Hiv-1病毒蛋白酶抑制剂耐药突变检测试剂盒及方法

专利名称：Hiv-1病毒蛋白酶抑制剂耐药突变检测试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及检测Hiv-1蛋白酶抑制剂耐药突变的方法及其试剂盒。
背景技术：
一、蛋白酶抑制剂类药物及其作用机制获得性免疫缺陷综合症(AcquiredImmune Deficiency Syndrome, AIDS),又称艾滋病，是世界十大致命疾病之一，其病原体为HIV-1 (Human Immunodeficiency Virus,HIV),HIV属于逆转录病毒，分为HIV-1型和HIV-2型。世界上大部分地区的艾滋病患者是被HIV-1病毒所感染。蛋白酶(Prote ase)对于HIV-1病毒中gag,gag-pol多聚蛋白和翻译后加工、形成病毒核心的结构蛋白以及其他基本的酶类，都是十分必要的。HIV-1病毒进入血液后，病毒表面的包膜蛋白gpl20和OT4 + T淋巴细胞表面的⑶4受体结合，在gp41透膜蛋白的作用下，侵入细胞并脱壳。蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitors，PIs)主要以氢键方式与HIV-1病毒蛋白酶的Asp25、GLy27、Asp29残基相互作用，与蛋白酶活性中的氨基酸残基形成立体相互作用，使病毒蛋白的长链不能裂开，从而抑制蛋白酶的活性，致使HIV在被感染的细胞中产生不成熟的、不具有感染性的病毒颗粒，从而达到使病毒不能正常装配，抑制HIV目的。自1994年肽底物类似物蛋白酶抑制剂问世以来，截至目前，经美国FDA批准上市的此类抑制剂已有10种，其中洛匹那韦(1pinavir/r, LPV)、阿扎那韦(atazanavir/r,ATv)、福沙普利那韦(fosamprenavir/r)和沙奎那韦(saquinavir/r, SQV)用于一线治疗，替拉那韦(fipranavir/r)和大诺那韦(darunavir/r)用于挽救治疗。这类药物能迅速降低血浆中HIV-1病毒载量，疗效突出，蛋白酶抑制剂已成为AIDS联合用药方案的重要组成部分，同时在补救治疗(Salvage therapy)中亦发挥重要作用。二、HIV-1病毒蛋白酶抑制剂耐药类型及机制HIV蛋白酶是一个具有底物结合腔，呈中心对称的同型二聚体，在特定位点剪切大分子多肽前体，释放装配感染性病毒颗粒所必须的结构蛋白和酶。当缺少这些功能蛋白酶时，则只能生成没有感染能力的不成熟病毒颗粒。蛋白酶抑制剂对HIV蛋白酶活性位点均具强亲和力，可抑制酶的催化活性。蛋白酶抑制剂发生耐药的机制是HIV蛋白酶底物结合域或其远端位点的氨基酸置换，直接或间接修改了 PIs与酶接触位点的数量和性质，进而降低PIs与酶的亲和力。迄今已发现与Pls耐药相关的HIV-1突变有60多个，主要的耐药位点有23、30、32、47、48、50、82和84 ;位于边缘的46,54位点；位于酶内部的76,88和90。24、33、53和73位突变经常出现，这些位点对不同的Pls有不同的影响。L231、D30N、M46WL、G48V/M、184V、N88D/S和L90M突变会降低对奈非那韦(nelfinavlr, NFV)的敏感性;I50L、N88S和184V降低对ATV的敏感性；G48V/M、184V和L90M降低对SQV的敏感性；V321、147V/A、154L/M和184V降低对fosamprenavir/r的敏感性；V47A降低对LPV的敏感性；V82L/T与tipranavir/r耐药有关。有些突变可以增加一种或多种PIs的敏感性:I50L可以增加所有PIs的敏感性；I50V和154L可增加tipranavir敏感性；N88S可增加fosamprensvir敏感性；L76V可增加Alrv、SQV和fipranavir的敏感性。PI类耐药突变发生比较慢，多个位点突变才产生完全耐药，交叉耐药比较少见，耐药突变具有药物特异性。例如，D30N位点突变与NFV有关，150V突变与APV有关，G48V和L90M突变与SQV有关，I50L突变与ATV相关。然而，蛋白酶其他位点，如编码区82、84、90位点突变将产生交叉耐药。三、HIV-1的耐药检测方法目前HIV-1病毒耐药性检测有两种方法，即表型检测及基因型检测。表型检测通过用药期间的病毒培养进行，而基因型检测则通过分子生物学方法检测与耐药性相关的病
毒基因突变。基因型检测的方法有直接测序法、异源双链轨迹试验(HTA)、PCR连续酶测定试验、线性探针试验、限制性内切酶酶切试验、引物特异的PCR测定、RNA酶A(RNase A)错配剪切试验等，其中部分技术已有商用系统。在进行基因测序后，将测序结果与标准病毒株比较后可坦福大学耐药数据库(http://hivdb.stanford.edu/)及Los Alamos HIV耐药数据库。通过输入所测得的序列，数据库可自动提供病毒基因变异及耐药结果。目前已有基于测序技术的商品化的试剂盒:TRUEGENE HIV-1Genotyping Kit (Visible Genetics, Inc.Toronto, Canada)和 ViroSeq Kit (Applied Biosystems, Inc.Foster City, CA, USA)。两者都已获得美国FDA批准成为应用于临床常规检测的试剂盒。此外，基于线性探针技术(Line probe assay)的商品化的试剂盒 LiPA(Innogenetics,Ghent,Belgium)也已用于实验室研究。基因型检测的优点是可提供交叉耐药资料，可在样品收集后I 2周得到结果，技术步骤较少，一般情况下费用较便宜。但也存在明显缺点，即不直接提供药物的耐受程度，无法定量，部分变异位点与临床耐受的相关性无法完全确认，分析基因型耐药检测时，需要掌握大量相关知识，如突变与抗病毒药物及其它药物的交叉耐药等，才能对结果进行正确的分析。表型检测通过病毒培养，再通过与无耐药性个体减少HIV复制50%或90%(50%or90%inhibitory concentration, IC50or IC90)所需的药物水平比较来分级耐药程度。表型分析的标准方法是首先从病人体内分离病毒，与待检药物共同培养，然后测定不同药物浓度下外周血单核细胞(PBMC)所产生的p24抗原量，据此得到IC5(I。该法步骤复杂，对操作技术要求高，整个过程至少需6周时间，病毒分离培养过程还有可能发生变异。重组表型方法将病人体内HIV-1的蛋白酶和逆转录酶基因序列进行RT-PCR扩增，扩增产物继而插入pol基因缺失型HIV-1载体以形成重组病毒，因此重组病毒保持了病人体内病毒对药物的敏感性，然后在不同药物，同一药物不同浓度下对重组病毒进行培养，即可测定出对药物的敏感性。表型耐药检测的结果与基因型检测结果通常相同，但有时亦有差异。当耐药HIV株水平较低时，表型检测可发现基因型检测所没有提示的耐药性变异。表型耐药是耐药检测的金标准，直接提供药物的耐受情况，可定量，但缺点也很明显，即技术要求高、费时、费用高昂，因此目前国际上广泛应用于临床的是基因型耐药检测。 基因型和表型检测的进一步应用限制，包括缺乏对现有检测方法的质量保证；检测费用较高；对微小病毒标本不敏感；如果存在耐药病毒，而病毒量又低于20%，现有检测方法很可能检测不到。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、快速、成本低的检测HIV-1病毒蛋白酶抑制剂耐药突变的方法及其试剂盒。为了解决上述技术问题，本发明提供一种检测人类免疫缺陷病毒蛋白酶基因耐药突变的特异性探针:包括以下11类特异性探针中的至少一类:检测蛋白酶基因D30N突变的特异性探针，为SEQ ID NO:1 6中的任意一种或任意一种的互补序列；检测蛋白酶基因V32I突变的特异性探针，为SEQ ID N0:7 14中的任意一种或任意一种的互补序列；检测蛋白酶基因M46I和M46L突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 15 31中的任意一种或任意一种的互补序列；检测蛋白酶基因I47V和I47A突变的特异性探针，为SEQ ID NO:32 40中的任意一种或任意一种的互补序列；检测蛋白酶基因G48V突变的特异性探针，为SEQ ID NO:41 46中的任意一种或任意一种的互补序列；检测蛋白酶基因I50V突变的特异性探针，为SEQ ID NO:47 52中的任意一种或任意一种的互补序列；检测蛋白酶 基因I54V突变的特异性探针，为SEQ ID N0:53 61中的任意一种或任意一种的互补序列；检测蛋白酶基因V82A、V82F、V82T和V82S突变的特异性探针，为SEQ ID N0:62 81中的任意一种或任意一种的互补序列；检测蛋白酶基因I84V突变的特异性探针，为SEQ ID NO:82 87中的任意一种或任意一种的互补序列；检测蛋白酶基因N88D突变的特异性探针，为SEQ ID NO:88 93中的任意一种或任意一种的互补序列；检测蛋白酶基因L90M突变的特异性探针，为SEQ ID NO:94 99中的任意一种或任意一种的互补序列。作为本发明的检测人类免疫缺陷病毒蛋白酶基因耐药突变的特异性探针的改进:检测蛋白酶基因D30N突变的特异性探针中，SEQ ID NO:1 3中的任意一种针对第30位氨基酸残基为D (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID N0:4 6中的任意一种针对第30位氨基酸残基为N (耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因；检测蛋白酶基因V32I突变的特异性探针中，SEQ ID N0:7 9中的任意一种针对第32位氨基酸残基为V (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 10 14中的任意一种针对第32位氨基酸残基为I (耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因；所述检测蛋白酶基因M46I和M46L突变的特异性探针中，SEQ ID NO: 15 17中的任意一种针对第46位氨基酸残基为M (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 18 20中的任意一种针对第46位氨基酸残基为I (耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ IDNO:21 31中的任意一种是针对第46位氨基酸残基为L (耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因；所述检测蛋白酶基因I47V和I47A突变的特异性探针中，SEQ ID N0:32 34中的任意一种是针对第47位氨基酸残基为I (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO:35 37中的任意一种是针对第47位氨基酸残基为A (耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQID NO:38 40中的任意一种是针对第47位氨基酸残基为V (耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因；所述检测蛋白酶基因G48V突变的特异性探针中，SEQ ID NO:41 43中的任意一种是针对第48位氨基酸残基为G (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO:44 46中的任意一种是针对第48位氨基酸残基为V (耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因；所述检测蛋白酶基因I50V突变的特异性探针中，SEQ ID NO:47 49中的任意一种是针对第50位氨基酸残基为I (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 50 52中的任意一种是针对第50位氨基酸残基为V (耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因；所述检测蛋白酶基因I54V突变的特异性探针中，SEQ ID NO: 53 55中的任意一种是针对第54位氨基酸残基为I (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 56 61中的任意一种是针对第54位氨基酸残基为V (耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因；所述检测蛋白酶基因V82A、V 82F、V82T和V82S突变的特异性探针中，SEQ IDNO:62 66中的任意一种是针对第82位氨基酸残基为V (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO:67 69中的任意一种是针对第82位氨基酸残基为A (耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO:70 75中的任意一种是针对第82位氨基酸残基为F (耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO:76 78中的任意一种是针对第82位氨基酸残基为T (耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 79 81中的任意一种是针对第82位氨基酸残基为S (耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因；所述检测蛋白酶基因I84V突变的特异性探针中，SEQ ID NO:82 84中的任意一种是针对第84位氨基酸残基为I (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO:85 87中的任意一种是针对第84位氨基酸残基为V (耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因；所述检测蛋白酶基因N88D突变的特异性探针中，SEQ ID NO:88 90中的任意一种是针对第88位氨基酸残基为N (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID N0:91 93中的任意一种是针对第88位氨基酸残基为D (耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因；所述检测蛋白酶基因L90M突变的特异性探针中，SEQ ID NO:94 96中的任意一种是针对第90位氨基酸残基为L (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO:97 99中的任意一种是针对第90位氨基酸残基为M (耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因。本发明还提供了一种利用检测人类免疫缺陷病毒蛋白酶基因耐药突变的特异性探针制备而成的HIV-1病毒蛋白酶抑制剂耐药突变检测试剂盒:除了包括检测蛋白酶基因D30N突变的特异性探针、检测蛋白酶基因V32I突变的特异性探针、检测蛋白酶基因M46I和M46L突变的特异性探针、检测蛋白酶基因I47V和I47A突变的特异性探针、检测蛋白酶基因G48V突变的特异性探针、检测蛋白酶基因I50V突变的特异性探针、检测蛋白酶基因I54V突变的特异性探针、检测蛋白酶基因V82A、V82F、V82T和V82S突变的特异性探针、检测蛋白酶基因I84V突变的特异性探针、检测蛋白酶基因N88D突变的特异性探针、检测蛋白酶基因L90M突变的特异性探针外；还包括表面化学质控探针、杂交阳性探针以及HIV-1蛋白酶基因内标探针。作为本发明的HIV-1病毒蛋白酶抑制剂耐药突变检测试剂盒的改进:HIV-1蛋白酶基因内标探针、表面化学质控探针、杂交阳性探针的长度均为15-35个核苷酸；所述探针的5’端均连接上10-40个寡聚dT。备注说明:上述检测HIV-1病毒蛋白酶抑制剂耐药突变的特异性探针也均满足以下特征:长度均为15-35个核苷酸；所述探针的5’端均连接上10-40个寡聚dT。作为本发明的HIV-1病毒蛋白酶抑制剂耐药突变检测试剂盒的进一步改进:HIV-1蛋白酶基因内标探针为SEQ ID NO: 100所述的核苷酸序列；表面化学质控探针PBQC-003 为:HEX_poly (T) 12-gcaagacaagtggaagtgtg_NH2 ；杂交阳性质控探针PBQC-002 为:NH2_poly ⑴ 25 - GCAACCACCACCGGAGG。作为本发明的HIV-1病毒蛋白酶抑制剂耐药突变检测试剂盒的进一步改进:探针固定于载体上；载体为硅片、用各种功能基团衍生的膜，或用各种功能基团修饰的玻片。作为本发明的HIV-1病毒蛋白酶抑制剂耐药突变检测试剂盒的进一步改进:载体为表面带有醛基基团修饰的玻片。备注说明:试 剂盒还包括进行PCR扩增和分子杂交反应的反应液，和50%的二甲亚砜(DMSO)作为点样和杂交反应的空白对照。本发明还同时提供了一种检测人类免疫缺陷病毒蛋白酶抑制剂耐药突变的方法，包括以下步骤:I)、利用所述试剂盒扩增待测的人类免疫缺陷病毒基因组中的蛋白酶基因区段；2)、将步骤I)得到的扩增产物与所述试剂盒中的HIV-1病毒蛋白酶抑制剂耐药突变特异性探针进行杂交，确定待测人类免疫缺陷病毒所含的耐药突变类型。本发明的检测人类免疫缺陷病毒蛋白酶抑制剂耐药突变的方法及其试剂盒，包括扩增HIV-1病毒蛋白酶基因区段的套式不对称RT-PCR扩增方法，以及与上述扩增的PCR产物进行杂交，检测HIV-1蛋白酶基因耐药突变的特异性探针；所述探针的碱基序列如SEQIDNO:1-100 所示。本发明所述的待测人类免疫缺陷病毒耐药突变为PIs耐药突变(即蛋白酶抑制剂耐药突变)。耐药突变位于人类免疫缺陷病毒蛋白酶基因区段内。本发明所述的检测HIV-1蛋白酶基因耐药突变的特异性探针、HIV-1蛋白酶基因内标探针的序列可以是如序列SEQ ID NO: 1-100所示，也可以是如序列SEQ ID NO: 1-100所示序列的互补序列。在本发明中:当采用的HIV-1对蛋白酶抑制剂耐药突变检测探针和内标探针序列为SEQ ID N0:l-100时，内套扩增引物的反向引物被荧光标记；当采用的HIV-1对蛋白酶抑制剂耐药突变检测探针和内标探针序列为SEQ ID NO: 1-100所示序列的互补序列时，内套扩增引物的正向引物被荧光标记。在本发明中:PCR扩增为套式不对称RT-PCR，其中用外套引物进行的PCR为RT-PCR，取其部分扩增产物作为内套引物扩增的模板，用内套引物进行的PCR扩增为不对称PCR。扩增HIV-1病毒蛋白酶基因区段的内套引物对，其下游引物的5’端标记有荧光分子，且其5’端序列包含一段与HIV-1基因组及人类基因组序列无关的序列，使上下游引物的Tm值相差至少8-15° C。用内套引物进行的不对称PCR扩增分为两个阶段，每个阶段的每个温度循环由变性、退火和延伸三个步骤组成，包括10-30个温度循环；其中第一阶段的退火温度为45-55° C ;第二阶段的退火温度为55-65° C。用内套引物进行的不对称PCR扩增，内套引物的上下游引物浓度比例为1:2至1:100之间。杂交包括以下步骤:1)将内套引物PCR扩增产物与杂交液，及杂交阳性对照探针的靶标混合，高温变性并速冷以使双链PCR产物解链为单链；2)上述变性后的杂交混合物与固定于载体上的探针在合适的温度下杂交一定时间；3)在洗液中清洗，去除未与载体上的探针杂交的PCR产物、盐离子等杂交液成分。在本发明中:HIV-1病毒蛋白酶抑制剂耐药突变是指HIV-1病毒蛋白酶基因内某个(或多个)核苷酸的突变，进一步改变了其氨基酸类型，导致含有该突变的HIV-1病毒对蛋白酶抑制剂类产生耐药的突变。HIV-1基因组中与耐药相关的蛋白酶基因区段是指包含待检的蛋白酶抑制剂耐药突变的区段，具体的是指编码第1到第99个氨基酸的基因片段。待检的蛋白酶抑制剂耐药突变是指针对HIV-1病毒蛋白酶11个氨基酸位点的16种突变类型，具体是指以下突变类型:DD30N (即蛋白酶基因的第30位氨基酸残基由D突变为N);2)V32I (即蛋白酶基因的第32位氨基酸残基由V突变为I);3)M46I (即蛋白酶基因的第46位氨基酸残基由M突变为I)、M46L (即蛋白酶基因的第46位氨基酸残基由M突变为L)；4) I47V (即蛋白酶基因的第47位氨基酸残基由I突变为V)、I47A (即蛋白酶基因的第47位氨基酸残基由I突变为A)；5)G48V (即蛋白酶基因的第48位氨基酸残基由G突变为V);6) I50V (即蛋白酶基因的第50位氨基酸残基由I突变为V)；7) I54V (即蛋白酶基因的第54位氨基酸残基由I突变为V)；8)V82A (即蛋白酶基因的第82位氨基酸残基由V突变为A)、V82F (即蛋白酶基因的第82位氨基酸残基由V突变为F)、V82T (即蛋白酶基因的第82位氨基酸残基由V突变为T)、V82S (即蛋白酶基因的第82位氨基酸残基由V突变为S)；9) I84V (即蛋白酶基因的第84位氨基酸残基由I突变为V);10)N88D (即蛋白酶基因的第88位氨基酸残基由N突变为D);1DL90M (即蛋白酶基因的第90位氨基酸残基由L突变为M)。所述扩增HIV-1病毒基因组中与对蛋白酶抑制剂耐药相关的蛋白酶基因区段的引物分为外套正向引物和外套反向引物，以及内套正向引物和内套反向引物，大小均为15-50个核苷酸,优选为15-45个核苷酸；所述的内套反向引物5’ -末端连接上加尾序列后，再被荧光标记。所述的外套引物可扩增HIV-1病毒基因组中长度为1300bps的片段，包含HIV-1病毒蛋白酶基因上游的132bps片段、所述的蛋白酶基因编码第I到第99个氨基酸的基因片段和逆转录酶基因编码第I到第290个氨基酸的基因片段。所述的内套引物可扩增HIV-1病毒基因组中长度为508bp的片段，包含蛋白酶基因的全部编码区序列。所述试剂盒还包括检测HIV-1病毒蛋白酶抑制剂耐药突变的特异性探针、内标探针、表面化学质控探针、杂交阳性探针以及所述杂交阳性探针的靶标。所述探针的大小均为12-24个核苷酸，优选为15-20个核苷酸；所述探针的5’-末端连接上10-40个寡聚dT，优选连接上20-30个寡聚dT。所述检测HIV-1病毒蛋白酶抑制剂耐药突变的特异性探针为单链DNA，包括序列表中序列I到序列100所示序列，以及序列表中序列I到序列100所示序列的互补序列，优选为序列表中序列I到序列100所示序列。当采用的HIV-1耐药突变检测探针为序列表中序列I到序列100所示序列时，内套扩增引物的反向引物5’-末端连接上加尾序列后，再被荧光标记；当采用的HIV-1耐药突变检测探针为序列表中序列I到序列100所示序列的互补序列时，内套扩增引物的正向引物5’ -末端连接上加尾序列后，再被荧光标记。所述的检测蛋白酶基因D30N突变的特异性探针具有序列表中序列I到序列6的核苷酸序列，其中序列I到序列3是针对第30位氨基酸残基为D (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，序列4到序列6是针对第41位氨基酸残基为N (耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因。所述的检测蛋白酶基因V32I突变的特异性探针具有序列表中序列7到序列14的核苷酸序列，其中序列7到序列9是针对第32位氨基酸残基为V (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，序列10到 序列14是针对第32位氨基酸残基为I (耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因。所述的检测蛋白酶基因M46I和M46L突变的特异性探针具有序列表中序列15到序列31的核苷酸序列，其中序列15到序列17是针对第46位氨基酸残基为M (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，序列18到序列20是针对第46位氨基酸残基为1(耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因，序列21到序列31是针对第46位氨基酸残基为L (耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因。所述的检测蛋白酶基因I47V和I47A突变的特异性探针具有序列表中序列32到序列40的核苷酸序列，其中序列32到序列34是针对第47位氨基酸残基为I (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，序列35到序列37是针对第47位氨基酸残基为A(耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因，序列38到序列40是针对第47位氨基酸残基为V (耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因。所述的检测蛋白酶基因G48V突变的特异性探针具有序列表中序列41到序列46的核苷酸序列，其中序列41到序列43是针对第48位氨基酸残基为G (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，序列44到序列46是针对第48位氨基酸残基为V (耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因。所述的检测蛋白酶基因I50V突变的特异性探针具有序列表中序列47到序列52的核苷酸序列，其中序列47到序列49是针对第50位氨基酸残基为I (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，序列50到序列52是针对第50位氨基酸残基为V (耐药突变型)的HIV-1蛋白
酶基因。所述的检测蛋白酶基因I54V突变的特异性探针具有序列表中序列53到序列61的核苷酸序列，其中序列53到序列55是针对第54位氨基酸残基为I (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，序列56到序列61是针对第54位氨基酸残基为V (耐药突变型)的HIV-1蛋白
酶基因。所述的检测蛋白酶基因V82A、V82F、V82T和V82S突变的特异性探针具有序列表中序列62到序列81的核苷酸序列，其中序列62到序列66是针对第82位氨基酸残基为V(野生型)的HIV-1蛋白酶基因，序列67到序列69是针对第82位氨基酸残基为A (耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因，序列70到序列75是针对第82位氨基酸残基为F (耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因，序列76到序列78是针对第82位氨基酸残基为T (耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因，序列79到序列81是针对第82位氨基酸残基为S (耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因。所述的检测蛋白酶基因I84V突变的特异性探针具有序列表中序列82到序列87的核苷酸序列，其中序列82到序列84是针对第84位氨基酸残基为I (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，序列85到序列87是针对第84位氨基酸残基为V (耐药突变型)的HIV-1蛋白酶基因。所述的检测蛋白酶基因N88D突变的特异性探针具有序列表中序列88到序列93的核苷酸序列，其中序列88到序列90 是针对第88位氨基酸残基为N (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，序列91到序列93是针对第88位氨基酸残基为D (耐药突变型)的HIV-1蛋白
酶基因。所述的检测蛋白酶基因L90M突变的特异性探针具有序列表中序列94到序列99的核苷酸序列，其中序列94到序列96是针对第90位氨基酸残基为L (野生型)的HIV-1蛋白酶基因，序列97到序列99是针对第90位氨基酸残基为M (耐药突变型)的HIV-1蛋白
酶基因。所述的内标探针具有序列表中序列100的核昔酸序列，是针对蛋白酶基因扩增片段内的保守序列，无论是野生型Hiv-1病毒，还是包含上述任何耐药突变的HIV-1病毒均可与该探针杂交。所述的表面化学质控探针(PBQC-003)主要用于芯片制备过程中监控芯片表面化学性质，检测探针固定效率，其序列可以是与待检测序列无同源性的任何序列，长度介于20-70个寡核苷酸，其5’端被突光分子标记；所述的杂交阳性质控探针(PBQC-002)主要用于监控芯片杂交过程，其序列可以是与待检测序列无同源性的任何序列，长度介于20-70个寡核苷酸；所述的杂交阳性对照探针的靶标(PBQC-001)是与所述的杂交阳性质控探针(PBQC-002)序列完全互补的寡核苷酸，其5’端被突光分子标记。上述探针固定于载体上。所述载体可为硅片、用各种功能基团衍生的膜，或用各种功能基团修饰的玻片，优选为醛基基团修饰的玻片。所述的试剂盒还包括进行PCR反应和杂交反应所需的反应液，和50%的二甲亚砜(DMSO)作为点样和杂交反应的空白对照。所述的杂交反应液中含有所述的杂交阳性对照探针的靶标。本发明的第二个目的是提供一种利用上述试剂盒进行HIV-1病毒蛋白酶抑制剂耐药突变检测的方法，包括以下步骤:I)利用所述试剂盒提供的PCR扩增方法进行PCR反应，扩增待测的HIV-1基因组中的蛋白酶基因区段；2)将步骤I)得到的扩增产物与所述试剂盒中固定在载体上的HIV-1病毒蛋白酶抑制剂耐药突变特异性探针进行杂交，确定待测HIV-1所含的耐药突变类型。所述PCR为套式不对称RT-PCR，其中用外套引物进行的PCR为RT-PCR，取其部分扩增产物作为内套引物扩增的模板，用内套引物进行的PCR扩增为不对称PCR。所述用外套引物进行的RT-PCR包含两个阶段:第一阶段为逆转录阶段，与常规逆转录方法相同。第二阶 段为PCR扩增阶段，在灭活逆转录酶后，在外套引物存在的条件下进行PCR扩增。扩增温度循环由变性、退火和延伸三个步骤组成，包括10-40个温度循环，优选为30个循环。所述的第二阶段退火温度为40-50° C，优选为42° C。所述用内套引物进行的不对称PCR扩增包含两个阶段，每个阶段的每个温度循环由变性、退火和延伸三个步骤组成，包括10-30个温度循环，优选为20个温度循环。其中第一阶段的退火温度为45-50° C，优选为48° C ;第二阶段的退火温度为55-65° C，优选为58。Co所述的不对称PCR扩增是指通过调整内套引物中上游引物与下游引物的浓度比例，使上游引物的量低于下游引物，以及在扩增的第二阶段提高退火温度(如上文所述)，使得上游引物在该退火温度下无法与模板复性，而下游引物由于Tm值高于上游引物，在该退火温度下仍可正常与模板复性并进一步延伸，最终实现PCR扩增产物中两条链的产量不同的不对称扩增效果，其中能够与HIV-1耐药突变特异性探针杂交的单链数量高于该链的互补链。所述的内套引物中的上游引物与下游引物的浓度比例可以是1:2至1: 100之间的任意比例，优选为1:5。所述的上游引物的Tm值高于下游引物，其差值可以是8-15° C之间的任意值，优选为10° C。所述的杂交包括以下步骤:I)将内套引物PCR扩增产物与杂交液，及杂交阳性对照探针的靶标混合，高温变性并速冷以使双链PCR产物解链为单链；2)上述变性后的杂交混合物与固定于载体上的探针在合适的温度下杂交一定时间；3)在洗液中清洗，去除未与载体上的探针杂交的PCR产物、盐离子等杂交液成分。所述的杂交液包含杂交所需的盐溶液、表面活性剂，以及用于控制杂交严谨度的甲酰胺。所述的盐溶液可以是1-10XSSC，或1-10XSSPE，优选为3XSSC或3XSSPE。所述的用于控制杂交严谨度的甲酰胺浓度范围可以是5%-30%，优选为20%。所述的合适的杂交温度范围可以介于30° C_42° C，优选为32° C。所述的杂交时间可以介于15分钟至24小时之间，优选为2小时。
本发明所述的检测HIV-1病毒蛋白酶抑制剂耐药突变的方法及其试剂盒具有集成化程度高、灵敏度高、特异性好，检测结果稳定可靠，成本低的特点，可广泛用于HIV-1病毒蛋白酶抑制剂耐药突变发生、发展的流行病学监测，为合理用药，有效降低和延缓耐药的发生提供有效工具。


下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细说明。图1为检测HIV-1蛋白酶抑制剂耐药突变的探针点阵排布图；图2为检测HIV-1蛋白酶抑制剂单位点耐药突变的杂交反应结果图；图3为检测HIV-1逆转录酶基因多位点耐药突变的杂交反应结果图；图4为检测全血、血浆以及核酸样品中HIV-1蛋白酶抑制剂耐药突变的杂交反应结果图。
具体实施例方式实施例1:利用本 发明检测HIV-1病毒蛋白酶抑制剂单位点耐药突变本实施例检测了本发明所涉及的所有HIV-1病毒蛋白酶抑制剂耐药突变类型，以及不包含任何突变的野生型HIV-1病毒蛋白酶基因类型。1.寡核苷酸引物和探针的制备表I和表2显示了本发明检测HIV-1病毒蛋白酶抑制剂耐药突变所用的引物和探针的序列，均委托上海英骏生物技术有限公司合成。表I HIV-1病毒蛋白酶基因区段扩增引物
引物编号I引物序列(5’ -3’)
PMV-001 gagagcttcaggtctgggg PMV-002 CTGTTAGTGCTTTGGTTCCTCT PMV-003 gaagcaggagccgatagaca
PMV-OI7 TAMRA-TCACTTGCTTCCGTTGAGGTGGYTTYARTKTTACTGGTACAG表2 HIV-1病毒蛋白酶抑制剂耐药突变检测探针
权利要求
1.检测人类免疫缺陷病毒蛋白酶基因耐药突变的特异性探针，其特征是: 包括以下11类特异性探针中的至少一类: 检测蛋白酶基因D30N突变的特异性探针，为SEQ ID NO:1飞中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测蛋白酶基因V32I突变的特异性探针，为SEQ ID NO:7 14中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测蛋白酶基因M46I和M46L突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 15 31中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测蛋白酶基因I47V和I47A突变的特异性探针，为SEQ ID NO:32^40中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测蛋白酶基因G48V突变的特异性探针，为SEQ ID NO:41 46中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测蛋白酶基因I50V突变的特异性探针，为SEQ ID NO:47 52中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测蛋白酶基因I54V突变的特异性探针，为SEQ ID NO: 53 61中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测蛋白酶基因V82A、V82F、V82T和V82S突变的特异性探针，为SEQ ID NO:62^81中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测蛋白酶基因I84V突变的特异性探针，为SEQ ID NO:82 87中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测蛋白酶基因N88D突变的特异性探针，为SEQ ID NO:88 93中的任意一种或任意一种的互补序列； 检测蛋白酶基因L90M突变的特异性探针，为SEQ ID NO:94 99中的任意一种或任意一种的互补序列。
2.根据权利要求1所述的检测人类免疫缺陷病毒蛋白酶基因耐药突变的特异性探针，其特征是: 所述检测蛋白酶基因D30N突变的特异性探针中，SEQ ID NO: f 3中的任意一种针对第30位氨基酸残基为D的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 4 6中的任意一种针对第30位氨基酸残基为N的HIV-1蛋白酶基因； 所述检测蛋白酶基因V32I突变的特异性探针中，SEQ ID NO: 7、中的任意一种针对第32位氨基酸残基为V的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 1(Γ 4中的任意一种针对第32位氨基酸残基为I的HIV-1蛋白酶基因； 所述检测蛋白酶基因Μ46Ι和M46L突变的特异性探针中，SEQ ID NO: 15 17中的任意一种针对第46位氨基酸残基为M的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 18 20中的任意一种针对第46位氨基酸残基为I的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID ΝΟ:2Γ31中的任意一种是针对第46位氨基酸残基为L的HIV-1蛋白酶基因； 所述检测蛋白酶基因I47V和Ι47Α突变的特异性探针中，SEQ ID NO:32^34中的任意一种是针对第47位氨基酸残基为I的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 35 37中的任意一种是针对第47位氨基酸残基为A的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 38 40中的任意一种是针对第47位氨基酸残基为V的HIV-1蛋白酶基因； 所述检测蛋白酶基因G48V突变的特异性探针中，SEQ ID NO:41 43中的任意一种是针对第48位氨基酸残基为G的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 44 46中的任意一种是针对第48位氨基酸残基为V的HIV-1蛋白酶基因； 所述检测蛋白酶基因I50V突变的特异性探针中，SEQ ID NO:47 49中的任意一种是针对第50位氨基酸残基为I的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO:50^52中的任意一种是针对第50位氨基酸残基为V的HIV-1蛋白酶基因； 所述检测蛋白酶基因I54V突变的特异性探针中，SEQ ID NO: 53 55中的任意一种是针对第54位氨基酸残基为I的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO:56^61中的任意一种是针对第54位氨基酸残基为V的HIV-1蛋白酶基因； 所述检测蛋白酶基因V82A、V82F、V82T和V82S突变的特异性探针中，SEQ ID NO:62^66中的任意一种是针对第82位氨基酸残基为V的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 67 69中的任意一种是针对第82 位氨基酸残基为A的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO:70^75中的任意一种是针对第82位氨基酸残基为F的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 76 78中的任意一种是针对第82位氨基酸残基为T的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 701中的任意一种是针对第82位氨基酸残基为S的HIV-1蛋白酶基因； 所述检测蛋白酶基因I84V突变的特异性探针中，SEQ ID NO:82 84中的任意一种是针对第84位氨基酸残基为I的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO:85^87中的任意一种是针对第84位氨基酸残基为V的HIV-1蛋白酶基因； 所述检测蛋白酶基因N88D突变的特异性探针中，SEQ ID NO:88 90中的任意一种是针对第88位氨基酸残基为N的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID Ν0:9Γ93中的任意一种是针对第88位氨基酸残基为D的HIV-1蛋白酶基因； 所述检测蛋白酶基因L90M突变的特异性探针中，SEQ ID Ν0:94 96中的任意一种是针对第90位氨基酸残基为L的HIV-1蛋白酶基因，SEQ ID NO: 97 99中的任意一种是针对第90位氨基酸残基为M的HIV-1蛋白酶基因。
3.利用如权利要求1或2所述的检测人类免疫缺陷病毒蛋白酶基因耐药突变的特异性探针制备而成的HIV-1病毒蛋白酶抑制剂耐药突变检测试剂盒，其特征是: 除了包括检测蛋白酶基因D30N突变的特异性探针、检测蛋白酶基因V32I突变的特异性探针、检测蛋白酶基因Μ46Ι和M46L突变的特异性探针、检测蛋白酶基因I47V和Ι47Α突变的特异性探针、检测蛋白酶基因G48V突变的特异性探针、检测蛋白酶基因I50V突变的特异性探针、检测蛋白酶基因I54V突变的特异性探针、检测蛋白酶基因V82A、V82F、V82T和V82S突变的特异性探针、检测蛋白酶基因I84V突变的特异性探针、检测蛋白酶基因N88D突变的特异性探针、检测蛋白酶基因L90M突变的特异性探针外； 还包括表面化学质控探针、杂交阳性探针、HIV-1蛋白酶基因内标探针。
4.根据权利要求3所述的HIV-1病毒蛋白酶抑制剂耐药突变检测试剂盒，其特征是: HIV-1蛋白酶基因内标探针、表面化学质控探针、杂交阳性探针的长度均为15-35个核苷酸；所述探针的5’端均连接上10-40个寡聚dT。
5.根据权利要求3或4所述的HIV-1病毒蛋白酶抑制剂耐药突变检测试剂盒，其特征是:所述HIV-1蛋白酶基因内标探针为SEQ ID NO: 100所述的核苷酸序列或其互补序列； 所述表面化学质控探针 PBQC-003 为:HEX- poly (T) 12-gcaagacaagtggaagtgtg-NH2 ； 所述杂交阳性质控探针 PBQC-002 为:NH2-poly ⑴ 25 - GCAACCACCACCGGAGG。
6.根据权利要求3、4或5所述的HIV-1病毒蛋白酶抑制剂耐药突变检测试剂盒，其特征是: 用于固定探针的载体为硅片、用各种功能基团衍生的膜，或用各种功能基团修饰的玻片。
7.根据权利要求6所述的HIV-1病毒蛋白酶抑制剂耐药突变检测试剂盒，其特征是:所述载体为表面带有醛基基团修饰的玻片。
8.检测人类免疫缺陷病毒蛋白酶抑制剂耐药突变的方法，其特征是:包括以下步骤: 1)、利用所述试剂盒扩增待测的人类免疫缺陷病毒基因组中的蛋白酶基因区段； 2)、将步骤I)得到的扩增产物与所述试剂盒中的HIV-1病毒蛋白酶抑制剂耐药突变特异性探针进行杂交，确定待测人类免疫缺陷病毒所含的耐药突变类型。
9.根据权利要求8所述的检测人类免疫缺陷病毒蛋白酶抑制剂耐药突变的方法，其特征是: PCR扩增为套式不对称RT-PCR，其中用外套引物进行的PCR为RT-PCR，取扩增产物作为内套引物扩增的模板，用内套引物进行的PCR扩增为不对称PCR。
10.根据权利要求9所述的检测人类免疫缺陷病毒蛋白酶抑制剂耐药突变的方法，其特征是: 扩增HIV-1病毒蛋白酶基因区段的内套引物对，其下游引物的5’端标记有荧光分子，且其5’端序列包含一段与HIV-1基因组及人类基因组序列无关的序列，使上下游引物的Tm值相差至少8-15° C。
全文摘要
本发明涉及一种检测HIV-1蛋白酶抑制剂耐药突变的方法及其试剂盒。具体而言，本发明还公开了检测人类免疫缺陷病毒蛋白酶基因耐药突变的探针，包括检测蛋白酶基因D30N突变的探针、检测蛋白酶基因V32I突变的探针、检测蛋白酶基因M46I和M46L突变的探针、检测蛋白酶基因I47V和I47A突变的探针、检测蛋白酶基因G48V突变的探针、检测蛋白酶基因I50V突变的探针、检测蛋白酶基因I54V突变的探针、检测蛋白酶基因V82A、V82F、V82T和V82S突变的探针、检测蛋白酶基因I84V突变的探针、检测蛋白酶基因N88D突变的探针、检测蛋白酶基因L90M突变的探针。
文档编号C12N15/11GK103215348SQ20131008911
公开日2013年7月24日 申请日期2013年3月19日 优先权日2013年3月19日
发明者张琼, 李兰娟, 项春生, 吴南屏 申请人:浙江大学