专利名称：一种hiv-1整合酶链转移反应抑制剂体外筛选方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说是涉及一种Hiv-I整合酶链转移反应抑制剂体外筛选方法。
背景技术：
以整合酶为靶点的HIV-I抑制剂研究发现，针对整合酶3'加工活性的抑制剂在体内抗HIV-I活性较差，而针对整合酶链转移反应活性的抑制剂具有较好的体内抗HIV-I活性，故整合酶链转移反应活性的抑制被认为是抑制剂在体内发挥抗HIV-I活性 的关键(Hazuda DJ, Felock P, Witmer M, Wolfe A, Stillmock K, Grobler JA, EspesethA,Gabryelski L，Schleif W，Blau C，Miller MD. Inhibitors of strand transfer thatprevent integration and inhibit HIV-I replication in cells.Science, 2000, 287(5453):646-650)。目前HIV-I整合酶链转移反应抑制剂体外筛选方法主要有以下两大类I、放射自显影方法Chow根据整合酶链转移反应中病毒DNA与宿主细胞DNA的序列，合成了 4条单链DNA，在其中一条链或者两条链的末端标记放射性同位素32P。4条单链DNA退火后形成供体DNA和靶DNA，在整合酶的作用下发生链转移反应，能够生成一系列特定长度的带有32P标记的DNA，可以通过放射自显影进行检测，从而实现对整合酶的链转移反应活性或待测样品的抑制活性进行评价(Chow SA. In vitro assays for activities of retroviralintegrase. Methods:A Companion to Methods in Enzymology, 1997，12(4):306-317)。该方法的缺点是耗时长、步骤繁琐、通量低、对检测设备及人员要求较高、易产生放射性污染、成本高。2、酶联免疫吸附方法Hazuda等人报道了一种有代表性的酶联免疫吸附方法。该方法是将供体DNA的一个5'端进行磷酸化标记，在靶DNA的两个3'端进行生物素标记；通过碳二亚胺介导供体DNA的5 /磷酸与微孔板表面的仲氨基连接，将供体DNA包被于微孔板上；在整合酶的作用下，供体DNA插入靶DNA中，从而将生物素基团连接于微孔板上；洗板后，用碱性磷酸酶标记的链亲和素检测生物素基团，并利用碱性磷酸酶的特异性显色反应读取信号，从而实现对整合酶的链转移反应活性或待测样品的抑制活性进行评价(Hazuda DJ, HastingsJC, Wolfe AL, Emini EA. A novel assay for the DNA strand-transfer reaction ofHIV-I integrase. Nucleic Acids Research, 1994，22 (6) : 1121-1122)。该方法的缺点是需要包被和封闭微孔板，耗时长；需要使用特殊的微孔板，成本较高。He等人用磁珠吸附DNA技术对此类方法进行了改进，建立了磁珠式HIV-I整合酶链转移反应抑制剂体外筛选方法这种方法是用链亲和素磁珠捕获生物素标记的供体DNA,在整合酶的作用下，供体DNA插入地高辛标记的靶DNA中，从而将地高辛基团连接于微孔板上；洗板后，用碱性磷酸酶或荧光基团标记的抗地高辛抗体检测地高辛基团，并利用碱性磷酸酶的特异性显色反应读取信号或直接读取荧光基团信号，从而实现对整合酶的链转移反应活性或待测样品的抑制活性进行评价(He HQ, Ma XH, Liu B, Chen WZ, Wang CX, ChengSH. A novel high-throughput format assay for HIV-Iintegrase strand transferreaction using magnetic beads. Acta Pharmacologica Sinica，2008，29(3):397-404)。该方法的缺点是显色反应步骤繁琐，检测时间较长，成本较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种步骤简单、快速且成本低廉的HIV-I整合酶链转移反应抑制剂体外筛选方法。本发明所提供的一种Hiv-I整合酶链转移反应抑制剂体外筛选方法，包括以下步骤(I)HIV-I整合酶蛋白及待测化合物样品的制备采用原核表达技术表达并纯化HIV-I整合酶蛋白，分装保存待用，室温下将待测化合物样品用二甲亚砜配制成不同浓度的溶液，充分振荡溶解后备用；(2)供体DNA与靶DNA的制备用灭菌双蒸水分别溶解单链DNA1、单链DNA2、单链DNA3、单链DNA4，将单链DNAl与单链DNA2于避光环境中分别按照等摩尔浓度混匀，于95°C水浴中煮沸3min变性，再缓慢冷却至室温，即退火形成供体DNA，将单链DNA3与单链DNA4于避光环境中分别按照等摩尔·浓度混匀，于95°C水浴中煮沸3min变性，再缓慢冷却至室温，即退火形成靶DNA，单链DNA1、单链DNA2、单链DNA3、单链DNA4的序列如下单链DNAl j’-ACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCA-S'，其中 5’ 端标记生物素
基团，单链DNA2 :5’ -ACTGCTAGAGATTTTCCACACTGACTAAAAG-3'，单链DNA3 :5’ -ATGTGGAAAATCTCTAGCGAT-3’，其中3’端标记异硫氰酸荧光素(FITC)基团，单链DNA4 :5，-ATCGCTAGAGATTTTCCACAT-3，；(3)待测化合物样品的筛选反应在96孔微孔板上进行，微孔板设阴性对照3孔，每孔分别加入5 μ I 二甲亚砜，设阳性对照3孔，每孔分别加入5 μ I 二甲亚砜，但其后所加蛋白为SOOng高温变性后的整合酶蛋白，其他孔中每孔分别加入5μ I不同浓度的待测化合物样品，除阳性对照孔外，每孔均分别加入800ng整合酶蛋白，于37°C孵育20min,再加入I. 5pmol供体DNA和15pmol靶DNA，加入灭菌双蒸水补至总体积50 μ 1，混匀后于37°C孵育lh，再加入10mg/ml的链霉亲和素磁珠I. 5 μ I和51. 5 μ I磁珠结合缓冲液，彻底振荡混匀后于20°C孵育15min，将微孔板置于板式磁珠收集器静置90s，弃上清，并用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液洗磁珠三次，最后用荧光分析仪检测每孔的相对荧光值(RFU)，并计算待测样品的抑制率。按照以下公式计算待测样品的抑制率
权利要求
1. 一种HIV-I整合酶链转移反应抑制剂体外筛选方法，其特征在于包括以下步骤 (1)HIV-I整合酶蛋白及待测化合物样品的制备 采用原核表达技术表达并纯化HIV-I整合酶蛋白，分装保存待用，室温下将待测化合物样品用二甲亚砜配制成不同浓度的溶液，充分振荡溶解后备用； (2)供体DNA与靶DNA的制备 用灭菌双蒸水分别溶解单链DNA1、单链DNA2、单链DNA3、单链DNA4，将单链DNAl与单链DNA2于避光环境中分别按照等摩尔浓度混匀，于95°C水浴中煮沸3min变性，再缓慢冷却至室温，即退火形成供体DNA，将单链DNA3与单链DNA4于避光环境中分别按照等摩尔浓度混匀，于95°C水浴中煮沸3min变性，再缓慢冷却至室温，即退火形成靶DNA ； (3)待测化合物样品的筛选· 反应在96孔微孔板上进行，微孔板设阴性对照3孔，每孔分别加入5 Ul 二甲亚砜，设阳性对照3孔，每孔分别加入5 Ul 二甲亚砜，但其后所加蛋白为SOOng高温变性后的整合酶蛋白，其他孔中每孔分别加入5 Ul不同浓度的待测化合物样品，除阳性对照孔外，每孔均分别加入800ng整合酶蛋白，于37°C孵育20min，再加入I. 5pmol供体DNA和15pmol靶DNA,加入灭菌双蒸水补至总体积50 u 1，混匀后于37°C孵育lh，再加入10mg/ml的链霉亲和素磁珠I. 5 和51. 5 磁珠结合缓冲液，彻底振荡混匀后于20°C孵育15min，将微孔板置于板式磁珠收集器静置90s，弃上清，并用含0. 05%吐温20的磷酸盐缓冲液洗磁珠三次，最后用荧光分析仪检测每孔的相对荧光值，并计算待测样品的抑制率。2、根据权利要求I所述的一种HIV-I整合酶链转移反应抑制剂体外筛选方法，其特征在于用于制备供体DNA与靶DNA单链DNA1、单链DNA2、单链DNA3、单链DNA4的序列如下 单链 DNAl :5’-ACCCTITTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCA-3’，其中 5’ 端标记生物素基团，单链 DNA2 :5’ -ACTGCTAGAGATITTCCACACTGACTAAAAG-3’， 单链DNA3 :5’-ATGTGGAAAATCTCTAGCGAT-3’，其中3’端标记异硫氰酸荧光素基团，单链 DNA4 :5’ -ATCGCTAGAGATITTCCACAT-3’。
全文摘要
本发明涉及一种HIV-1整合酶链转移反应抑制剂体外筛选方法，属于生物技术领域。该方法是用异硫氰酸荧光素(FITC)基团标记靶DNA，通过检测FITC基团的荧光信号来对整合酶的链转移反应活性或待测样品的抑制活性进行评价。现有的HIV-1整合酶链转移反应抑制剂体外筛选方法整个过程至少需要约4h，而本发明方法可将整个筛选过程缩短至2h以内，同时大大降低了筛选成本。
文档编号C12Q1/68GK102851378SQ201210345219
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月17日 优先权日2012年9月17日
发明者刘昕, 刘斌, 李杉, 何红秋, 许先进, 谭建军, 张小轶, 李春华, 王存新 申请人:北京工业大学