专利名称：归巢核酸酶I-PfoP3I及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种归巢核酸酶I-Pf0P3I及其编码基因和应用。
背景技术：
蓝藻是所有藻类生物中最简单、最原始的一种。在富营养化水体中，蓝藻大量繁殖引起水华，对生态环境和人类健康造成巨大灾难。除藻技术是水华治理的核心，但迄今为止却没有有效可行的治理方法。生物控藻是综合治理水华蓝藻的一个重要手段。蓝藻病毒(又称噬藻体)是生物控藻技术开发的一个重要方向。但是，目前却没有发现有效控制水华主要蓝藻-铜绿微囊藻的噬藻体。核酶是一类具有自我剪接功能的RNA序列，广泛存在于真核生物的细胞器、细菌以及革兰氏阴性和阳性噬菌体中。但是，在短尾病毒科(如T奇数类噬菌体)中，由于基因组 很小，一般只有几十kb，内含子比较少见。2004年，首次在T7类噬菌体ΦΙ和W31中发现了两个I型内含子。通常情况下，在I型内含子以及某些内含肽的内部会编码归巢核酸酶(HomingEndonuclease, HEase)。这一类酶首先在双链或单链DNA上造成缺口，然后通过同源重组的方式，将内含子序列复制并插入特定位置。归巢核酸酶的主要功能是维持内含子序列的存在和延续，根据结构域不同可以分为五类LAGLIDADG，HNH, His-Cys box, GIY-YIG和ro-(D/E)-XK。具有HNH结构域的酶类共分8个亚家族，HNH型归巢核酸酶属于第二亚家族(subset 2)。subset 2的特点是①由细菌、病毒等基因组内含子编码；②绝大多数核心活性区HNH位于蛋白质的N端；③保守的核心序列为HNN ;④通常只识别并切割内含子插入位点邻近序列。subset 2的作用特点识别并切割不含有内含子的序列；在序列相近的基因组中识别位点具有一定的简并性；切割双链或单链造成3’ /5’突出端，或形成缺口(nick);识别的序列较长14_40bp,因此具有高度的序列特异性(one per genome),这一特点有利于在人类基因治疗中应用。目前NEB公司已经商业化的归巢核酸酶有四种，新型归巢核酸酶的开发有利于人类基因治疗技术的应用。另外，该酶的研究也有助于揭示内含子在基因组中的转移和复制的机理。
发明内容
本发明的目的是提供一种归巢核酸酶I_PfoP3I及其编码基因和应用。本发明提供了一种蛋白质(归巢核酸酶I_PfoP3I)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有归巢核酸酶活性的由序列I衍生的蛋白质。为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表I所示的标签。
表I标签的序列
权利要求
1.一种蛋白质，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有归巢核酸酶活性的由序列I衍生的蛋白质。
2.编码权利要求I所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下I)至5)中任一所述的DNA分子 O序列表的序列2自5’末端第1189-1671位核苷酸所不的DNA分子； 2)序列表的序列2自5’末端第1189-1674位核苷酸所不的DNA分子； 3)序列表的序列2自5’末端第1090-1761位核苷酸所不的DNA分子； 4)在严格条件下与I)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码归巢核酸酶的DNA分子； 5)与I)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码归巢核酸酶的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.权利要求I所述蛋白质在切割DNA分子中的应用。
6.与序列表的序列2自5’末端第1090-1761位核苷酸所不的DNA分子对应的RNA分子。
7.一种抑制细菌增殖的方法，是在细菌中导入序列表的序列2自5’末端第1090-1761位核苷酸所示的DNA分子，从而抑制所述细菌的增殖。
8.—种生产权利要求I所述蛋白质的方法，包括如下步骤培养权利要求4所述重组菌，得到权利要求I所述蛋白质。
9.序列表的序列2自5’末端第1090-1761位核苷酸所不的DNA分子或权利要求6所述RNA分子在自我剪接中的应用。
10.权利要求I所述蛋白质在制备归巢核酸酶中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种归巢核酸酶I-PfoP3I及其编码基因和应用。本发明提供了一种蛋白质(归巢核酸酶I-PfoP3I)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有归巢核酸酶活性的由序列1衍生的蛋白质。本发明还保护序列表的序列2自5’末端第1090-1761位核苷酸所示的DNA分子(I型内含子的编码序列)或与其对应的RNA分子(I型内含子)。本发明提供的归巢核酸酶I-PfoP3I具体特定的切割位点，可用于基因工程。本发明提供的I型内含子可用于抑制细菌增殖。本发明对于生物学领域具有重大价值。
文档编号C12N5/10GK102876644SQ20121034506
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月17日 优先权日2012年8月1日
发明者安成才, 孔双蕾, 付力文, 于祥春 申请人:北京大学