利用Tet-off诱导表达系统高通量筛选HIV-1整合酶抑制剂的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用Tet-off诱导表达系统高通量筛选HIV-1整合酶抑制剂的方法，包括将HIV-1整合酶基因和加强型绿色荧光蛋白基因融合克隆进真核表达载体pTRE-2hyg，通过转染级别的质粒提取试剂盒，抽提pTRE-2hyg-EGFP-IN质粒，用于细胞转染实验，将重组质粒pTRE-2hyg-EGFP-IN转染HeLaTet-OffAdvancedCells，诱导融合蛋白的表达，进行药物筛选，能抑制整合酶细胞核定位的药物判定为阳性结果。本发明利用Tet-off诱导表达系统，针对整合酶-LEDGF/p75靶点，高通量筛选整合酶抑制剂，能稳定可靠的对HIV-1整合酶抑制剂进行筛选，对于整合酶抑制剂的筛选是极大地进步。本发明材料来源广泛，效果显著，重复性好，应用前景好。
【专利说明】利用Tet-off诱导表达系统高通量筛选HIV-1整合酶抑制剂的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于药学领域，特别是一种利用Tet-OfT诱导表达系统高通量筛选Hiv-1整合酶抑制剂的方法。
【背景技术】
[0002]HIV(Human Immunodeficiency Virus)是感染导致 AIDS(AcquiredImmunodeficiency Syndrome)的病毒。自从1981年首次报道以来，HIV已经导致了 3300万人感染，每年有超过250万新增病例。HIV分为HIV-1和HIV-2，但是大部分感染病例是由HIV-1感染引起的。由于缺乏有效的治愈手段，目前唯一可以控制AIDS病情的疗法是HAART (Highly Active Antiretroviral therapy)。然而，HAART 需要多种针对不同革巴点的药物组合同时治疗才有效果。这样的药物组合多由逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂组成。整合酶是HIV完成整合感染的必须酶，通过抑制整合酶的活性，从而阻止HIV病毒的永久感染。目前，共有11个逆转录酶抑制剂被FDA批准上市，有8个蛋白酶抑制剂获准应用于AIDS的治疗。2007年，第一个整合酶抑制剂MK0518被FDA批准上市{Nguyen, 2011)。这为HAART疗法提供了更多选择。整合酶这一新的靶点也为AIDS药物研发带来了新的希望。由于HIV是RNA病毒，平均每2000-5000个碱基中即可产生I个错配，因此，艾滋病毒变异速度非常快，耐药病毒株不断出现，很多HIV感染者面临无药可选的尴尬境地。不断寻求新的抗HIV的药物及作用靶点显得意义重大。相对于逆转录酶和蛋白酶而言，以针对整合酶为靶点，开发抗艾滋病药物的思路很新颖，目前受到普遍关注。HIV-1整合酶(Integrase, IN)大小31kD，来自HIV基因组Pol基因产物的C端。整合酶负责催化病毒基因组整合到人类基因组。这对于病毒的复制非常重要。整合酶全长288aa，有三个结构域:催化核心结构域(Catalytic Core Domain, CCD ),C末端结构域(C-terminal Domain,CTD)和N末端结构域(N-termi.nal domain, NTD) {Ce I Her, 2013)。催化核心结构域负责整合靶点DNA的选择。整合酶通过催化2个反应(3’加工反应和链转移反应)完成整合。第一个反应在细胞质里完成，然后整合酶，病毒DNA和多个细胞因子组成整合前复合物(Pre-1ntegration Complex, PIC)整合前复合物被运输到细胞核里完成第二个催化反应。LEDGF/p75 (Lens Epithelium-derived Growth Factor)是第一个被发现的参与这个过程的细胞因子(Malet，2012)。科学家已经揭示了整合酶催化核心结构域(CXD)和LEDGF/p75整合酶结合结构域(Integrase Binding Domain, IBD)的晶体结构(PDB ID:2B4J)。揭不的晶体结构是整合酶C⑶跟IBD的二聚体。CXD单体的氨基酸168-171和第二个CXD单体的第一个和第三个α螺旋一起跟LEDGF/p75的IBD 二聚体结合在一起{Cherepanov, 2005)。基于报道的晶体结构，2010年，Christ等研究人员针对整合酶和LEDGF/p75的相互作用设计了抑制HIV复制的整合酶抑制剂(LEDGINs)，这一新的抗AIDS药物靶点在近年引起了广泛关注{Christ, 2010)。整合酶和LEDGF/p75的相互作用是完成整合前复合物从细胞质向细胞核运输的关键。因此:阻断整合酶和LEDGF/p75的相互作用，就能阻断整合酶从细胞质像细胞核的定位，从而阻止病毒DNA整合到人类基因组。针对这一靶点进行整合酶抑制剂的研发将为HAART ( Highly Active Antiretroviral Therapy)疗法提供更多的备选药物。
[0003]Tet-Off系统是一个诱导型真核表达系统。通过将外源基因克隆到特定的表达载体 pTRE_2hyg,转染 HeLa Tet-Off Advanced Cells。在培养基中添加 tetracycline(Tc,四环素)或者doxycycline (Dox,多西环素),外源基因被抑制表达。当移除tetracycline或者doxycycline以后，外源基因开始大量表达。Tet-off系统可以按照需要调控基因的表达或者不表达。
[0004]由于HIV-1整合酶是在细胞质里合成的，需要跟LEDGF/p75相互作用，才能完成从细胞质到细胞核的转运。整合酶在细胞质的合成和向细胞核的转运是同时发生的动态过程。虽然整合酶最终会定位到细胞核，但是，一般的表达系统观察到的现象都是:整合酶在细胞核里大量聚集的同时，也会在细胞质里有表达。很难在某个时间点观察到整合酶只出现在细胞质或者细胞核里。这给以整合酶_LEDGF/p75为靶点筛选整合酶抑制剂带来了困难。因为，筛选整合酶抑制剂的时候，药物添加到细胞培养液里的时候，整合酶往往已经开始表达，影响对药物作用结果的判定。另外，整合酶有一定的细胞毒性，过量表达会导致细胞快速死亡。而Tet-off真核表达系统可以操控基因的表达，如果利用Tet-off真核表达系统，经过大量实验，可以发明一种稳定可靠的HIV-1整合酶抑制剂筛选方法，对于整合酶抑制剂的筛选将是极大地进步。至今尚无利用Tet-off真核表达系统针对整合酶-LEDGF/P75靶点高通量筛选整合酶抑制剂的报道。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是:提供一种利用Tet-off诱导表达系统高通量筛选HIV-1整合酶抑制剂的方法，它可以实现整合酶抑制剂的高通量筛选，以克服现有技术的不足。`
[0006]本发明是这样实现的:利用Tet-off诱导表达系统高通量筛选HIV-1整合酶抑制剂的方法，包括以下步骤:
步骤一 JfHIV-1整合酶基因和加强型绿色荧光蛋白基因(EGFP，Enhanced GreenFluorescence Protein)融合克隆进真核表达载体pTRE_2hyg,插入点为多克隆位点，酶切位点BamHI和NotI之间，构建表达载体pTRE-2hyg-EGFP_IN ;并通过双酶切和基因测序，对构建的载体进行鉴定；鉴定正确以后，通过转化大肠杆菌，培养细菌；通过转染级别的质粒提取试剂盒，抽提pTRE-2hyg-EGFP-1N质粒，用于细胞转染实验。
[0007]步骤二:1)取 pTRE-2hyg-EGFP-1N 和 Lipofectamine2000，分别用 Opt1-MEM I 培养基稀释，室温放置5分钟；2)将二者混合、摇匀，室温放置20分钟，备用；3)稀释HeLaTet-Off Advanced Cells到不含抗生素的培养基中，并加到培养板的孔中；4)将步骤2)中的混合液加入细胞培养孔并轻轻摇晃混匀，放置在37°C含有体积百分比浓度为5%的CO2的培养箱培养；5)培养4小时后，弃掉培养液，用含100 μ g/ ml的G418和I μ g/ ml的多西霉素的完全培养基继续培养；6)继续培养8小时后，进行药物筛选；弃掉培养液，用DMEM培养基洗三次，每次3分钟；7)用完全培养基稀释待检药物，加入培养孔，设立不加药物的空白对照；8)培养12小时，用质量百分比为4%的多聚甲醛固定细胞，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察整合酶的定位情况；能抑制整合酶细胞核定位的药物判定为阳性结果；采用Hoechst33342染色指示细胞核。
[0008]Tet-off表达系统诱导表达整合酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白，通过观察药物对融合蛋白核转位的抑制情况，筛选整合酶抑制剂；HeLa Tet-Off Advanced Cells的培养液为DMEM，DMEM培养液中添加体积百分比为10%的FBS，体积百分比为I的链霉素-青霉素(streptomycin - penicillin);在转染前24小时进行细胞传代,使细胞在转染时处于对数生长期；Lipofectamine2000 介导质粒载体导入 HeLa Tet-Off Advanced Cells 细胞。
[0009]由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明利用Tet-off诱导表达系统，针对整合酶_LEDGF/p75靶点，高通量筛选整合酶抑制剂，能稳定可靠的对HIV-1整合酶抑制剂进行筛选，对于整合酶抑制剂的筛选是极大地进步。本发明材料来源广泛，效果显著，重复性好，应用前景好。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1是实施例1应用本发明发现化合物D15具有整合酶核定位抑制作用和抗病毒感染作用的数据组图；
其中，A图是加了 D15化合物的，整合酶的核定位被阻断，整合酶表达以后在细胞核周围累积图是没有加任何药物的，整合酶表达以后定位到细胞核，在细胞核大量累积，细胞核用H0echst33342指示，呈蓝色荧光；(:图显示了 D15的化学结构；D图是利用HIV-1IIIB对人T细胞系C8166进行的急性感染实验，D15化合物能抑制病毒感染以后p24的合成，EC50 是 11.75μΜ ;
图2是实施例2应用本发明发现化合物D6具有整合酶核定位抑制作用和抗病毒感染作用的数据组图；
其中，A图是加了 D6化合物.的，整合酶的核定位被阻断，整合酶表达以后在细胞核周围累积，；Β图是没有加任何药物的，整合酶表达以后定位到细胞核，在细胞核大量累积，细胞核染色以后用红色荧光表示，细胞质颜色很淡；C图显示了 D6的化学结构；D图是利用HIV-1IIIB对人T细胞系C8166进行的急性感染实验，D6化合物能抑制病毒感染以后p24的合成，EC50是4.96 μ M0
[0011]图3是实施例3应用本发明发现化合物D21具有整合酶核定位抑制作用和抗病毒感染作用的数据组图；
其中，A图是加了 D21化合物的，整合酶的核定位被阻断，整合酶表达以后在细胞核周围累积；Β图是没有加任何药物的，整合酶表达以后定位到细胞核，在细胞核大量累积，细胞核染色以后，用红色荧光表示，细胞质颜色很淡。C图显示了 D21的化学结构；D图是利用HIV-1IIIB对人T细胞系C8166进行的急性感染实验，D21化合物能抑制病毒感染以后p24的合成，EC50 是 16.02 μ Mo
【具体实施方式】
[0012]本发明的实施例1:利用Tet-off诱导表达系统高通量筛选HIV-1整合酶抑制剂的方法，包括以下步骤:
步骤一 JfHIV-1整合酶基因和加强型绿色荧光蛋白基因(EGFP，Enhanced GreenFluorescence Protein)融合克隆进真核表达载体pTRE_2hyg,插入点为多克隆位点，酶切位点BamHI和NotI之间，构建表达载体pTRE-2hyg-EGFP_IN ;并通过双酶切和基因测序，对构建的载体进行鉴定；鉴定正确以后，通过转化大肠杆菌，培养细菌；通过转染级别的质粒提取试剂盒，抽提pTRE-2hyg-EGFP-1N质粒，用于细胞转染实验。
[0013]步骤二:以384孔培养板(Corning,黑色)为例(也可以选择96孔板，各种试剂按照体积加倍即可)，I)取 0.05 μ g pTRE-2hyg-EGFP-1N 和 Lipofectamine2000,分别用 7 μ I的Opt1-MEM I培养基稀释，室温放置5min ;2)将二者混合、摇匀，室温放置20min，备用；3)稀释3X104 HeLa Tet-Off Advanced Cells到不含抗生素的培养基中，并加到384孔板的单孔中；4)将步骤2)中的混合液加入细胞培养孔并轻轻摇晃混匀，放置在37°C含体积百分比浓度为5%的CO2培养箱培养；5)培养4小时后，弃掉培养液，用含100 μ g/ ml的G418和I μ g/ ml的多西霉素(doxycycline)的完全培养基继续培养；6)继续培养8小时后,进行药物筛选；弃掉培养液，用DMEM培养基洗三次，每次3分钟；7)用完全培养基稀释待检药物，终体积40μ 1，加入培养孔，设立不加药物的空白对照；8)培养12小时，用质量百分比为4%的多聚甲醛固定细胞，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察整合酶的定位情况；能抑制整合酶细胞核定位的药物判定为阳性结果；采用Hoechst33342染色指示细胞核。
[0014]Tet-off表达系统诱导表达整合酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白，通过观察药物对融合蛋白核转位的抑制情况，筛选整合酶抑制剂；HeLa Tet-Off Advanced Cells的培养液为DMEM，DMEM培养液中添加体积百分比为10%的FBS，体积百分比为1%的链霉素-青霉素(streptomycin - penicillin);在转染前24小时进行细胞传代,使细胞在转染时处于对数生长期；Lipofectamine2000 介导质粒载体导入 HeLa Tet-Off Advanced Cells 细胞。
[0015]筛选后的结果如图1所示:
应用本发明方法对SPECS化合物数据库` (www.specs.net)的化合物进行整合酶抑制剂的筛选。结果化合物D15 (SPECS编号AC-776/41252551)抑制了整合酶的核定位(在2_8 μ M呈现浓度依赖性抑制作用)。EGFP标记的整合酶在细胞核周围累积(图W。而对照组的整合酶主要定位在细胞核，在核区累积(图1B)。D15的结构式见图1C。
[0016]为了进一步验证本方法的有效性，我们对D15的抗HIV感染活性进行了实验。利用HIV-1IIIB对人T细胞系C8166进行的急性感染实验，D15化合物显示出抗HIV感染和复制的活性。能抑制病毒感染以后Ρ24的合成。EC50是11.75μΜ (图1D)。
[0017]本发明的实施例2:筛选方法同实施例1。
[0018]筛选后的结果如图2所示:
应用本发明对SPECS化合物数据库的化合物进行整合酶抑制剂的筛选。结果化合物D6(SPECS编号AE-848/32308063)抑制了整合酶的核定位。EGFP标记的整合酶在细胞核周围累积(图2A)。而对照组的整合酶主要定位在细胞核，在核区累积(图2B)。D6的结构式见图2C0
[0019]为了进一步验证本方法的有效性，我们对D6的抗HIV感染活性进行了实验。利用HIV-1IIIB对人T细胞系C8166进行的急性感染实验，D6化合物显示出抗HIV感染和复制的活性。能抑制病毒感染以后P24的合成。EC50是4.96μΜ (图2D)。
[0020]本发明的实施例3:筛选方法同实施例1。[0021]筛选后的结果如图3所示:
应用本发明对SPECS化合物数据库的化合物进行整合酶抑制剂的筛选。结果化合物D21 (SPECS编号AE-848/36198039)抑制了整合酶的核定位。EGFP标记的整合酶在细胞核周围累积(图3A)。而对照组的整合酶主要定位在细胞核，在核区累积(图3B)。D21的结构式见图3C。
[0022]为了进一步验证本方法的有效性，我们对D21的抗HIV感染活性进行了实验。利用HIV-1IIIB对人T细胞系C8166进行的急性感染实验，D21化合物显示出抗HIV感染和复制的活性。能抑制病毒感染以后P24的合成。EC50是16.02μΜ (图3D)。上述实例证明，应用本发明的技术方案，可成功的从待检化合物中筛选出对HIV-1整合酶核定位有抑制活性的潜在药物；HIV-1IIIB急性感染实验证明，筛选出的化合物(D15，D6，D21)对病毒感染以后，p24的合成有显著的抑制效果。这说明D15，D6，D21具有显著地抗HIV-1病毒感染和复制的作用。至于抑制整合酶核定位和抑制P24的合成之间的详细作用机制，现在研究的还不是很清楚。但是用这些实验来研究药物抗HIV-1感染的效果，却是得到了学术界公认的。因此，上述实例充分说明，.本发明效果显著，重复性好，应用前景好。
【权利要求】
1.一种利用Tet-OfT诱导表达系统高通量筛选HIV-1整合酶抑制剂的方法，其特征在于:包括以下步骤: 步骤一:将HIV-1整合酶基因和加强型绿色荧光蛋白基因融合克隆进真核表达载体pTRE-2hyg，插入点为多克隆位点，酶切位点BamHI和NotI之间，构建表达载体pTRE-2hyg-EGFP-1N ;并通过双酶切和基因测序，对构建的载体进行鉴定；鉴定正确以后，通过转化大肠杆菌，培养细菌；通过转染级别的质粒提取试剂盒，抽提pTRE-2hyg-EGFP-1N质粒，用于细胞转染实验； 步骤二:1)取 pTRE-2hyg-EGFP-1N 和 Lipofectamine2000，分别用 Opt1-MEM I 培养基稀释，室温放置5分钟；2)将二者混合、摇匀，室温放置20分钟，备用；3)稀释HeLa Tet-OffAdvanced Cells到不含抗生素的培养基中，并加到细胞培养板的孔中；4)将步骤2)中的混合液加入细胞培养孔并轻轻摇晃混匀，放置在37°C含有体积百分比浓度为5%的CO2的培养箱培养；5)培养4小时后，弃掉培养液，用含100 μ g/ ml的G418和I μ g/ ml的多西霉素的完全培养基继续培养；6)继续培养8小时后，进行药物筛选；弃掉培养液，用DMEM培养基洗三次，每次3分钟；7)用完全培养基稀释待检药物，加入培养孔，设立不加药物的空白对照；8)培养12小时，用质量百分比为4%的多聚甲醛固定细胞，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察整合酶的定位情况，能抑制整合酶细胞核定位的药物判定为阳性结果；采用Hoechst33342染色指示细胞核。
2.根据权利要求1所述的利用Tet-ofT诱导表达系统高通量筛选HIV-1整合酶抑制剂的方法，其特征在于=Tet-Off表达系统诱导表达整合酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白，通过观察药物对融合蛋白核转位的抑制情况，筛选整合酶抑制剂；HeLa Tet-Off AdvancedCells的培养液为DMEM，DMEM培养液中添加体积百分比为10%的FBS以及体积百分比为1%的链霉素-青霉素；在转染前24小时进行细胞传代，使细胞在转染时处于对数生长期；Lipofectamine2000 介导`质粒载体导入 HeLa Tet-Off Advanced Cells 细胞。
【文档编号】C12N15/62GK103436548SQ201310262415
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年6月27日 优先权日:2013年6月27日
【发明者】谷万港 申请人:遵义医学院