专利名称：一种液固双重发酵制备微生态制剂的方法
技术领域：
本发明属于生物工程制备技术领域，涉及一种通过液态发酵和固态发酵制备高浓度蜡样芽胞杆菌固态微生态制剂的方法。
背景技术：
动物微生态学是近20年来发展起来的新兴学科，是研究正常微生物与动物体内环境、动物体与外界环境和正常微生物之间三者的相互关系，以动物体内微生态的平衡与失调等理论为核心，具有细胞学水平和分子水平的生命科学，微生物作为活菌饲料添加剂是微生态学的又一发展。微生态制剂一般又称为微生态调节剂，通过加强肠道微生物区系的屏障作用或通过增进非特异性免疫功能，维持宿主微生态平衡，提高其健康水平。目前，用来做益生素的有益菌种类较多，美国FDA(1989)规定可以饲喂的微生物有43种，我国农业部1999年6月公布的饲料及微生物添加剂也有12种之多，应用较多的为乳酸杆菌、粪链 球菌、酵母菌和芽孢杆菌，蜡样芽孢杆菌为杆状菌体，既能产生具有活性较强的蛋白酶、月旨肪酶和淀粉酶，又能产生具有相当高热稳定性的抗菌活性蛋白，具有抑制动植物病害的能力，是自然界中广泛存在的非致病菌，对人畜无害，不污染环境，因此被广泛应用于饲料、农业、医药保健和食品等各领域；通常所用的蜡样芽孢杆菌是从中国科学院黄海水产研究所引进的，是从健康的海参肠道和周围生活环境中分离筛选出对海参腐皮综合症具有拮抗作用的土著益生菌。现有的固态微生态制剂特别是蜡样芽胞杆菌固态微生态制剂的方法通常有两种工艺技术方案，一种是先进行液态深层发酵，最后加入固态载体吸附，干燥而成；液态发酵培养可得到较纯菌体，但成本高，发酵易受产物反馈控制，难以得到高浓度菌株，其产品的有效菌数含量较低；另一种是常规固态发酵的模式；但现有的这些技术工艺方法普遍存在着工艺步骤复杂，制备成本高，产品收率低、杂菌含量高等缺点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计一种高浓度蜡样芽胞杆菌固态微生态制剂的制备方法，将蜡样芽孢杆菌先进行液态发酵至对数生长期，再配用同重量的固体发酵基质相混合，实现大剂量菌液接种，然后再次进行固体发酵而制得高浓度菌体制剂，所以称之为液固双重发酵制备微生态制剂的方法。为了实现上述目的，本发明的主体工艺步骤包括液体菌液的培养、固体基料的配制和固体基料与液体菌液的混匀三个过程，其具体工艺步骤包括(I)、平板培养蜡样保存菌种划线接种至平板培养基，其培养基配料为大豆蛋白胨3g，NaCl 20g，葡萄糖2. 5g，磷酸氢二钾2. 5g，胰蛋白胨17g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH值为7，121°C灭菌，32°C培养24h ；(2)、试管接种取生长良好、菌落典型的菌株接种10ml，其培养基配料为大豆蛋白胨3g，NaCl 20g，葡萄糖2. 5g，磷酸氢二钾2. 5g，胰蛋白胨17g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH值为7，121°C灭菌，32°C培养40h ；
(3)、三角瓶接种100ml，其培养基同步骤(2)，121°C灭菌，32°C培养36h ；(4)、三角瓶接种1000ml，其培养基同步骤(3)；(5)、IOL种子发酵罐，培养液7. 5L，培养基同步骤(3)，pH值为7，121°C灭菌30分钟，培养温度为32°C，时间为24h，转速150r/min，通气量I. 5m3/h，指每分钟通入单位发酵体积m3的空气体积m3 ；(6)、100L种子发酵罐，培养液75L，培养基按玉米粉160g，豆柏粉30g，硫酸锰30mg，硫酸镁lg，磷酸氢二钠3g，磷酸二氢钠I. 5g，植物油2ml，氯化钠20g，水IOOOml的比例配制，pH值调节至7. 2，121°C灭菌30分钟，培养温度为32°C，时间为24h，转速150r/min，通气量I. 5m3/h ； (7)、2000L发酵罐，培养液为1500L，培养基同步骤(6)，发酵方法同步骤(5)，培养36h。(8)、固体基质为豆柏粉1000kg，蒸煮灭菌，待冷却至32°C时，加入步骤(7)中的发酵液900kg，固体基质重量与液体发酵液重量比为I :1，搅拌均匀后装盘，入无菌培养室，恒温35°C，通风，浅盘发酵54小时，中间翻料3次，发酵结束后提高温度至60°C，加大风量，干燥，粉碎即得固体微生态制剂产品。本发明与现有技术相比，其制备工艺简单，易于控制，不易染杂菌，菌株浓度高，后加工成本低，生产环境友好。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进一步说明。实施例I :制备IOOkg腊样芽胞杆菌微生态制剂(I)、菌种平板培养蜡样菌保存菌，划线平板培养，平板培养基；大豆蛋白胨3g，NaCl 20g，葡萄糖2. 5g，磷酸氢二钾2. 5g，胰蛋白胨17g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH值为7，121°C灭菌，32°C培养 24h ；(2)、试管接种菌液10ml,培养基配制大豆蛋白胨3g, NaCl 20g,葡萄糖2. 5g,磷酸氢二钾2. 5g，胰蛋白胨17g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH值为7，121°C灭菌，32°C培养40h ；(3)、接种三角瓶100ml，培养基及培养方法按照步骤(2)进行；(4)、接种三角瓶IOOOmL,培养基及培养方法按照步骤(3)进行；(5)、接种IOL种子发酵罐，培养液为7. 5L，培养基同步骤(4)，pH值为7，121。。灭菌，等温度降至32°C后接种菌种，培养温度32°C，时间24h，转速为150r/min，通气量为I. 5m3/h ；(6)、200L种子发酵罐，接种发酵液100L，培养基按培养基按玉米粉160g，豆柏粉30g，硫酸锰30mg，硫酸镁lg，磷酸氢二钠3g，磷酸二氢钠I. 5g，植物油2ml，氯化钠20g，水IOOOml的比例配制，pH值调节至7. 2，121°C灭菌30分钟，培养温度为32°C，时间为24h，转速150r/min，通气量I. 5m3/h ;培养制得液体菌液；(7)、固体基料豆柏粉100kg，通蒸汽，121°C灭菌30min，冷却至32°C ;固体基质重量与液体发酵液重量比约为I :1，搅拌均匀后装盘，入无菌培养室，恒温35°c，通风，浅盘发酵54小时，中间翻料3次，发酵结束后提高温度至60°C，加大风量，干燥，粉碎即得蜡样芽胞杆菌固态微生态制剂100kg，测得其活菌浓度I. 6X109cfu/g。实施例2 :培养5吨蜡样芽胞杆菌固态微生态制剂(I)、菌种平板培养蜡样芽孢杆菌划线接种至平板培养基，其培养基配方为大豆蛋白胨3g, NaCl 20g,葡萄糖2. 5g,磷酸氢二钾2. 5g,胰蛋白胨17g,琼脂15g,蒸懼水1000ml，pH 值为 7，121°C灭菌，32°C培养 24h ；(2)、试管接种菌液10ml,培养基配制大豆蛋白胨3g, NaCl 20g,葡萄糖2. 5g,磷酸氢二钾2. 5g，胰蛋白胨17g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH值为7，121°C灭菌，32°C培养40h ；(3)、接种三角瓶100ml，培养基及培养方法按照步骤(2)进行；(4)、接种三角瓶IOOOmL,培养基及培养方法按照步骤(3)进行；·(5)、接种IOL种子发酵罐，培养液为7. 5L，培养基同步骤(4)，pH值为7，121。。灭菌，等温度降至32°C后接种菌种，培养温度32°C，时间24h，转速为150r/min，通气量为
I.5m3/h ；(6)、100L种子发酵罐，接种发酵液75L，培养基按按玉米粉160g，豆柏粉30g，硫酸锰30mg，硫酸镁lg，磷酸氢二钠3g，磷酸二氢钠I. 5g，植物油2ml，氯化钠20g，水IOOOml的比例配制，pH值调节至7. 2，121。。灭菌30分钟，培养温度为32°C，时间为24h，转速150r/min，通气量I. 5m3/h ;培养制得液体菌液；(7),10吨发酵罐，接种发酵液为5吨，培养基按按玉米粉160g，豆柏粉30g，硫酸锰30mg，硫酸镁lg，磷酸氢二钠3g，磷酸二氢钠I. 5g，植物油2ml，氯化钠20g，水IOOOml的比例配制，pH值调节至7. 2，121°C灭菌30分钟，培养温度为32°C，时间为48h，转速150r/min，通气量I. 5m3/h ;培养制得液体菌液；(8)、固体基料豆柏粉5吨，通蒸汽，121°C灭菌30min，冷却至32°C ;固体基质重量与液体发酵液重量比为I :1，搅拌均匀后装盘，入无菌培养室，恒温35°c，通风，浅盘发酵54小时，中间翻料3次，发酵结束后提高温度至60°C，加大风量，干燥，粉碎即得蜡样芽胞杆菌固态微生态制剂100kg，测得其活菌浓度I. 8X109cfu/g。
权利要求
1. 一种液固双重发酵制备微生态制剂的方法，其特征在于包括液体菌液的培养、固体基料的配制和固体基料与液体菌液的混匀三个过程，其具体工艺步骤包括 (1)、平板培养蜡样保存菌种划线接种至平板培养基，其培养基配料为大豆蛋白胨3g,NaCl 20g,葡萄糖2. 5g,磷酸氢二钾2. 5g,胰蛋白胨17g,琼脂15g,蒸懼水1000ml,pH值为 7，121°C灭菌，32°C培养 24h ； (2)、试管接种取生长良好、菌落典型的菌株接种10ml，其培养基配料为大豆蛋白胨3g,NaCl 20g,葡萄糖2. 5g,磷酸氢二钾2. 5g,胰蛋白胨17g,琼脂15g,蒸懼水1000ml,pH值为 7，121°C灭菌，32°C培养 40h ； (3)、三角瓶接种100ml，其培养基同步骤(2)，1211灭菌，321培养36h； (4)、三角瓶接种1000ml，其培养基同步骤(3)； (5 )、IOL种子发酵罐，培养液7. 5L，培养基同步骤(3 )，pH值为7，121 °C灭菌30分钟，培养温度为32°C,时间为24h,转速150r/min,通气量I. 5m3/h,指每分钟通入单位发酵体积m3的空气体积m3 ； (6)、100L种子发酵罐，培养液75L，培养基按玉米粉160g，豆柏粉30g，硫酸锰30mg，硫酸镁lg，磷酸氢二钠3g，磷酸二氢钠I. 5g，植物油2ml，氯化钠20g，水IOOOml的比例配制，pH值调节至7. 2，121°C灭菌30分钟，培养温度为32°C，时间为24h，转速150r/min，通气量I. 5m3/h ； (J)、2000L发酵罐，培养液为1500L,培养基同步骤(6)，发酵方法同步骤(5)，培养36h。
(8)、固体基质为豆柏粉1000kg，蒸煮灭菌，待冷却至32°C时，加入步骤(7)中的发酵液900kg，固体基质重量与液体发酵液重量比为I :1，搅拌均匀后装盘，入无菌培养室，恒温35°C，通风，浅盘发酵54小时，中间翻料3次，发酵结束后提高温度至60°C，加大风量，干燥，粉碎即得固体微生态制剂产品。
全文摘要
本发明属于生物工程制备技术领域，涉及一种通过液态发酵和固态发酵制备高浓度蜡样芽胞杆菌固态微生态制剂的方法，将蜡样芽孢杆菌先进行液态发酵至对数生长期，再配用同重量的固体发酵基质相混合，实现大剂量菌液接种，然后再次进行固体发酵而制得高浓度菌体制剂，称为液固双重发酵制备微生态制剂的方法；其制备工艺简单，易于控制，不易染杂菌，菌株浓度高，后加工成本低，生产环境友好。
文档编号A23L1/30GK102823718SQ201210345078
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月17日 优先权日2012年9月17日
发明者张 浩, 张守富, 徐权汉, 夏伟 申请人:青岛中仁药业有限公司