥发能力的真菌还没有，国外报道也屈指可数，且大多还只是局限于理论上和实验室的研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种微紫青霉菌的筛选方法，将微紫青霉菌应用于治理砷污染的土壤中以及减少砷在作物及农产品中的累积。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种微紫青霉菌的筛选方法，包括采集砷污染土壤样品，在实验室内从该土壤样品中分离出真菌，在固态PGP培养基上将分离出的真菌与浸有不同浓度砷的滤纸片作用，将该真菌纯化培养后，进行显微镜镜检分析，观察该真菌在不同浓度砷胁迫下的菌落生长状况，由此筛选出微紫青霉菌。该微紫青霉菌Penicillium janthinillum已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址标注在后)保存，保存编号为CGMCC No. 3187，保存日期为2009年7
月9日。优选地，该方法具体包括将土壤样品经梯度稀释后涂布于砷含量为400 600mg/L的马丁培养基上分离出真菌；将分离出的真菌经反复纯化、培养后，取直径为8 10_的圆形真菌菌块或边长为8 IOmm的方形真菌菌块放于所述PGP培养基上，在距该菌块为I 3cm处分别放置浸有不同浓度砷溶液的直径为2 4mm的圆形滤纸片，砷浓度的范围设置为1000 IOOOOmg/L ;将所述PGP培养基于24 26°C下培养5天后，通过观察菌株的生长情况筛选出微紫青 霉菌。优选地，马丁培养基的成分包括葡萄糖、蛋白胨、KH2P04、MgSO4 · 7H20、琼脂以及水，各成分的重量比为24 8 2 I 60 4000 ；PGP培养基的成分包括马铃薯、葡萄糖、蛋白胨以及水，各成分的重量比为60 8 I 400。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种微紫青霉菌对砷的抗性的鉴定方法，包括在室内培养条件下测定微紫青霉菌对砷的生物累积与挥发能力，以及在含有不同浓度砷的溶液的培养条件下微紫青霉菌生物量的变化，由此鉴定微紫青霉菌对砷的抗性。优选地，在室内培养条件下测定微紫青霉菌对砷的生物累积与挥发能力，具体包括配制总砷含量为50mg/L的PGP培养基，在120 125°C下灭菌14 17分钟后，接入O. Iml微紫青霉菌生物量为104cfu/ml的菌悬液，培养温度为24 27°C，转速为138 142rpm,培养5天后，以3800 4200rpm转速进行离心处理8 12分钟，用超纯水反复清洗菌质4次，洗掉残留的培养基，将该菌质于48 52°C下烘干至恒重，然后对所述菌质称重，用11 13ml体积比为4 6 I的HN03、HClO4混合液在158 162°C条件下将该菌质消煮10小时，采用原子荧光测定该菌质中的总砷含量；将离心出的培养液及清洗该菌质的超纯水混合后作为上清液采用原子荧光测定总砷含量；菌质中的总砷含量作为微紫青霉菌对砷的生物累积量，微紫青霉菌对砷的挥发量=配置的总砷含量-菌质中的总砷含量-上清液中的总砷含量。优选地，参照在总砷含量为50mg/L的PGP培养基中接入微紫青霉菌的处理，分别以在所述总砷含量为50mg/L的PGP培养基中不接入微紫青霉菌处理以及在PGP培养基中接入微紫青霉菌而不配置砷含量的处理作为对照，对每项处理均重复多次。优选地，在室内条件下测定在含有不同浓度砷的溶液的培养条件下微紫青霉菌生物量的变化，具体包括配制总砷含量范围为O 200mg/L的PGP培养基，在120 122°C温度下灭菌14 16分钟后，将生长速率相同的8 IOmm微紫青霉菌菌块分别加入以上处理中，于摇床上温度为23 27°C，转速为138 142rpm振荡培养；培养5天后，培养液以3800 4200rpm离心8 12分钟，并采用稀释梯度法计数菌悬液中的孢子数目，即表达微紫青霉菌生物量；用超纯水反复清洗菌质4次，洗掉残留的培养基后，将该菌质于48 52°C下烘干至恒重，然后称量该菌质重量，即微紫青霉菌生物量重量。优选地，不同的总砷含量的相应的处理均重复多次。优选地，该方法还包括观察随着培养溶液中总砷含量的增加微紫青霉菌的生物量的变化趋势，并观察微紫青霉菌的生物量最高的总砷含量，由此确定所述微紫青霉菌表现出较强的对砷生物累积与挥发的总砷含量范围。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种微紫青霉菌在砷污染土壤治理以及降低砷在作物及农产品中累积方面的应用。通过本发明对微紫青霉菌的筛选，可以制成相应的微生物修复制剂，将制得的微 生物修复制剂应用在污染土壤或环境中后，通过该微紫青霉菌对砷的富集和挥发作用，在一定程度上降低土壤中砷的含量，特别是降低土壤中有效砷的含量，从而保证作物正常生长，并使作物及农产品中砷的含量达到无公害农产品要求。
图I为用本发明的方法筛选和培养出的微紫青霉菌在浸有不同浓度砷的滤纸片作用下的菌落生长情况；图2为微紫青霉菌在不同砷浓度水平下的生长曲线图。
具体实施例方式本发明提供的微紫青霉菌的筛选和培养方法，包括从砷污染的土壤中分离真菌，经纯化培养后，利用显微镜镜检。同时，观察分离出的真菌在不同浓度砷胁迫下菌落的生长状况，由此筛选出耐砷能力强的微紫青霉菌；在室内培养条件下观察分离出的微紫青霉菌对砷的累积和挥发能力。对培养、筛选出的微紫青霉菌接种于不同浓度砷胁迫下的固态PGP平板中，观察微紫青霉菌在不同浓度砷胁迫下的菌落生长状况。与其它真菌相比，微紫青霉菌在砷含量为10000mg/L的条件下仍然具有很好的生长状况，表明该真菌对砷具有良好的耐性。随后进行的微紫青霉菌对砷的挥发量测定实验表明，当对该微紫青霉菌培养时间为5天，且在培养基中加入的砷浓度为50mg/L时，该微紫青霉菌对砷的生物挥发量达到142. 195 μ g。实验说明该微紫青霉菌对砷具有较强的转化与挥发能力，即能将砷酸盐转化为气态的砷化物，能够应用于砷污染土壤的生物修复过程中，从而减少砷在作物及农产品中的累积。以下结合附图和优选实施例对本发明的技术方案进行详细地阐述。以下实施例仅用于说明和解释本发明，而不构成对本发明技术方案的限制。以下所有实施例中，砷均以Na3AsO4 · 12H20的形式加入培养基中。实施例I微紫青霉菌的分离、筛选和培养从砷污染区采集污染土壤样品，用塑料袋装好并运回实验室，在含砷的固态PGP培养基(土豆-葡萄糖-蛋白胨培养基)上从该土壤样品中分离出真菌，经划线法纯化培养后，进行电子显微镜镜检分析，由此筛选出微紫青霉菌。具体包括步骤上述砷污染土壤样品来自湖南石门地区雄黄矿附近的矿渣堆积处，将该土壤样品运回实验室后，经梯度稀释并涂布于砷含量为400 600mg/L的马丁培养基上分离出真菌，该马丁培养基的成分包括葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4, MgSO4 · 7H20、琼脂以及水，其重量比为24 8 2 I 60 4000。将分离出的真菌挑取少量菌丝，于不含砷的PGP培养基上利用连续划线法纯化培养3-5天，该过程重复2次。同时，制备显微镜检样品，利用电子显微镜观察菌丝的体形态、分生以及厚垣孢子萌发，筛选出具有较高抗砷能力的微紫青霉菌菌株。该微紫青霉菌Penicillium janthinillum已在中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心保存，保存编号为CGMCC No. 3187，保存日期为2009年7月9日。中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，电话为010-64807355，电子由[H牛为 cgmccisun. im. ac. cn。实施例2不同浓度砷胁迫下微紫青霉的菌落生长状况将分离出的真菌经反复纯化、培养后，取直径为8 IOmm的圆形菌块或边长为8 IOmm的方形菌块置于PGP培养基上，在距该菌块为I 3cm处分别放置浸有不同浓度砷溶液的直径为2 4mm的圆形滤纸片，砷浓度分别设置为1000、3000、5000、10000mg/L。将PGP培养基于24 26°C下培养5天后，观察菌株的生长情况。PGP培养基成分包括马铃薯、葡萄糖、蛋白胨以及水，各成分的重量比为重量比为60 8 I 400。将微紫青霉菌与分离的其它真菌相比较，在砷含量为10000mg/L的条件下仍然具有很好的生长状况。如图I所示，在图I中A为分离出的微紫青霉菌，其菌丝将浸有浓度为10000mg/L砷的滤纸片完全覆盖；B、C、D分别为编号为SM-5F7、SM_5F9、SM_5F1的对照真菌在浸有不同浓度砷的滤纸片作用下的菌落生长状况。实施例3微紫青霉菌对砷的挥发功能的测定实验配制总砷含量为50mg/L的PGP培养基，在120 125°C下灭菌14 17分钟后，接入0. Iml微紫青霉菌含量为104cfu/ml的菌悬液，培养温度为24 27°C、转速为138 142rpm条件下培养5天后，以3800 4200rpm的转速进行离心处理8 12分钟，用超纯水反复清洗菌质4次，洗掉残留的培养基，将该菌质于48 52°C下烘干至恒重，然后对该菌质称重，用11 13ml体积比为4 6 I的HN03、HClO4混合液在158 162°C条件下将该菌质消煮10小时，采用原子荧光测定该菌质中的总砷含量；将离心出的培养液及清洗该菌质的超纯水混合后作为上清液也采用原子荧光测定其内总砷含量。以菌质中的总砷含量作为微紫青霉菌对砷的生物累积量，用下述公式计算微紫青霉菌对砷的挥发量微紫青霉菌对砷的挥发量=配置的总砷含量-菌质中的总砷含量-上清液中总砷含量。本实验以加入50mg/L砷不加微紫青霉菌,加微紫青霉菌不加砷的处理,对照上述加入50mg/L砷且加微紫青霉菌的处理，各处理均重复3次。该微紫青霉菌表现出了较强的抗砷性能，当培养时间为5天时，其对砷的生物挥发量为142. 195 μ g,如表I所示。表I微紫青霉菌对砷的生物挥发量(平均值土 S. D)
权利要求
1.一种微紫青霉菌的筛选方法，包括 采集砷污染土壤样品，在实验室内从所述土壤样品中分离出真菌，在固态PGP培养基上将分离出的真菌与浸有不同浓度砷的滤纸片作用，将所述真菌纯化培养后，进行显微镜镜检分析，观察所述真菌在不同浓度砷胁迫下的菌落生长状况，由此筛选出微紫青霉菌。
2.按照权利要求I所述的方法，其特征在于，具体包括 将所述土壤样品经梯度稀释后涂布于砷含量为400 600mg/L的马丁培养基上分离出真菌； 将分离出的真菌经反复纯化后，挑取少量真菌的菌丝，于不含砷的PGP培养基上利用连续划线法纯化培养3-5天，该过程重复2次；同时，制备显微镜镜检样品，利用电子显微镜观察所述菌丝的体形态以及分生及厚垣孢子萌发，筛选出具有较高抗砷能力的微紫青霉菌的菌株。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于，所述马丁培养基的成分包括葡萄糖、蛋白胨、KH2P04、MgS04 · 7H20、琼脂以及水，各成分的重量比为24 8 2 I 60 4000 ； 所述PGP培养基的成分包括马铃薯、葡萄糖、蛋白胨以及水，各成分的重量比为60 8 I 400。
4.一种微紫青霉菌对砷的抗性的鉴定方法，包括 在室内培养条件下测定微紫青霉菌对砷的生物累积与挥发能力，以及在含有不同浓度砷的溶液的培养条件下微紫青霉菌生物量的变化，由此鉴定所述微紫青霉菌对砷的抗性。
5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述在室内培养条件下测定微紫青霉菌对砷的生物累积与挥发能力，具体包括 配制总砷含量为50mg/L的PGP培养基，在120 125 °C下灭菌14 17分钟后，接入O. Iml微紫青霉菌生物量为104cfu/ml的菌悬液，培养温度为24 27°C，转速为138 142rpm,培养5天后，以3800 4200rpm转速进行离心处理8 12分钟，用超纯水反复清洗菌质4次，洗掉残留的培养基，将所述菌质于48 52°C下烘干至恒重，然后对所述菌质称重，用11 13ml体积比为4 6 I的HN03、HClO4混合液在158 162°C条件下将所述菌质消煮10小时，采用原子荧光测定所述菌质中的总砷含量；将离心出的培养液及清洗所述菌质的超纯水混合后作为上清液采用所述原子荧光测定总砷含量； 以所述菌质中的总砷含量作为微紫青霉菌对砷的生物累积量，用下述公式计算微紫青霉菌对砷的挥发量微紫青霉菌对砷的挥发量=配置的总砷含量-所述菌质中的总砷含量-所述上清液中的总砷含量。
6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于， 参照在所述总砷含量为50mg/L的PGP培养基中接入微紫青霉菌的处理，分别以在所述总砷含量为50mg/L的PGP培养基中不接入微紫青霉菌处理以及在PGP培养基中接入微紫青霉菌而不配置砷含量的处理作为对照，对每项处理均重复多次。
7.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，在室内条件下测定在含有不同浓度砷的溶液的培养条件下微紫青霉菌生物量的变化，具体包括 配制总砷含量范围为O 200mg/L的PGP培养基，在120 122°C温度下灭菌14 16分钟后，将生长速率相同的8 IOmm微紫青霉菌菌块分别加入以上处理中，于摇床上温度为23 27°C，转速为138 142rpm振荡培养；培养5天后，培养液以3800 4200rpm离心8 12分钟，并采用稀释梯度法计数菌悬液中的孢子数目，即表达所述微紫青霉菌生物量; 用超纯水反复清洗菌质4次，洗掉残留的培养基后，将所述菌质于48 52°C下烘干至恒重，然后称量所述菌质重量，即所述微紫青霉菌生物量重量。
8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于， 不同的总砷含量的相应的处理均重复多次。
9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括 观察随着培养溶液中总砷含量的增加所述微紫青霉菌的生物量的变化趋势，并观察所述微紫青霉菌的生物量最高时的总砷含量，由此确定所述微紫青霉菌表现出较强的对砷生物累积与挥发的总砷含量范围。
10.一种微紫青霉菌在砷污染土壤治理以及降低砷在作物及农产品中累积方面的应用。
全文摘要
本发明提供了一种微紫青霉菌的筛选方法及其应用，其中方法包括采集砷污染土壤样品，在实验室内从该土壤样品中分离出真菌，在固态PGP培养基上将分离出的真菌与浸有不同浓度砷的滤纸片作用，将该真菌纯化培养后，进行显微镜镜检分析，观察该真菌在不同浓度砷胁迫下的菌落生长状况，由此筛选出微紫青霉菌。
文档编号C12N1/14GK102925363SQ201210342620
公开日2013年2月13日 申请日期2012年9月17日 优先权日2012年9月17日
发明者曾西柏, 苏世鸣, 蒋细良, 白玲玉, 李莲芳 申请人:中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所